體外慢病毒介導bmp-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法

專利名稱：體外慢病毒介導bmp-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法
技術領域：
:本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種軟骨分化的方法，特別是一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法。
背景技術：
:近些年來，使用滑膜間充質干細胞進行半月板軟骨修復是關節外科的熱點問題。經典的組織工程學方法是將體外增殖誘導干細胞形成種子細胞，種植種子細胞在生物支架上，將支架移回生物體并添加各種細胞因子進行修復。既往許多研究者選擇骨髓間充質干細胞(bone marrow-dervied mesenchymalstem cells, BMSCs)作為種子細胞。但是當De Barii發現了滑膜間充質干細胞(synovium-dervied mesenchymal stem cells, SMSCs)后，其迅速取代了 BMSCs。原因在于:盡管SMSCs在細胞形態、免疫表型、集落形成能力和分化潛能方面和BMSCs相似，但其具有更強的軟骨分化潛能；此外，生理上當半月板出現損傷時，滑膜作為SMSCs的儲存器，會移行定植到損傷處，和局部細胞一起，完成修復過程。所以選擇SMSCs，更符合生理過程，并有更專一的軟骨分化潛能。目前為止，有個案報道研究者采用轉化生長因子3(TGF-0 3)和骨形成蛋白2(BMP-2)作為介導SMSCs向軟骨分化的誘導因子。Sakaguchii1、Shirasawaiii和HorieMiv等利用TGF-β 3、BMP-2和地塞米松(Dex)，成功誘導SMSCs向纖維軟骨分化。但這一過程中仍存在諸多問題:誘導所需的BMP-2濃度需要非常高(50 200g/L甚至更高)，且時間很長，這就導致SMSCs有向骨分化的可能。且體外反復應用細胞因子存在降解失活的可能，并大大增加培養費用。所以在本發明的實驗中，采用慢病毒介導兔BMP-2基因轉染SMSCs，并加入EGFP基因作為報告基因，從而為應用組織工程學方法進行軟骨修復提供新思路和新方法
發明內容
:本發明的目的在于提供一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，所述的這種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法要解決現有技術中體外誘導滑膜間充質干細胞向軟骨分化的方法成功率低、而且時間和成本高的技術問題。本發明提供了一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，包括一個將滑膜間充質干細胞分離、培養的步驟，還包括一個構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟，一個制備轉染慢病毒的病 毒液的步驟，一個將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟，在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，首先根據BMP-2基因設計引物，通過逆轉錄反應擴增BMP-2基因，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW質粒和BMP-2基因重組，構建重組質粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，利用所述的重組質粒pFUGW-oBMP-2加上包裝質粒，共同構建轉染慢病毒，然后再加入緩沖液培養、孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液，在所述的將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質干細胞和解凍的轉染慢病毒的病毒液混合，將混合物離心、培養40-52小時，然后將上述的培養物加入不完全成軟骨誘導培養液誘導培養液中誘導，誘導14天以上即可獲得軟骨細胞。進一步的，在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，首先擴增重組質粒pFUGW-oBMP-2、包裝質粒psPAX2和pMD2.G，提純濃縮；其次將293T細胞的細胞密度調至IO7,放入培養瓶中培養，所述的培養瓶內含有DMEM培養基，所述的培養基中還包含有青霉素G、鏈霉素、小牛血清、聚賴氨酸，所述的青霉素G在DMEM培養基中的濃度為100U/ml、所述的鏈霉素在DMEM培養基中的濃度為100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培養基中的質量百分比濃度為10%、所述的聚賴氨酸DMEM培養基中的濃度為5%，將293T細胞于培養瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的緩沖液，孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液。進一步的，在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，將oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel雙酶切，同時，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，然后加入T4DNA反應得到pFUGW-oBMP-2重組質粒。進一步的，在擴增BMP-2基因的過程中，所述的5’端的引物序列如SEQ IDNO:1所示，所述的3’端的引物序列如SEQ ID N0:2所示。進一步的，所述的不完全成軟骨誘導培養液培養液是一個含TGF-P3、地塞米松、2-磷酸-抗壞血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀 釋的ITS+Premix溶液的H-DMEM培養液；其中，在所述的H-DMEM培養液中，TGF- β 3的濃度為10ng/mL、地塞米松的濃度為I X IO^mol/L、2-磷酸-抗壞血酸的濃度為50μ g/mL、脯氨酸的濃度為40 μ g/mL、丙氨酸的濃度為lOOyg/mL、所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中含有胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、牛血清白蛋白、亞油酸，在所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中，胰島素的濃度為6.25 μ g/mL、轉鐵蛋白的濃度為6.25μ g/mL、亞硒酸的濃度為6.25ng/mL、牛血清白蛋白的濃度為
1.25mg/mL、亞油酸的濃度為5.35mg/mL。盡管SMSCs和BMSCs在細胞形態、免疫表型、集落形成、分化潛能方面均類似，但SMSCs具有更強的軟骨分化潛能，所以本發明選用SMSCs作為軟骨修復的種子細胞。目前被認定可以促進SMSCs向軟骨分化的細胞因子包括=TGF-P 1、BMP_2、IGF-1、DEX。TGF-β I可以增強SMSCs的擴增，并抑制其向骨和脂的分化，TGF-β I的作用機理通過ERK1/2MAPK信號通路實現的。ΒΜΡ-2被公認為最強的成骨因子。但是近年來的研究認為其亦可以誘導間充質干細胞向軟骨分化。盡管目前對其機理知之甚少，但是其應用卻日漸增廣。但其應用過程中，仍然存在諸多問題:ΒΜΡ-2的制造工藝非常復雜，產量很低；且新陳代謝很快，誘導時間較短；且作為外來蛋白，當大量應用時可對機體產生有害作用。一些研究者嘗試利用支架搭載緩釋ΒΜΡ-2，但ΒΜΡ-2對材料高度敏感，當置于支架上，其活性會降低。所以為解決上述問題，采用將ΒΜΡ-2基因導入慢病毒，并轉染SMSCs，從而使得BMP-2蛋白隨SMSCs增殖而生成。有趣的是，在的實驗結果看來，BMP-2可能是誘導SMSCs向軟骨分化的關鍵因子。相比于其他的病毒載體，慢病毒載體不僅可以轉染分裂期細胞，還可以轉染非分裂期細胞。且目的基因的表達穩定、長效。EGFP，作為報告基因，可以直接被觀測到。其在470nm處吸收可見光，并在510nm處發出綠色熒光。只要表達足夠強烈，其可直接在活體觀察。不同于其他熒光標記物，例如LacZ> Luc、β -galactosidase,其應用中無需再添加其他因子。所以，在本發明的實驗中，使用了已經包含EGFP基因的pFUGW來轉染SMSCs，從而使得觀察變得簡單明了。轉染后，免疫熒光和Western blot結果均證實有BMP-2蛋白生成。被轉染后的SMSCs，其安全性尤為重要，因為其決定了是否可以被用作種子細胞。相關的生長曲線表明細胞數量在第7天趨于穩定，表明其分化能力非無限制的。流式細胞儀被用于測定DNA含量，結果提示無假二倍體細胞，被轉染的SMSCs均為正常的二倍體細胞。此外，核型分析顯示SMSCs中含44條染色體。致瘤性試驗表明其無致瘤性。這些結果都證實了SMSCs是安全的，可以被用作種子細胞。之后將安全的SMSCs放在不完全成軟骨培養基上。發現其細胞形態從梭形細胞轉為多邊形細胞。通過RT PCR可檢測到I型膠原、2型膠原和聚集蛋白聚糖mRNA表達。間接免疫熒光結果亦表明有I型膠原和2型膠原生成。在正常的軟骨發育不全病例中，可見MicroRNA_130a表達缺失。其在軟骨形成過程中表達逐漸減少。其靶基因Runx3在軟骨發育不全病例中亦表達缺失。Micro-145，作為正常關節軟骨中Sox9的直接調節者，其通過結合3’ -UTR的特定結合位點而下調了 Sox9的表達。在人軟骨表型中，Micix)-145非常重要。當其水平升高時，會降低特異性軟骨細胞外基質基因(C0L2A1和聚集蛋白聚糖)和組織特異小RNA (miR-675and miR-140)的表達，同時升高RUNX2和MMP13的表達，后兩者在骨性關節炎病例中多見。所有上述的結果均顯示BMP-2可誘導SMSCs向軟骨分化。本發明提供了一種用于半月板修復的新的種子細胞。經plentiV6-oBMP-2轉染的SMSCs足夠安全，為正常的二倍體細胞，無致瘤性，且在體外可自發向軟骨分化。


:圖1是轉染前貼壁后I天光鏡下(100X) SMSCs的形態學照片，光鏡顯示為梭形細胞。圖2是轉染前貼壁后14天光鏡下(100X) SMSCs的形態學照片，光鏡顯示為梭形細胞。圖3是轉染前貼壁后14天電鏡SMSCs的形態學照片，電鏡顯示核質比大。圖4是免疫熒光試驗。A、B、C、D依次為為綠色熒光顯示波形蛋白生成；綠色熒光顯示a -SMA生成；紅色熒光顯示有0ct4表達；紅色熒光顯示有Sox9表達。圖5 是流式細胞儀結果。A、B、C、D、E 依次為 CD44(98.25%)、CD90 (98.75%)、CD29 (99.14%)、CD34 (幾乎無)、CD45 (幾乎無)。圖6是多向分化實驗結果。A、B、C依次為成骨誘導、成脂誘導、成軟骨誘導。可見AKP染色(+)、油紅染色(+)、堿性甲苯胺藍染色顯示有胞外基質GAG生成。圖7顯示慢病毒轉染后的圖；其中A為流式細胞儀顯示轉染率超過80% ；B為對應熒光圖(100X)。圖8顯示轉染培養后細胞形態(200 X)的照片。A為在不完全成軟骨培養基上，細胞由梭形細胞變為多邊形細胞；B為實驗對照組中細胞形態幾乎無變化。圖9顯示RT-PCR結果。實驗組表達I型膠原、2型膠原等，且2型膠原更多；實驗對照組少量表達I型膠原和2型膠原等；空白對照組不表達。圖10顯示免疫熒光染色和甲苯胺藍染色實驗(200 X)的照片。紅色熒光顯示有I型膠原生成，綠色熒光顯示有2型膠原生成，實驗組被甲苯胺藍染色，實驗對照組和空白對照組均無染色。圖11顯示MiCT0RNA分析。A為在實驗組、實驗對照組、完全對照組、基線組中M1-130a的表達，B為在實驗組、實驗對照組、完全對照組、基線組中M1-145的表達。
具體實施方式
:實施例1:SMSCs的獲取、分離和鑒定1.1 獲取 SMSCs準備了 6只3月齡的新西蘭大白兔(SPF級，Slack實驗動物中心，中國科學院，http://www.slaccas.com)(平均體重2.1±0.3kg,雌雄不限)。固定麻醉后，取館旁直切口，逐層打開至關節囊，用組織剪取髕上囊滑膜組織。將取得的滑膜剪碎，37°C下用2型膠原酶(0.2%, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)消化 3 小時,經 200-lm濾網(佳寶公司，http://www.caiRou.com.cn/c20931)過濾后獲取組織塊，并培養于含20%FBS (Hyclone 公司 http: //www.hyclone.com)的 DMEM (GibcolBRL 公司，http: //www.gel company, com/products/gibco~brl)中。上述所有過程均在超凈臺(Sff_CJ_lF,佳寶公司，http: //www.caigou.com, cn/c20931)內完成。隨后保存于 5%C02 孵箱中(CCL-170A-8,ESCO公司，http://escoglobal.com/home, php)中孵育14小時。隨后再次剪碎、過濾后保存于含10%PBS的60mm培養皿中。每24小時換液以去除未貼壁的細胞。1.2SMSCs的分離 和純化培養皿中包含多種細胞。基于陰性分離法原理分離SMSCs。向細胞群中加入了含有CD14 的戴諾磁珠(111-49D, Dynabeads CD14,卓康牛.物科技公司，http://www.caigou.com.cn/c42082),隨后經過磁珠分選儀(KingFisher,安諾生物科技公司，http://ww.hbzhan.com/st31204/product 1832042.html)即得到純化的 SMSCs。將這些細胞按照 IOOcells/cm2的密度培養14天后凍存于_80°C下作為Pl代。1.3形態學鑒定每天都通過倒置相差顯微鏡觀察Pl代細胞的生長狀況。將細胞消化成懸液后，隨機選取100個視野，測量所見細胞的直徑。同時，還進行了電鏡觀察。將P2代細胞用0.25%Trypsin/EDTA (YW003,宜滕生物公司，http://www.yitbi0.com)消化后,使用2.5%戍二醒和鋨酸(帝科化工公司，http://www.whdic0.com/index, htm)固定90分鐘。再用70%酒精飽和醋酸液鈾染色,經酒精和丙酮脫色后包埋于環氧樹脂618中(博偉化工公司，http://cqtnbw.qjyl68.com)。隨后切成90nm超薄切片，再經乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后，于透射電鏡(H-7650，HITACHI公司，http://www.hitach1.c0.jp)下鏡檢。結果:貼壁后2天，已經有一些梭形細胞；14天后，細胞幾乎均為梭形細胞。此外，透射電鏡顯示核質比較大，核仁較大而細胞質卻不發達(圖1、2、3)，符合干細胞的形態學特征。
1.4免疫突光分析將P3代細胞種植于玻片上，用4%多聚甲醛固定，然后浸入2%BSA/PBS中10分鐘。一抗包含 0ct4 (羊抗，1:50, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、波形蛋白和 a-SMA (均來源于鼠抗，1:200, Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)和 Sox_2 (鼠抗，1:400, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)。培養 24小時后，加入二抗，二抗包含 FITC-羊抗鼠 IgG (1:100, Sigma-Aldrich 公司，http://www.sigmaaldrich.com)、Cy3_ 羊抗鼠 IgG 和 Cy3_ 驢抗羊 IgG (均為 1:150, KPL 公司，http: //www.kpl.com)ο隨后DAPI染色觀察。結果:免疫熒光分析顯示P3代細胞表達了波形蛋白和a -SMA，此二者為SMSCs的細胞表面標志物。此外，0ct4和Sox2表達也很強烈(圖4)，尤其是0ct4，表明細胞有多向分化潛能。所以可以認為P3代細胞基本都為間充質干細胞了，并且有多向分化潛能。1.5流式細胞儀檢測將P3代細胞使用0.25%Trypsin/EDTA消化。隨后選取I X IO5細胞，加入多種熒光標記抗體，有 CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD90-FITC、CD44-FITC (均來源于晶美生物公司，http://www.jinRme1.com)和相應的同型對照抗體,混合均勻后避光室溫靜置20分鐘。隨后加入2mlPBS，離心5分鐘，移去上清，加入300 μ 1PBS,再次離心，上機檢測(FACSCalibur type, Becton Dickinson 公司，http: //www.bd.com)計數陽件細胞百分比，所有數據通過配套的CellQuest軟件分析(Becton Dickinson)。結果:流式細胞儀結果顯示上述細胞表達了 SMSCs的分子標記物，例如⑶44(98.25%)、CD29 (99.14%)、CD90 (98.75%)。而造血干細胞的分子標記物CD34、CD4卻幾乎沒有表達(圖5)。上述結果證實了擴增的細胞為SMSCs。1.6細胞多向分化潛能測定為了成脂，細胞被培養在含0.5 μ M地塞米松、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、50 μ M吲
哚美辛的成脂培養基上。4天后0.3%油紅染色觀察。為了成骨，細胞被培養在含IOOnM地塞米松、IOmM β -甘油磷酸鹽、50 μ M抗壞血酸的成骨培養基上。21天后,使用他171^1 法(研晶公司，111^0://￥￥￥.yjbi0.com)分析堿性磷酸酶的表達。為了成軟骨，細胞被培養在含500ng/ml的BMP-2、10ng/ml TGF-β 3、1(Γ7Μ地塞米松、50ug/ml2-磷酸-抗壞血酸、40ug/ml脯氨酸、100ug/ml丙氨酸，以及I比100稀釋的 ITS+Premix (含 6.25ug/ml 胰島素，6.25ug/ml 轉鐵蛋白，6.25ng/ml 亞砸酸，1.25mg/mlBSA,以及5.35mg/ml亞油酸)的DMEM培養基上。顆粒包埋切片后用甲苯胺藍染色。成骨誘導的AKP染色顯示兔SMSCs為陽性，陽性細胞中可見棕黃色的染色顆粒。成脂誘導，可見有大滴脂肪被油紅染色。成軟骨誘導可見細胞形態轉為多角形，堿性甲苯胺藍染色顯示有胞外基質GAG成分(圖6 )。上述結果證實兔SMSCs具有多向分化潛能。實施例2載體構建和轉染

2.1引物設計兔BMP-2 的 GenBank 編號為 ΝΜ_0010826507，閱讀框為 70_1257bp。據此利用 S⑶^#(http://www.yeastgenome.0rg/cgi—bin/web—primer) 十弓I奪勿。弓I物設計為 5，端:5’-CTAGCTAGCTGGAGGCTCTTTCAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)。GCTAGC 為限制性內切酶 Nhel 的酶切位點，ATG為終止密碼子；3’端:5’-GGGTTTACCGGTAAAGCAAAAACAAACCAA-3’ (SEQ ID NO:2)。ACCGGT 為限制性內切酶Agel的酶切位點，AAG為終止密碼子。2.2BMP-2 擴增使用Trizol (Gibco 公司，http://zh.1nvitrogen.com)來抽提兔肝臟的總 RNA,使用5IU MMLV (業力公司，http://www.業力bio, cn)講行逆轉錄反應。經70°C下反應5分鐘，37 °C下反應60分鐘，95 °C下反應5分鐘的循環后，cDNA即被合成。使用PCR(TC9600-G-230V,Labnet 公司，http://www.labnet.net)將 oBMP-2 擴增至 1.2kb。反應條件為:94°C下2分鐘；94°C下5秒、58°C下45秒、72°C下45秒、每30秒后一次循環；72°C下5分鐘。2.3PlentiV6-oBMP2 包裝將Agel 和 Nhel (TakaRa 公司，http: //www.takara.com, cn)從 IOunits/ μ L 稀釋到lunit/μ L。再將oBMP-2的cDNA雙酶切，并于70°C下滅活10分鐘。IOOV電泳后從1%瓊脂糖膠上的1.2kb條帶處割膠。同時，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，靜置2小時。將雙酶切好的載體和割下的膠帶按照1:3的比例在16°C下反應I小時，期間加入T4DNA (業力公司，http: //www.yelibi0.cn)。即得到pFUGW_oBMP-2重組質粒。隨后，擴增重組質粒pFUGW-oBMP-2，包裝質粒psPAX2和pMD2.G (Didier Tro實驗室，http://www.lentiweb.com);提純濃縮至I μ g/ μ L備用。轉染的前I天，先將293Τ細胞(本實驗室保存)細胞密度調制107，再放入75ml培養瓶中，瓶內含DMEM培養基，包含有青霉素G( 100 U/ml )、鏈霉素(100 μ g/ml )、10%FBS、聚賴氨酸。將培養瓶保存于37°C下的5%C02 孵箱中 24 小時。另小心加入 pFUGW-oBMP-231 μ g、psPAX29 μ g、pMD2.GlO μ g 到雙餾水中，將總容量調至1600 μ L，再加入150 μ LCaCl2 (2.5mol/L)和1750 μ LBES (業力公司，http://www.yelibi0.cn),混合均勻后室溫下放置20分鐘。然后逐滴將上述混合物加入含293T細胞的培養瓶中。將培養瓶再次保存于37°C下的5%C02孵箱中16小時.然后移去上清，用0.45 μ m濾紙濾過。將所得的病毒液凍存于-80°C下備用。同樣做了對照組，除去不包含oBMP-2，其余所有步驟同上述相同。2.4plentiV6-oBMP-2轉染SMSCs及其轉染效率分析取P3代SMSCs，消化和計數后，選取5 X 104細胞和解凍的病毒液混合。將混合物離心(2500r/min)3小時后，重植回12孔板上。每孔加入Iml含10%FBS的L-DMEM，每2天更換培養基。每次更換培養基時，均使用熒光顯微鏡觀察EGFP的表達情況。當混合物培養24小時后，通過熒光相差顯微鏡觀察是否有綠光。每次更換培養基時，均使用熒光相差顯微鏡觀察綠色熒光，取相同視野的熒光相和自然光相做比較，從而確定轉染效率。同時還使用了流式細胞儀分析陽性率。此外，還進行了 Western blot檢測。取培養轉然后SMSCs的上清液，用3%PBS固定細胞3小時后，加入oBMP-2抗體和FITC-羊抗兔IgG，反應小時后，加入10mlNBT/BCIP,避光反應15分鐘后行SDS-PAGE檢測。結果:因為plentiV6-oBMP-2內含EGFP報告基因，所以可以直接在熒光顯微鏡下觀察。被成功轉染的SMSCs細胞可發出綠色熒光，而未成功轉染的則無熒光。實時觀察表明48小時后EGFP表達的綠色熒光達到最高峰，流式細胞儀結果顯示此時表達率約為80%(圖 7)。選取培養SMSCs的上清液做SDS-PAGE，隨后轉膠做Western blot。實驗組在40000處有條帶顯出，而對照組則無。說明被plentiV6-oBMP-2轉染后的SMSCs可表達BMP-2蛋白。實施例3轉染后SMSCs安全性鑒定3.1細胞增殖動力學分析將轉染后的SMSCs按50Cells/Cm2的密度種植于24孔板后，放入CO2孵箱中。每天選取3孔，用200 μ L0.25%Trypsin/EDTA消化后，用移液槍反復吹打成單細胞懸液。直到取完所有孔，之前培養基均不更換。每天每孔中的細胞數量都被計數后取均值記錄。按照數值，依據方程繪制生長曲線并依次計算倍增時間。使用到的方程為TD=tlog2/log(N/N0)(t:從開始培養到被計數日的時間，單位小時；N:時間T時的細胞計數；N0:細胞總數)。結果:計數了 7天的細胞數，然后據此繪制了細胞生長曲線。按照相關公式，計算了細胞倍增時間，約為30.2±2.4小時。曲線顯示細胞數量呈S行分布，到第7天時，細胞數量幾乎保持穩定。結果說明SMSCs的生長并非無限制倍增的。3.2核型分析 首先制備了轉染后SMSCs的染色體樣本。SMSCs被加入到含0.1 μ g/ml秋水仙堿的營養液中培養4小時，隨后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液槍反復吹打成單細胞懸液。再用PBS洗滌2次后，離心混合液并取其沉淀物。隨后用0.075M氯化鉀低滲液重懸后，放置在37°C下30分鐘，再次離心(IOOOrpm)，取其沉淀，用甲醇/冰醋酸(3:1)重懸固定15分鐘。將細胞懸液從20cm高處逐滴滴在冰玻片上，過火3次，再用Giemsa染色10分鐘。最后使用光鏡觀察計數染色體。然后使用流式細胞儀分析DNA含量。用PBS洗滌SMSCs3次，隨后用0.25%Trypsin/EDTA消化，用移液槍反復吹打成單細胞懸液。經離心分離后，取其細胞沉淀用75%酒精重懸固定，放置在-20°C環境下24小時。之后用75%酒精和PBS洗滌細胞3次，再加入100100 μ g/ml核糖核酸酶。37°C下30分鐘后，用40 μ g/ml碘化丙啶染色。同時，選取了兔股骨骨髓細胞，去除紅細胞后作為同型對照。其余所有操作均相同。使用流式細胞儀分析DNA含量。結果:使用流式細胞儀確定了 DNA含量。可見G2-M期、GO-Gl期的曲線較為平滑，表明沒有假二倍體。SMSCs在GO-Gl期、G2-M期、S期的分布為87.41%,0.00%、12.59%，表明SMSCs為正常的干細胞。3.3致瘤性分析將P3代的2 X IO7SMSCs注射到N0D/SCID小鼠(n=3)的左側腹股溝皮下(SPF級，Slack實驗動物中心，中國科學院，http://www.slaccas.com)。觀察3個月看是否有腫瘤生成。結果:每周觀察被注射了的N0D/SCID小鼠，共計3個月，并未發現任何腫瘤生成。表明被轉染的SMSCs無致瘤性。上述結果共同證實被轉染的SMSCs為正常的二倍體細胞，非無限增殖，且無致瘤型，是安全的，因而可作為種子細胞用于后續的實驗。
實施例4轉染后的SMSCs向軟骨定向分化4.1RT PCR分析基因表達后續的所有實驗中，均設置了以下3組，分別為實驗組:經plentiV6-oBMP_2轉染的SMSCs，記為plentiV6-oBMP-2(+);實驗對照組:經plentiV6轉染，但不包含oBMP-2的，記為plentiV6-oBMP-2(_);空白對照組:未經轉染的SMSCs。將實驗組細胞放置在DMEM上培養，含5mlFBS、5 μ L地塞米松(lmol/L)、5OyLTGF-0 3(lOyg/ml)。14天后，于光鏡下觀察細胞形態。此外，利用RT PCR分析I型膠原、2型膠原和細胞外基質的聚集蛋白聚糖的mRNA等的表達。結果:SMSCs在非完全成軟骨培養基中培養14天后，可以發現細胞形態發生了很大改變，原本的梭形細胞逐漸變成了類似軟骨細胞的多邊形，而實驗對照組形狀并未改變(圖8)(空白對照組無需觀察)。使用Trizol 抽提總 RNA 后凍存在-70°C下。Oligo dT-Adaptor 引物(Bio-Rad 實驗室，http: //www.biorad, com)、Rase Free dH20 (浩然生物公司，http:// www.haoranbi0.com)、dNTP 混合物(Promega 公司，http: //www.promega.com.cn)> RNase 抑制劑(浩然生物公司，http://www.haoranbi0.com)、M-MMLV 逆轉錄酶(Promega 公司,http: //www.promega.com, cn)等被用于進行逆轉錄反應。引物設計如下:I 型膠原(正義鏈:5’ -AGGTCCACATGGCCCCGTGG-3’ (SEQ ID NO:3))，反義鏈:5’ -AAAGGGGCCCAGAGGTCTTCCT-3’ (SEQ ID NO:4))；2 型膠原(正義鏈:5’ -AACACTGCCAACGTCCAGAT-3’ (SEQ ID NO: 5))，反義鏈:5’-AGTGGATATCGGCTA GACG-3’ (SEQ ID N0:6))；兔BMP-2 (正義鏈:5’ -TTGCTGGACACCCGGCTGAT-3’ (SEQ ID NO:7)，反義鏈:5’ -AGACCCTTACTGGTCACCTT-3’ (SEQ ID N0:8))；RhoA (正義鏈:5，-AAAAGGAACAGATTTAAGAAGT-3，(SEQ ID NO:9)，反義鏈:5’-TTTTGGAGTTCCCCTCACAGTC-3’ (SEQ ID NO:10))；Sox9 (正義鏈:5’-TTCCGTGACGTGGACATCGGC-3’ (SEQ ID NO: 11)，反義鏈:5， -AGCCTGACCCCCCTGGGGACCAG-3’ (SEQ ID NO:12));GAPDH (正義鏈:5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ (SEQ ID NO: 13)，反義鏈:5’ -GAGGCATTGCTGATGATCTTG-3’ (SEQ ID NO:14))。合成過程在FASMAC (Fasmac 公司，http: //www.fasmac.c0.jp)中完成。使用IOXRNAPCRBuffer (博光生物公司，http://shiadingQ6545.11467.com)、dNTP混合物、Taq酶(TakaRa公司，http://www.takara.com, cn),以及上述提及的引物一起，在RT PCR中進行逆轉錄反應。結果:培養14天后，通過RT PCR結果，可見實驗組明顯表達軟骨細胞特有的I型膠原、2型膠原，以及軟骨分化信號分子的RhoA和Sox-9，此外還明顯表達BMP-2蛋白。而實驗對照組和空白對照組表達不明顯(圖9)。表明實驗組細胞正在向軟骨分化。

4.2間接免疫熒光實驗和甲苯胺藍染色轉染后14天，取細胞用PBS洗滌3次后，用4%多聚甲醛固定30分鐘。然后加入一抗(I 型膠原和 2 型膠原，均來自于 Sigma-Aldrich 公司，http: //www.sigmaaldrich.com)培養24小時，再加入二抗(FITC-羊抗鼠IgG (1:100 )、Cy3_羊抗鼠IgG (1:500 ))觀察。細胞僅加入二抗的作為對照組。此外，還進行了甲苯胺藍染色。將細胞用PBS洗滌3次后，用丙酮固定15分鐘。然后再次洗滌，并用0.1%甲苯胺藍染色。使用酒精和對二甲苯梯度脫水后光鏡下觀察。結果:實驗組經慢病毒轉染的SMSCs在不完全軟骨培養基中誘導14天后表達1、II型膠原，且II型膠原更多，更偏向于纖維軟骨，和RT-PCR結果類似；實驗對照組由于培養基中仍有部分成軟骨因子，因而表達部分1、II型膠原，但表達量明顯較實驗組少；空白對照組未表達1、II型膠原。而堿性甲苯胺藍細胞化學染色結果顯示實驗組產生了軟骨分化過程中特有的GAG,細胞形態上也更趨向于軟骨樣細胞的多邊形，而實驗對照組則沒有GAG表達，空白對照組亦無表達。說明誘導分化的細胞具備軟骨細胞特異的分泌特性。而未經誘導的SMSCs則不分泌GAG (圖10)。4.3Real-Time PCR 分析 MicroRNA用Trizol抽提了 3個實驗組的總RNA后，培養10天。逆轉錄體系包含:Iyg總RNA,dNTP 混合物 2 μ I,RTlOXBuffer2 μ 1、AMV 逆轉錄酶(λ 5 μ I 和 RNasin0.5 μ I (均來源于 Promege 公司，http://www.promega.com.cn)。弓I物設計如下:Mi 130a:5’ -GTCGTATCCAGTGCGCUCUUUUACAUUCUCUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQ IDNO:15)，Mi 145:
5’ -GTCGTATCCAGTGCGCAGUUUCCAGGAAUCCCUUAATTGCACTGGATACGACCGCATT-3’ (SEQID NO: 16).所有反應在 Gene Amp PCR System9700 (Applied Biosysytem 公司，http://www.appliedbiosystems, com)中完成，U6 作為內參照。29 μ L Real-Time PCR 的反應系統包含:25 μ L2 X Real qPCR MasterMix (包含 Modified DNA 聚合酶、SYBR Green 1、Optimized PCR buffer,5mM MgCI2、包含 dUTP的 dNTP 混合物。均來自于 Genencor 公司，http://www.genencor.com), I μ L 正引物、IuL 逆引物(Mil30a:F5，-CGGGGCAGTGCAAATGTTAAAA-3’ (SEQ ID NO: 17)，Mil45:F5’ -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCC-3’ (SEQ IDNO:18)，common:R5’ -AGTGCGAACTGTGGCGAT-3’(SEQ ID N0:19)和 2yL cDNA 模板。使用 ABISt印one Plus Real-Time PCR (ABI 公司，http: / / www.appliedbiosy stems, com)來計算 Ct 值(循環閾值)。上述實驗重復3次，以取得Ct平均值。差別用雙側的方差分析。組間比較采用Bonferroni法，當P〈0.05認為有統計學差異。上述統計過程利用SAS8.02軟件完成。結果:Real-Time PCR結果提示被plentiV6-oBMP_2轉染后，SMSCs中與軟骨分化相關的MicroRNA，M1-130a和M1-145的含量均顯著升高(圖11)。對于Mi_130a，以空白對照組的SMSCs作為基線，實驗組為plentiV6-oBMP-2 (+)，而陰性對照組為plentiV6-oBMP-2(-)0完全對照組取自正常兔半月板組織。從結果圖上可見，實驗組為基線的7.8倍，實驗對照組為1.2倍，完全對照組為15.5倍。統計學分析表明F值為5822.03(P〈0.001)，表明各組間存在有差異，進一步的Bonfeironi分解顯示，實驗組和基線組差別小于0.05，而實驗對照組和基線組差別大于0.05。
對于M1-145，實驗組為基線組的4倍，實驗對照組為1.2倍，完全對照組為4.7倍。F值為135.52 (P〈0.001)，表明組間存在差異，進一步的Bonferroni分解顯示，實驗組和基線組差別小于0.05，而實驗對照組和基線組差別大于0.05。上述兩結果顯示，被plentiV6-oBMP-2轉染后，SMSCs內的MicroRNA含量接近正常半月板組織，未轉染BMP-2組和基線組幾乎都無差別。提示BMP-2可能在向軟骨分化的過程中起關 鍵性作用。
權利要求
1.一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，包括一個將滑膜間充質干細胞分離、培養的步驟；其特征在于:還包括一個構建重組質粒pFUGff-oBMP-2的步驟，一個制備轉染慢病毒的病毒液的步驟，一個將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟，在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，首先根據BMP-2基因設計引物，通過逆轉錄反應擴增BMP-2基因，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW質粒和BMP-2基因重組，構建重組質粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，利用所述的重組質粒pFUGW-oBMP-2加上包裝質粒，共同構建轉染慢病毒，然后再加入緩沖液培養、孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液，在所述的將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質干細胞和解凍的轉染慢病毒的病毒液混合，將混合物離心、培養40-52小時，然后將上述的培養物加入不完全成軟骨誘導培養液誘導培養液中誘導，誘導14天以上即可獲得軟骨細胞。
2.如權利要求1所述的一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在于:在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，首先擴增重組質粒pFUGW-oBMP-2、包裝質粒psPAX2和pMD2.G，提純濃縮；其次將293T細胞的細胞密度調至107，放入培養瓶中培養，所述的培養瓶內含有DMEM培養基，所述的培養基中還包含有青霉素G、鏈霉素、小牛血清、聚賴氨酸，所述的青霉素G在DMEM培養基中的濃度為100U/ml、所述的鏈霉素在DMEM培養基中的濃度為100 μ g/ml、所述的小牛血清在DMEM培養基中的質量百分比濃度為10%、所述的聚賴氨酸DMEM培養基中的濃度為5%，將293T細胞于培養瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的緩沖液，孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液。
3.如權利要求1所述的一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在于:在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，將oBMP_2的cDNA用Agel和Nhel雙酶切，同時，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW用Agel和Nhel雙酶切，然后加入T4 DNA反應得到pFUGW-oBMP-2重組質粒。
4.如權利要求1所述的一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在于: 在擴增BMP-2基因的過程中，所述的5’端的引物序列如SEQID NO:1所示,所述的3’端的引物序列如SEQ ID NO:2所示。
5.如權利要求1所述的一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，其特征在于:所述的不完全成軟骨誘導培養液培養液是一個含TGF-β3、地塞米松、2-磷酸-抗壞血酸、脯氨酸、丙氨酸、1:100稀釋的ITS+Premix溶液的H-DMEM培養液；其中，在所述的H-DMEM培養液中，TGF-β 3的濃度為10 ng/mL、地塞米松的濃度為I X 1(Τ mol/L、2-磷酸-抗壞血酸的濃度為50 μ g/mL、脯氨酸的濃度為40 μ g/mL、丙氨酸的濃度為100 μ g/mL、所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中含有胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸、牛血清白蛋白、亞油酸，在所述的1:100稀釋的ITS+Premix溶液中，胰島素的濃度為6.25 μ g/mL、轉鐵蛋白的濃度為6.25 μ g/mL、亞硒酸的濃度為6.25 ng/mL、牛血清白蛋白的濃度為1.25 mg/mL、亞油酸的濃度為5.35 mg/mL。
全文摘要
本發明一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，包括一個將滑膜間充質干細胞分離和培養的步驟，一個構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟，一個制備轉染慢病毒病毒液的步驟，一個利用轉染慢病毒病毒液轉染滑膜間充質干細胞的步驟，在制備轉染慢病毒病毒液的步驟中，利用重組質粒pFUGW-oBMP-2和包裝質粒共同構成轉染慢病毒，在利用轉染慢病毒病毒液轉染滑膜間充質干細胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質干細胞，和轉染慢病毒的病毒液混合，然后加入不完全成軟骨細胞誘導培養液中誘導后得到軟骨細胞。本發明證明經轉染慢病毒轉染的SMSCs足夠安全，在體外可自發向軟骨分化。
文檔編號C12N15/867GK103146755SQ201310065020
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者符培亮, 張雷, 丁喆如, 吳海山, 吳宇黎, 叢銳軍, 陳松 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學