專利名稱：：鑒定hbv基因型的特異性探針及使用其檢測hbv基因型的方法、試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種特異性探針，及通過特異性組合探針，利用熒光PCR多通道技術，鑒定HBV基因型的方法、試劑盒。
背景技術：
：多年來，國內外眾多研究人員對全球各地HBV進行了全基因組測序，并通過序列分析研究，己經明確HBV具有8種基因型(A-H)。據2008年WHO最新資料顯示，全球約20億人感染HBV，其中近4億為慢性肝炎，每年死亡人數約60萬。2/3數量處于亞洲地區，其中中國地區HBV以B、C型或BC混合型為主，也有少部分A、D型。HBV不僅具有地域分布的特點，同時對疾病的發生和發展有影響。目前，通過臨床橫向比較、對照分析以及預后研究，證實C基因型較B基因型更容易導致嚴重肝炎。而且，從HBeAg到抗HBe的血清轉化狀況也有所差異。B基因型在precore終止子突變機率要顯著高于C基因型，抗HBe的血清轉化更早出現，近來有報道，不同基因型的HBV導致肝癌的機率也有不同。因此，對HBV進行基因分型不僅有助于對病毒進化變異研究，流行病學調査有積極意義，也對疾病治療與轉歸的評估，以及未來制定治療方案和策略有實用價值。目前，對HBV基因分型的實驗室方法主要包括有l)PCR產物限制性片段長度多態性分析，相對簡單，但是缺點一是可能酶切不完整，二是變異干擾大，譜型的一致性不好，影響結果判定。2)PCR微流芯片技術檢測HBV基因分型，多態芯片酶聯分析基因分型等等，但是上述方法，技術復雜，實驗流程長。3)Microarmy芯片雖然可以高通量、較為準確地檢測分型，但是對于HBV分型來講，結構體系就太大了，不經濟，也沒必要。4)全基因組測序，雖然能很好分型，但是機器昂貴，成本高，技術要求高，實用性不佳，普及受限。相比較來看，實時熒光PCR更適合HBV基因分型。實時熒光PCR由美國應用生物系統公司(AppliedBiosystems)于1996年發明，通過檢測每個循環PCR產物的總累積量，借助熒光標志(主要是水解探針)，來達到很好的定量結果。由于該技術具有很強的特異性和靈敏度、有效解決傳統PCR的污染問題、自動化程度高等特點，因此，被廣泛用于臨床微生物的檢測。隨著技術發展，包括ABI、Bio-rad、Roche等多家公司都相繼生產了多通道/多色熒光PCR檢測儀，可以對一個反應體系中，不同波長的熒光進行區分。這樣就可以使得不同型間特異性探針于一個體系中，鑒定出目標模板的基因型。利用多通道熒光PCR鑒定HBV基因型的關鍵，就是選取合適的特異性位點構建探針。由于探針長度有限(一般25-35bp為佳)，而且HBV基因組的變異性很大，如果不能很好地選擇有意義的型間特異性位點，或選擇的特異性位點數量不足，或特異性位點的在探針中所處位置不當，均不能有效分型。有類似發明就存在這樣的缺陷，而不能很好地達到鑒定的目的。在HBV基因組上有一個最長的基因重疊區，就是大S區域，任何一個位置的突變會同時影響兩個基因的編碼，因此，產生致死性突變的機率很大，而這些突變就很難被保留下來，也是說，該區域較其它區域相對保守，所以，該區域的特異性位點用于分型就更有意義。
發明內容本發明的目的在于克服現有的上述技術之不足，研究出一種采用型間高特異性組合探針，利用多通道熒光PCR技術，快速、有效地鑒定HBV基因型的方法。本發明所述鑒定HBV基因型的特異性探針，其具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列或其互補核苷酸序列中的至少一種(包括潛在點突變造成的個別堿基差異的這些序列)。本發明的優選實施例中，上述的鑒定HBV基因型的特異性探針具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列。本發明的優選實施例中，上述鑒定HBV基因型的特異性探針來自于HBV基因組中的大S重疊基因區域序列，位于SEQIDNO:9-10所示引物的擴增區域之中。本發明還提供一種鑒定HBV基因型的方法，其主要包括步驟a.制備SEQIDNO:9-10所示的引物和上述的鑒定HBV基因型的特異性探針；b.提取PCR模板；c.將各待測樣本放入熒光PCR儀，與a和b中所得引物、特異性探針和模板混合后進行熒光PCR反應；d.結果判讀，確定各待測樣本的HBV基因型。其中，步驟c中進行熒光PCR反應時，步驟a中所述特異性探針的一個位置為熒光基團修飾，而另一位置為淬滅基團修飾；或者不同熒光或淬滅基團的各種組合。其中，步驟d包括在標記探針對應的熒光波長進行熒光檢測。本發明還提供一種鑒定HBV的基因型的試劑盒，其包含上述的鑒定HBV基因型的特異性探針和上述的引物；使用量均為IO一，而且HBV型間特異性熒光雙標探針分開包裝，使用時可任意組合。其還可以進一步地包含HBVDNA的提取液和反應液。其中，HBVDNA的提取液包括I液NaCl終濃度是0.5mol/L，10%(w/w)PEG6000;II液5。/。(w/v)Chelex-100裂解液；反應液包括O.lU/nlTaq聚合酶，500^MdNTPeach,20一Tris-HCl,lOOmMKCl，3mMMgCl2，0.004U/}ilUNG酶，ddH20。本發明可對HBV的八種基因型(A-H)進行鑒定，分型設計完備。技術上，較傳統方法，流程簡單，操作簡便，用時短；同時，靈敏性更高，大大降低污染干擾；在理論上，以及生物信息分析結果來看，本發明方法彌補類似發明中特異性不足的特點，從而具備顯著的型間差異度和實際可操作性。本試劑盒費用經濟，便于推廣，有利于相關各級單位使用。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳6實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。圖1、B基因型雙標探針(5，FAM—3，TAMRA)和C基因型雙標探針(5，Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型，結果顯示B2、B3、C2、C3、C5樣本于490nm吸收波長有擴增，證實這些樣本為B基因型；圖2、B基因型雙標探針(5，FAM—3，TAMRA)和C基因型雙標探針(5，Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型，結果顯示B2、B3、C2、C3、C5樣本于530nm吸收波長沒有擴增，同時證實這些樣本不為C基因型；圖3、B基因型雙標探針(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy33'TAMRA)組合檢測HBV基因型；結果顯示B4、B5、Cl、C4樣本于530nm吸收波長有擴增，證實這些樣本為C基因型；圖4、B基因型雙標探針(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型；結果顯示B4、B5、Cl、C4樣本于490nm吸收波長沒有擴增，同時證實這些樣本不為B基因型。具體實施例方式以下僅以中國地區HBV基因樣本為例，進一步說明本方法，而不應視為對本發明的限制。技術方案特異性組合探針鑒定HBV基因型的方法1.技術步驟第一步，獲取HBV基因組DNA取HBV感染患者，加入10X(w/w)PEG6000震蕩混勻，離心棄上清，再加入5%(w/v)Chelex-lOO,煮沸IO分鐘，離心，取上清液作為PCR模板。第二步，利用型間特異性探針建立PCR反應體系上述鑒定HBV基因型的熒光PCR反應體系包括Taq聚合酶，dNTPeach,Tris-HCl，KCl，MgCl;!,UNG酶，HBV非特異性引物，特異性水解探針，ddH20，HBV基因組DNA模板。第三步，熒光定量PCR反應，擴增條件為95*C5分鐘94°C20秒}49"30秒(40個循環)72'C30秒第四步，結果判定與病毒基因型一致的特異性探針在PCR過程中被水解后，發出相應波長的熒光，并通過PCR循環熒光量得以累積，PCR反應結束后，通過對應探針的熒光波長及CT值即可確定基因型及其量(包括單一或混合型)。由于病毒基因組的變異隨時可發生，所以，可能會有假陰性的出現，但該方法從理論上，已將這種可能降低到最小。2.引物與探針本法鑒定HBV的基因型，其核心技術就是提供了一組高特異性的型間探針。其來源是我們運用生物信息學技術，分析來自Genbank中的913條HBV全基因組序列和本課題組測序獲得的大陸地區120例乙肝病毒序列樣本，總共獲得約1030條HBV基因組序列(其中，A型131例，B型290例，C型389例，，D型93例，，E型66例，，F型43例，G型13例，H型8例)，著重以HBV基因組中最大的基因重疊區——S區域為目標序列，設計一對HBV非特異性(通用)引物(上游引物GGTCACCATATTCTTGGGAACA;下游引物ACTGCATGGCCTGAGGATG)進行產物擴增，并以此區域設計型間特異性探針。通過這些特異性探針的選擇組合，利用實時熒光定量PCR方法，就可到達快速鑒定HBV基因型的目的。各型的特異性探針列表如下(型間平均特異位點數高達7.3個/26.5&):序列(5，->3，)長度A型探針CATCAAAACCTCGCAAAGGCATGG24B型探針CTCAACCCGCACAAGGACAACTGGCCGGAC308c型探針TCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCG31D型探針TGGGATTCACCCCACCGCAC20E型探針CACAATCCCAACAAAGACCACTGGACAGAA30F型探針CGGTCCGGGAGAAAGCCAACC21G型探針CCTATGGACCCGGGTTCACCCCTCCA26H型探針AATTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTG30由于病毒自身變異特點，上述探針也可能會有點突變發生，但是該區域的仍然是最佳的分型序列，與之80%同源序列及其互補鏈均未改變發明方案的實質性，故同樣受權利保護。3.探針制備上述探針以水解探針形式參與熒光PCR反應，即探針的一個位置為熒光基團修飾，而另一位置為淬滅基團修飾。在聚合酶的外切酶活性作用下，將與模板特異性結合的探針的堿基切下，使熒光基團和淬滅基團分離而發光；而其它無關探針未與模板結合，PCR反應過程中探針不被水解而不發光。4.探針使用說明一、反應體系中各探針熒光基團的最大吸收波長要求不同才便于甄別，熒光基團的選擇與熒光PCR儀的特性與要求有關，一般不受其它特別限制。二、在一個反應體系中，探針的類別要小于熒光PCR儀的檢測通道數。三、熒光探針可從上述列表中選擇全部或部分，放入一個體系中反應。如果受某些老式熒光PCR儀的通道數局限，可在多個反應中實施，也可根據HBV地域分布特點，可先采用最大可疑的幾種探針在一個反應中進行甄別。實施例一引物、熒光探針的制備(人工合成)上游引物5，GGTCACCATATTCTTGGGAACA3，(20D)下游引物5，ACTGCATGGCCTGAGGATG3，(20D)B型探針采用雙標5，FAM—3，TAMRA(20D)CTCAACCCGCACAAGGACAACTGGCCGGACC型探針采用雙標5'Cy3—3'TAMRA(20D)TCACTGGCCAGAGGCAAATCAGGTAGGAGCG實施例二模板提取及反應體系(1)模板提取I液NaCl終濃度是0.5mol/L,10%(w/w)PEG6000。II液5%(w/v)Chelex-100。操作步驟取100pl人血清，加入100pl"I液"震蕩混勻，離心13000r/min,IO分鐘，吸棄上清，再加入25^"II液"，煮沸10分鐘，離心13000r/min,IO分鐘,取5pl上清液作為PCR模板。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例三熒光PCR反應與檢測按上述反應體系，將各樣本放入熒光PCR儀(Bio-radIQcycler)選擇雙通道檢測，分別用4卯nm(FAM)和530nm(Cy3)波長檢測，擴增條件如下95匸5分鐘94'C20秒}49'C30秒(40個循環)72n30秒B基因型陽性對照為測序確證的B基因型DNA樣本，C基因型陽性對照為測序確證的C基因型DNA樣本。結果判定綜合分析儀器檢測的數據，設定合理的基線和閾值，觀察待測樣本中兩種熒光擴增曲線，計算Ct值，通過標準品，分別推算出兩種熒光探針反應出的拷貝數，在如下的九例陽性樣本的熒光PCR鑒定反應中，五例為純B基因型，另四例是純C基因型。如圖l-4所示，其中，圖l、B基因型雙標探針(5'FAM—3'TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型，結果顯示B2、B3、C2、C3、C5樣本于490nm吸收波長有擴增，證實這些樣本為B基因型；圖2、B基因型雙標探針(5'FAM…3'TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型，結果顯示B2、B3、C2、C3、C5樣本于530nm吸收波長沒有擴增，同時證實這些樣本不為C基因型；圖3、B基因型雙標探針(5'FAM-—3'TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy3—3'TAMRA)組合檢測HBV基因型；結果顯示B4、B5、Cl、C4樣本于5300nm吸收波長有擴增，證實這些樣本為C基因型；圖4、B基因型雙標探針(5，FAM--3，TAMRA)和C基因型雙標探針(5'Cy3--3'TAMRA)組合檢測HBV基因型；結果顯示B4、B5、Cl、C4樣本于490nm吸收波長沒有擴增，同時證實這些樣本不為B基因型。序列表〈110>中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院<120>鑒定HBV基因型的特異性探針及使用其檢測HBV基因型的方法、試劑盒<130>〈160〉10<170>Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉24<212>DNA<213>特異性探針<400>1C3tCa3a3CCtCgC833ggC8tgg24<210>2<211>30<212>DNA〈213>特異性探針<210>3<211>31<212>DNA<213>特異性探針〈400>3tcactggccagaggcaaatc8ggt3gg8gcg31<210>4〈211>20〈212〉DNA<213>特異性探針〈400〉2ctcaacccgcacaaggacaactggccggac<400>4tgggattcaccccaccgcac<210>〈211>〈212>〈213〉530DNA特異性探針<400>5cacaatcccaacaaagaccactggacagaa30〈210>6<211>21<212〉DNA〈213>特異性探針〈400〉6cggtccgggsgaasgccascc21〈210>7<211>26<212>■<213>特異性探針〈400>7cctatggacccgggttcacccctcca26<210>8<211>30〈212〉DNA<213>特異性探針〈400>838ttggccaatggcaa3C33ggt3ggsgtg30<210>9〈211>22<212〉DNA<213>上游引物<400>9ggtcaccatattcttgggaaca22<210>10<211>19<212>DNA<213>下游引物〈400>10actgcatggcctgaggatg191權利要求1.一種鑒定HBV基因型的特異性探針，其特征在于具有SEQIDNO1-8所示的核苷酸序列或其互補核苷酸序列中的至少一種。2.根據權利要求1所述的鑒定HBV基因型的特異性探針，其特征在于具有SEQIDNO:l-8所示的核苷酸序列。3.根據權利要求1所述的鑒定HBV基因型的特異性探針，其特征在于探針來自于HBV基因組中的大S重疊基因區域序列，位于SEQIDNO:9-10所示引物的擴增區域之中。4.一種鑒定HBV基因型的方法，其特征在于包括步驟a.制備SEQIDNO:9-10所示的引物和權利要求1所述的特異性探針；b.提取PCR模板；c.將各待測樣本放入熒光PCR儀，與a和b中所得引物、特異性探針和模板混合后進行熒光PCR反應；d.結果判讀，確定各待測樣本的HBV基因型。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟c中進行熒光PCR反應時，步驟a中所述特異性探針的一個位置為熒光基團修飾，而另一位置為淬滅基團修飾；或者不同熒光或淬滅基團的各種組合。6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟d包括針對探針標記熒光對應的波長進行實時熒光檢測。7.—種鑒定HBV的基因型的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的特異性探針。8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于還包含權利要求3所述的引物。9.根據權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于還包含HBVDNA的提取液和反應液。10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述HBVDNA的提取液包括I液:NaCl終濃度是0.5mol/L,10%(w/w)PEG6000;II液5%(w/v)Chelex-100裂解液；反應液包括O.lU/nlTaq聚合酶，500mMdNTPeach,20|iMTris-HCl,lOOmMKC1,3mMMgCl2，0.004U/plUNG酶，ddH20。全文摘要本發明涉及一種鑒定HBV基因型的特異性探針，其具有SEQIDNO1-8所示的核苷酸序列或其互補核苷酸序列中的至少一種。本發明還提供一種鑒定HBV基因型的方法和試劑盒，該試劑盒包含上述的特異性探針。本發明可對HBV的八種基因型(A-H)進行鑒定，分型設計完備。技術上，較傳統方法，流程簡單，操作簡便，用時短；同時，靈敏性更高，大大降低污染干擾；本發明方法彌補類似發明中特異性不足的特點，從而具備顯著的型間差異度和實際可操作性。本試劑盒費用經濟，便于推廣。文檔編號C12Q1/68GK101560576SQ20091010392公開日2009年10月21日申請日期2009年5月22日優先權日2009年5月22日發明者國衛,軍吳,張園園,曹紅衛,彥李,青毛,寧王,趙苛岑,凱鄭,江鄭申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院