一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種豬血有限酶解提取后分離得到的豬血抑菌劑，同時還提供了該抑菌劑的制備工藝，本發明的豬血抑菌劑是經有限酶解后再通過超濾及納濾手段得到的分子量為500~3000的小肽混合物，F值為14.5，等電點pI值為4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很強的抑菌活性；提取的豬血抑菌劑是天然資源中得到的產物，具有良好的殺菌抑菌能力，不同于一般化學成分的殺菌抑菌產品，不會對生物體的組織、皮膚產生副作用，有著安全可靠，價格低廉，制備相對簡單的優點。為制備抑菌殺菌藥物及日常皮膚清潔用品方面提供了新的選擇。
【專利說明】一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑及其制備方法
[0001]【技術領域】:
本發明提供一種豬血有限酶解提取后分離得到的豬血抑菌劑，同時還提供了該抑菌劑的制備工藝，屬于生物化學【技術領域】。
[0002]【背景技術】:
我國每年屠宰生豬近6億頭，占世界生豬屠宰量得45%，豬血資源十分豐富，但目前除少量用于制作食用食品外，基本未得到開發利用，不僅浪費資源，而且污染環境。新鮮豬血中含有豐富的蛋白資源，從豬血中提取的抑菌劑具有良好的生物抑菌活性，能殺滅如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等多種病原菌。同時，目前采用酶法生產生物蛋白制劑是當前的研究熱點，因其安全性極高、價廉、易于推廣而引起人們的極大興趣。從豬血中所提取的抑菌制劑性質穩定，是不可多得的穩定的生物抑菌制劑，可廣泛的應用于生物制藥領域中。
[0003]傳統的從豬血中通過酶解法獲取抑菌劑方法，首先需要向豬血中添加抗凝劑，如:肝素、檸檬酸鈉，隨著科學技術的發展和人們對自身安全的重視度的增加，外源添加物的使用目前已經成為 天然產品加工和生產領域中越來越需要謹慎對待的事件。
[0004]另外，從豬血中通過酶解法獲取抑菌劑，在酶解前需要通過加酸、加堿或者加熱的辦法誘使血中蛋白質變性，變性的蛋白質結構松散舒展可以被蛋白酶切割成更多的、分子量更小的肽片段。但是，這種變性使得蛋白質的結構展開不具有重復性，這大大的降低了酶解產物的質量穩定性，提高了質量控制的難度；在酶解法獲取抑菌劑工藝中，主要是采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶等最適溫度范圍較寬、酶切位點較多的蛋白水解酶，目的是獲得分子量盡可能小的肽組分，缺點是上述酶的酶切位點較為廣泛重現性差，酶解制備活性肽的工藝難于穩定和具體掌握。同時，采用控制酶解時間來結束酶解反應，往往不另外終止酶解反應，酶的自切割產物往往混雜在產品中，從而影響酶解產品的品質。而在從酶解液中分離抑菌劑的主要方法是離子交換層析、分子篩層析和膜分離，僅從樣品處理速度和量來說，膜分離 > 離子交換層析 > 分子篩層析。離子交換層析和分子篩層析兩種技術分別是按照酶解液中各肽類組分的表面電荷性質和分子量大小性質對樣品進行分類和初步分離，其優點在于該類技術在理論和實際應用中都非常成熟，缺點樣品處理量小，柱子復生慢，難于進行擴大化生產和應用；膜分離技術是按照樣品的分子大小進行分離，其優點在于快速、樣品處理量大、幾乎不需要膜的復生與額外處理，易于進行擴大化生產和應用。
[0005]對于酶解法獲取抑菌劑工藝，從酶解液中清除卟啉(血紅素)及卟啉水解物的過程，主要是活性碳或者大孔樹脂吸附，氯仿等有機溶劑萃取；活性碳、大孔樹脂的使用在吸附卟啉及其水解物同時也吸附水解液中的活性肽成分，造成不必要的損失，氯仿等有機溶劑的使用，提高工藝的難度、成本與質控標準，也同樣會降低活性組分的含量。
[0006]所述的從酶解液中分離抑菌劑的方法主要是采用低溫冷凍干燥法或者高溫噴霧干燥法獲得抑菌劑的干粉，使得肽類組分在干燥狀態下保證其生物活性，或者現用現制備，以保證抑菌劑的生物活性。
[0007]
【發明內容】
:本發明的目的在于提供一種豬血抑菌劑，具有抑菌活性。
[0008]本發明的目的還在于提供一種豬血抑菌劑的制備方法，具有高穩定性、重現性、操作簡便性、可以快速分離活性組分，清除產品中的卟啉及其水解物，便于規模放大的，適用于工業化生產的制備方法。
[0009]本發明公開的豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑，其特征在于:
是經有限酶解后再通過超濾及納濾手段得到的分子量為500-3000的小肽混合物，F值為14.5，等電點pi值為4.4^9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很強的抑菌活性；
上述小肽混合物經 nanoAcquity-UPLC BEH130 C18 色譜柱分離，AB Sciex 5800 MALDIT0F/T0F質譜分析，該混合物中氨基酸序列如:SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3組分含量占豬血抑菌劑總蛋白含量的86%以上，其中SEQ N0.1:SEQ N0.2 =SEQ N0.3的比例為1:1:1。
[0010]以大腸桿菌coliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(5?<3/成r/ocomAsaureus ATCC 25923)、銅綠色假單胞菌iPseudomorms aeruginosa ATCC 27853)、白色念珠菌(.Monilia albican ATCC 10231)為活性檢測菌，檢測 SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3 三個序列組分的抑菌活性占豬血抑菌劑總抑菌活性的92%以上。
[0011]本發明所述的豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑的制備方法，包括以下步驟:
1)將新鮮豬血與3~4倍體積量水充分混合，100~150轉每分鐘條件下攪拌30~60分鐘，靜置30到60分鐘，上清液利用膜分離技術經過中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量30KDa以下的部分；
2)分子量30KDa以下的濾液用氫氧化鈉調節pH至8.0~8.5，按照質量體積比為1:1000~10000的比例加入胰蛋白酶，在37°C條件下酶解8~12小時；
3)用醋酸將酶解液調節pH至3.5~4.0，使酶失活終止酶解反應，加熱煮沸5分鐘，靜置至室溫，過濾，留上清液；
4)上清液利用膜分離技術經中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量3KDa以下部分，再利用膜分離技術通過納濾裝置截留分子量0.5KDa以上部分，既得；
5)豬血抑菌劑的F值為14.5，氨基酸組成見(表1 )，其中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，等電點pi分布范圍為4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。
[0012]本發明制備方法的特點在于:血液中不添加抗凝劑，直接利用大體積的水使紅細胞進行溶血，然后利用膜分離技術經中空纖維素濾膜濾器直接分離分子量小于30KDa的組分，移除未溶血的細胞和細胞膜結構；未采用加酸、加堿或者加熱的辦法誘發血液中的蛋白質變性；本發明中蛋白酶是在血中蛋白質的穩定結構下進行切割的，蛋白質在近穩定結構時結構重現度高，蛋白結構的穩定性，提高了酶解產物的重現性與穩定性，酶解產物在各個批次間差異達到最小，不同批次產品中三種主要抑菌成分SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3的含量在89±3%之間。
[0013] 本發明中采用pH在8.0到8.5間的條件進行血中蛋白質的酶解操作，此時血中蛋白質處于近穩定結構狀態下，一般蛋白質在PH4~9范圍內結構處于可逆變化狀態，其結構具有高度的規則性和可重現性即稱為穩定結構；本發明中采用胰蛋白酶，與現有技術采用的木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和堿性蛋白酶相比，胰蛋白酶具有較為專一的酶解位點，酶解位點的專一性提高了酶解產物的穩定性和重復性。
[0014]本發明采用醋酸酸化和加熱雙重技術確保胰蛋白酶酶解反應的終止，抑制酶自切割產物的產生與混入產品中，提高產品的穩定性和重復性。
[0015]現有技術中豬血中的抑菌活性組分集中在分子量3KDa以上，大分子量抗菌組分在保存和使用時活性易于因為分子本身的折疊、聚集和分解而損失，所以【背景技術】中抗菌活性組分需要凍干或者現用現制備；本發明小分子量抑菌活性組分不存在自身的折疊、聚集和分解問題，液體狀態產品在室溫下保存半年以上未見活性有損失。
[0016]表格I豬血抑菌劑的氨基酸組成
【權利要求】
1.一種豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑，其特征在于； 分子量為500-3000的小肽混合物，F值為14.5，等電點pi值為4.4^9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%,堿性氨基酸占10.3%, 卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一,具有很強的抑菌活性； 抗菌主要成分的氨基酸序列如=SEQ N0.1、SEQ N0.2、SEQ N0.3所示，比例為1:1:1。
2.根據權利要求書I所述豬血有限酶解提取后分離的豬血抑菌劑的制備方法，包括以下步驟: 1)將新鮮豬血與3~4倍體積量水充分混合，100~150轉每分鐘條件下攪拌30~60分鐘，靜置30到60分鐘，上清液利用膜分離技術經過中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量30KDa以下的部分； 2)步驟I)中所得組分用氫氧化鈉調節pH至8.0~8.5，按照質量體積比為1:1000~10000的比例加入胰蛋白酶，在37°C條件下酶解8~12小時； 3)用醋酸將酶解液調節pH至3.5~4.0，使酶失活終止酶解反應，加熱煮沸5分鐘，靜置至室溫，過濾，留上清液； 4)上清液經中空纖維濾膜濾器超濾，截留分子量3KDa以下部分，再通過納濾裝置截留分子量0.5KD a以上部分，既得； 5)豬血抑菌劑的F值為14.5，氨基酸組成見(表1 )，其中酸性氨基酸占25.6%，堿性氨基酸占10.3%，pi分布范圍為4.4到9.7，卟啉及卟啉水解物含量小于千分之一。
【文檔編號】C12P21/06GK103989707SQ201410202784
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月14日 優先權日:2014年5月14日
【發明者】周杰, 張雪蘭, 吳浪, 劉琪, 馬沐青, 呂明, 滕利榮, 孟慶繁 申請人:吉林大學