克隆人自體基因的胚胎干細胞定向誘導成體細胞分化的制作方法

專利名稱：克隆人自體基因的胚胎干細胞定向誘導成體細胞分化的制作方法
技術領域：
本發明涉及采用核移植技術克隆人自體基因的胚胎，建立胚胎干細胞系和體外定向誘導人成體細胞分化技術。
背景技術：
美國《科學》雜志上列出了2002年值得關注的六大熱門科技領域，干細胞研究位于首位。未來搶占生命科學制高點的將會是干細胞及組織工程技術。當前種子細胞來源不足是限制細胞、組織工程發展的瓶頸問題，而免疫排除反應則是限制細胞、組織和器官移植成功的一個重要原因。隨著“治療性克隆”技術的逐步成熟，采用體細胞克隆技術，可以從人體細胞中克隆出早期胚胎，然后從中提取胚胎干細胞。這種細胞具備分化成人體各種細胞的能力，利用它有可能在體外培育出與病人遺傳特征完全相同的細胞、組織或器官，將同時解決人類細胞、組織和器官移植所面臨的供體嚴重缺乏和排斥反應兩大難題。
1997年英國科學家應用核移植克隆胚胎技術，培育出了世界上第一只用體細胞克隆綿羊(多利)，從此掀起了動物克隆的浪潮。1998年美國科學家不僅成功克隆鼠，而且將成年牛、羊、豬、猴和大鼠等的成纖維細胞核移植到去核的牛卵母細胞中，有效地使體細胞重新編程，獲得重構胚。這些技術的成功極大促進了異種間核移植克隆技術的發展。采用核移植克隆技術生產囊胚，從囊胚內細胞團(inner cell mass，ICM)中獲取胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES細胞)已成為國內外學者所關注的熱門技術。因為克隆的胚胎干細胞與自然受精而產生的胚胎干細胞具有相似的無限擴增能力和在體內外分化的多能性，可分化成為人體200多種細胞類型，從而形成機體的任何組織和器官。隨著此項技術的不斷進步，在體外將產生全新的自體基因的細胞、組織和器官，用來取代病變的細胞、組織、器官，治療目前不能治療的許多疾病。
ES細胞是哺乳動物胚胎發育早期的一類未分化的二倍體細胞，研究表明它具有以下特性(1)ES細胞在不分化前提下，通過體外培養可大量擴增。(2)ES細胞是一種具有很高分化潛能的細胞，可以分化形成各種類型的細胞。應該說ES細胞是具有全能分化特性的細胞。ES細胞的定向分化是目前組織工程領域研究的重點。(3)ES細胞具有種系傳遞能力。因此胚胎干細胞就成為研究哺乳動物早期胚胎發生、基因表達調控、組織形成及遺傳病和癌癥發生和治療等工作的理想模型。
第一個未分化的小鼠ES細胞系是1981年由英國的Evans和Kaufman成功從延遲著床的囊胚內細胞團中分離獲得。1995年美國的Thomson等從恒河猴的囊胚中分離建立了世界上第一株靈長類動物ES細胞，以后經過不懈地努力探索，直到1998年Thomson等從體外受精卵囊胚中分離到了人類的ES細胞，在科學界引起了轟動，從此人類ES細胞研究掀起了高潮，研究的焦點轉向了調控其分化、細胞治療和組織工程種子細胞等研究。
建立ES細胞系時對體外培養條件要求十分嚴格，當培養條件有變化時，ES細胞就會分化。如果將胚胎干細胞進行懸浮培養就會形成“類胚體”(embryonic body，EB)，它是進一步定向誘導分化的前提，對類胚體進一步誘導可產生各種不同的細胞。近年來，小鼠或人的ES細胞已經被成功誘導分化為三胚層來源的多種組織細胞，如造血細胞、心肌細胞、肌肉細胞、軟骨細胞、骨細胞、神經細胞、胰島素分泌細胞、血管和內皮細胞等。1999年Hole等先后誘導小鼠ES細胞體外分化出紅系、粒-單系、巨核系、淋巴細胞系等；2000年Reubinoff等成功誘導ES細胞發育成造血干細胞。1994年Rohwedel等誘導出肌肉細胞。Fraichard等發現EB中表達神經細胞和神經膠質細胞的共同前體細胞的特有標志-巢蛋白。ES細胞體外可以定向分化為幾乎所有類型的組織細胞，并且具有正常的核型，未分化狀態下能夠長時間的保持增殖能力，為體外大量擴增提供了可能。由于ES細胞具有無限增殖和多向分化的雙重能力，人ES細胞可望為人類器官重建提供無限的種子細胞來源。
細胞、組織、器官移植性治療是個性治療的原則，異種、同種異體干細胞用于臨床會引起免疫排斥反應。其主要原因是組織相容性復合體(MHC)不同。因此干細胞的來源與數量是細胞治療最關鍵的問題，干細胞組織工程技術的發展和完善，將使人們能用上自己基因的干細胞或干細胞衍生的新組織器官，來替代病變或衰老的組織和器官，治療目前不能治療的多種疾病。所以，目前開發一種能提供相同組織特異性的人胚胎干細胞的技術勢在必行。為此克隆人自體基因的ES細胞誘導定向目的干細胞分化移植治療，或克隆人組織、器官工程是解決細胞、組織移植治療的根本，是21世紀國際研究焦點。
經文獻查閱和專利檢索，目前雖然J.羅貝爾等(CN 1299408A，2001年6月13日公開)通過異種間核移植得到干細胞樣細胞集落，但未對細胞集落性質進行鑒定，所以算不上干細胞系。黃禹錫(CN 1304444A，2001年7月18日公開)通過種間核轉移技術生產人類克隆胚胎可以得到人類胚胎干細胞，但未得到胚胎干細胞系。黃紹良等(CN 1387565A，2003年6月18日公開)建立的胚胎干細胞系是利用受精卵囊胚內細胞團傳代培養而獲得。在本發明之前未見通過核移植克隆技術成功建立人自體基因的胚胎干細胞系的報道，更無將核移植克隆的人自體基因胚胎干細胞定向誘導分化為造血干細胞、神經細胞、成骨細胞、胰島細胞、心肌細胞等人體細胞的報道。
發明目的和意義胚胎干細胞具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，它所產生的子代細胞與其具有相同的基因型和表現型。作為“種子細胞”的干細胞可以通過細胞、組織工程技術在體外發育成人體各種組織器官中的細胞，供臨床移植所需，并可作為基因療法的靶細胞用于治療和研究。要真正使胚胎干細胞的研究和應用進入臨床領域，就必須建立人類胚胎干細胞系，獲得能在體外大量增殖的人胚胎干細胞，我們才有足夠的“種子”和“材料”為細胞治療、器官移植、基因治療和進行各類相關研究提供源源不斷的供體。
采用核移植克隆技術創造與病人組織遺傳構成完全相同的細胞，建立人胚胎干細胞系，在體外可定向誘導分化為人體所需要的全新的、無免疫異原性的細胞、組織和器官，用來取代病變的細胞、組織和器官，可避免移植排斥反應的發生，具有良好的臨床應用前景。此技術平臺的建立為人類治療性克隆技術的發展做出突出貢獻。
發明概述采用體細胞核移植技術克隆人自體基因的胚胎，建立胚胎干細胞系和體外定向誘導人成體細胞分化，可同時解決人類細胞、組織和器官移植所面臨的供體嚴重缺乏和排斥反應兩大難題。
我們從需要救治的病人身上提取一個體細胞，然后將該細胞的遺傳物質植入一個去核卵母細胞內，培養發育形成囊胚。從囊胚內細胞團中提取到的胚胎干細胞，建立胚胎干細胞系，大量擴增的胚胎干細胞在一定條件下可定向誘導分化為人體所需要的，具有相同組織特異性的神經細胞、造血干細胞、成骨細胞、胰島細胞和心肌細胞等成體細胞，臨床移植不會產生移植排斥反應。另外，胚胎干細胞系可用于基因治療等多種類型研究。
申請專利技術1、建立克隆人自體基因的胚胎干細胞技術2、建立克隆人自體基因的胚胎干細胞系3、克隆人自體基因的胚胎干細胞定向誘導人成體細胞分化(1)定向誘導神經細胞分化技術(2)定向誘導造血干細胞分化技術(3)定向誘導成骨細胞分化技術(4)定向誘導心肌細胞分化技術(5)定向誘導胰島細胞分化技術

發明內容
一、構建人自體基因的胚胎干細胞1、卵細胞的獲得與處理經促排卵獲得人或動物(兔、牛、鼠等)卵母細胞，將卵母細胞放于少量M199培養基中，加入透明質酸酶消化，用毛細玻璃管輕輕吹幾次，將細胞周圍的顆粒層去除，洗去卵母細胞上的透明質酸酶待用。
2、人供體細胞的來源與處理取人皮膚成纖維細胞、骨髓單個核細胞、外周血單個核細胞，用1640培養液+10％胎牛血清+100IU雙抗培養，在37℃、5％CO2培養箱中培養待用。
3、核移植與融合細胞的體外培養將處理后的卵母細胞和供體細胞置入含細胞松弛素B199細胞培養基中，放入5％CO2溫箱中孵育10分鐘，在紡錘體觀測儀觀察下用針取出極體和M期的染色體后，將供體單個核細胞沿著去核時的通道插入去核的卵母細胞的卵周隙內，經過電融合后，放入含15％胎牛血清的199細胞培養基中，在5％CO2，37℃溫箱中培養形成囊胚。囊胚內細胞團含有胚胎干細胞。
二、建立人自體基因的胚胎干細胞系1、囊胚內細胞團的分離采用胰蛋白酶消化法、物理方法或免疫方法去除囊胚透明帶，取出內細胞團(ICM)，將ICM分散成單個細胞進行培養。
2、飼養層的準備將傳代培養第3-5代的單層小鼠胚胎成纖維細胞，用絲裂霉素C處理后，培養于明膠水溶液處理過的培養瓶中，待細胞貼壁長成單層細胞后，置培養箱中備用。
3、人自體基因胚胎干細胞的培養將ICM分散得到的單個胚胎干細胞或細胞小團塊，接種在小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，在適宜條件下培養、觀察，培養2天可長出小細胞集落，培養至10天集落變大，可進行傳代培養。挑出克隆，機械分離，接種到新的飼養層上；待長出多個克隆后，用分散酶消化后再傳代培養。
4、胚胎干細胞的鑒定。通過堿性磷酸酶染色、胚胎干細胞特異性表面標志檢測、染色體核型分析、線粒體基因鑒定和STR-DNA序列分析，對在體外連續傳30-80代仍保持未分化狀態的細胞進行鑒定。
5、細胞分化實驗。ES細胞是體外研究誘導分化的較理想模型。在不同誘導因子、微環境的作用下，干細胞可以向三胚層來源的多種組織細胞分化。干細胞的多向分化潛能檢測采用擬胚體形成、畸胎瘤形成和體外定向誘導造血干細胞、神經干細胞、成骨細胞、心肌細胞和胰島細胞分化實驗證明。
三、定向誘導人自體基因的胚胎干細胞向成體細胞分化①擬胚體形成采用機械法收集擴增培養20代以上的人自體基因的胚胎干細胞，在體外含有擬胚體形成溶液(含有非必需氨基酸、2-巰基乙醇、谷氨酰胺和甲基纖維素)懸浮培養7天后形成擬胚體。將擬胚體轉入細胞培養板內進行貼壁培養，供定向誘導人體不同組織干細胞分化。
②定向誘導分化研究擬胚體貼壁后應用特定條件培養液進行定向誘導分化，人自體基因胚胎干細胞可發育為造血干細胞、神經干細胞、成骨細胞、心肌細胞和胰島細胞等。
具體實施祥述一、核移植克隆人自體基因的胚胎1、家兔促排卵與卵細胞的處理選擇體重在3kg、兔齡6個月的健康雌性家兔1只，注射100IU/mL孕馬血清，第五天注射75IU/mL HCG后將家兔空氣栓塞致死，無菌操作取出兔輸卵管，用含15％胎牛血清的M199沖洗輸卵管，將獲得的兔卵母細胞，用1∶30000的透明質酸酶消化處理，用毛細玻璃管輕輕吹幾次，將細胞周圍的顆粒層去除，洗去兔卵母細胞上的透明質酸酶待用。
2、人供體細胞的處理取志愿者外周血2ml，用淋巴細胞分離液進行分離，將獲取的淋巴細胞用1640培養液+10％胎牛血清+100IU雙抗培養，在37℃5％培養箱中待用。
3、核移植與融合細胞體外培養將處理后的兔卵母細胞與淋巴細胞置入含7.5μg/ml細胞松弛素B199細胞培養基中，放入5％CO2溫箱中孵育10分鐘，用10μm外徑的針在顯微Spindle View操作儀觀察下取出極體和M期的染色體，再沿著去核時的通道將供體單個核細胞插入去核的兔卵母細胞的卵周隙內，然后將卵細胞放于6-DMAP中，采用融合儀進行電融合，條件設為140-200v/cm，脈沖2次，持續時間80-160μs，融合后的細胞用M199沖洗后，放入融合液中于培養箱中放置2h-4h。融合后的卵細胞用M199+10％胎牛血清培養，6-8天后，發育到囊胚。囊胚的內細胞團含有胚胎干細胞。
二、小鼠胚胎成纖維細胞飼養層細胞的培養和處理(1)飼養層細胞的培養取12天的昆明鼠胚胎，去除頭、尾、四肢和內臟，用PBS洗盡血跡，剪成碎塊，吸于離心管中。加入消化液0.25％胰蛋白酶2ml，置37℃消化5min或4℃消化過液，加入含5％胎牛血清(FBS)的DMEM液，吹打分散細胞。室溫靜置10min，去上清，離心洗滌2次，接種于盛有含10％FBS的DMEM培養液的培養瓶中。在37℃，5％CO2、飽和濕度培養箱中培養。
(2)飼養層細胞的處理①第3-5代的小鼠胚胎成纖維細胞生長連成一片時，換成含10μg/ml的絲裂霉素C(MMC)培養液，培養箱中作用2-3h。或用γ射線照射，照射量為30-100Gy。②將0.1％明膠水溶液加入培養瓶內，以能覆蓋培養瓶表面即可，在室溫靜置2h以上。使用前，吸棄多余的明膠水溶液。用PBS洗滌1次。③棄含有MMC的飼養層細胞培養液。用PBS洗滌培養物5次。若用γ射線處理，則省去PBS洗滌。④消化飼養層細胞。用培養液制備成密度為3×105個/ml的細胞懸液，種植到預先處理過的培養瓶(皿)內。⑤37℃，5％CO2、飽和濕度培養箱中培養。⑥待細胞貼壁后進行觀察。如發現細胞過稀，須補加處理過的細胞，以保證細胞能連成一片而沒有間隙。⑦將制備好的飼養單層細胞放置在培養箱中備用。在5天內使用，使用前要更換成胚胎干細胞培養液。
三、人自體基因胚胎干細胞的傳代培養。
①37℃條件下，0.25％胰蛋白酶消化去除囊胚透明帶，取出內細胞團(ICM)，培養液洗滌3次。②將ICM分散成單個細胞或小團塊，接種在小鼠胚胎成纖維細胞飼養層上，胚胎干細胞培養液高糖DMEM培養基、20％FBS、0.1mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)、10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)、1％非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5ng/mlbFGF、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。37℃，5％CO2、飽和濕度培養箱中培養。③每天觀察，2d后，見胚胎干細胞小集落出現；3-4d集落進一步增大；6-10天，可消化進行傳代。具體步驟待長出單個細胞克隆時，挑出克隆，機械分離為小的細胞團，接種到新的飼養層上；待長出多個克隆后，用分散酶消化2-3min，或用0.1％膠原酶消化8min，離心收集細胞沉淀，進行培養。④胚胎干細胞呈集落狀(島嶼狀)生長，邊緣清楚，表面平滑，結構致密，隆起生長，細胞之間界限不清楚。消化成單細胞后可見細胞小而圓，核大，胞漿小。如果胚胎干細胞分化時，細胞集落變得扁平，邊緣不清楚，表面粗糙，見有較大內胚層樣結構，堿性磷酸酶檢查呈陰性。這類細胞已經失去干細胞特性，應終止培養。
四、胚胎干細胞系的鑒定。
取體外連續傳代培養20代，仍保持未分化狀態的細胞進行鑒定①采用STR-DNA分析技術鑒定細胞DNA提取胚胎干細胞和供體細胞DNA，經過STR-DNA序列分析表明構建的胚胎干細胞具有與供體細胞相同的DNA；②核型鑒定取對數生長期的細胞，加入0.4μg/ml秋水仙素培養6h，用KCI10.5ml在37℃條件下孵育30min，經丙醋酸膨脹及甲醛固定，Giemsa染色。在油鏡下觀察，同時進行染色體顯帶分析。染色體核型為正常二倍體核型XY型；③線粒體基因特異PCR鑒定人、兔細胞線粒體PCR引物設計A；人細胞線粒體PCR引物F5’-ATACCCATGACCAACCTCCTACTCCTCATT-3’(3308-3346)B5’-CTGCTCGCAGTGCGCCGATCAGGGCGTAGT-3’(3713-3684)
B；兔細胞線粒體PCR引物F5’-TTAGCCATAGCATTCCTCACCTTAGTCGAA-3’(2791-2820)B5’-GAGGATGCATAGGAGGATAATTGCAAGTGT-3’(3210-3181)行PCR擴增后，凝膠電泳，可見胚胎干細胞中同時存在人和兔線粒體基因，人405bp為陽性，兔380bp為弱陽性。④堿性磷酸酶(AKP)染色。未分化的胚胎干細胞除具有典型的克隆形態外，表面標記AKP呈強陽性。采用偶氮偶聯法。收集幾代胚胎干細胞涂片，10％冷甲醛—甲醇液固定30s，加入新鮮基質液于37℃水浴處理20min，然后室溫孵育10min，流水沖洗，1％亮綠復染2min，流水沖洗，晾干鏡檢，細胞染紫黑色或紫黑色顆粒為陽性。⑤干細胞特異性表面標志物的檢測采用免疫組織化學染色法，檢測細胞特異性表面標志物。結果為SSEA-1陰性SSEA-3和SSEA-4陽性表明是處于未分化狀態的人胚胎干細胞；TRA-1-60陽性證明細胞為多能干細胞。
五、細胞分化實驗。
1、畸胎瘤形成人ES細胞具有分化為三胚層的潛能。將分離的1×106人ES細胞注射到免疫缺陷小鼠體內，小鼠在注射部位長出了包括內胚層、中胚層、外胚層結構的畸胎瘤。組織活檢發現這些腫瘤有浸潤能力。
2、擬胚體形成采用機械法收集擴增培養的ES細胞系，在體外含有擬胚體形成溶液(含有非必需氨基酸、2-巰基乙醇、谷氨酰胺和甲基纖維素)懸浮培養4-7天后形成擬胚體(Embryoid body，EB)。將擬胚體轉入細胞培養板內進行貼壁培養，供定向誘導人體不同組織干細胞分化。
3、定向誘導神經細胞分化定向誘導神經細胞分化培養液GXBZX-A-1(20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF及2％ B27而不含血清)。GXBZX-A-2(是GXBZX-A-1培養液中去除生長因子，加入10％血清)。
定向神經干細胞分化將擬胚體挑出，吹散后種植于底部鋪有蓋薄片的神經干細胞完全培養液GXBZX-A-1，進行選擇性培養7~14天，待細胞出現神經干細胞克隆球形態后，在顯微鏡下挑出少部分細胞球進行免疫細胞化學鑒定，顯示表達神經干細胞標志物Nestin。
定向神經細胞分化將以上培養體系更換為神經細胞培養液GXBZX-A-2(GXBZX-A-1培養液中去除生長因子，加入10％血清)進行分化培養，待出現神經細胞形態后取出細胞爬片應用MAP2單抗進行免疫細胞化學鑒定，神經細胞標志物MAP2陽性。
4、定向誘導造血干細胞分化定向誘導造血細胞分化培養液GXBZX-B-1(15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlVEGF，DMEM添加體積到1.5ml)。GXBZX-B-2(DMEM中含有15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlIL-3、10ng/mlIL-6、2IU/mlEPO、20％胎肝組織液)。
取生長狀態良好的人自體基因胚胎干細胞，分散種植在GXBZX-B-1培養基37℃，5％CO2培養箱進行擬胚體培養，每3天換液一次，2次換液后，補加10ng/ml IL-3、10ng/ml IL-6、2IU/mlEPO，待形成擬胚體后，將擬胚體挑出吹散后種植于GXBZX-B-2培養基，8天后開始每2天鑒定CD34、CD133、AKP和瑞氏染色觀察細胞形態。免疫細胞化學鑒定示CD34、CD133陽性。
5、定向誘導成骨細胞分化定向誘導人成骨細胞分化培養液GXBZX-C即采用包含成骨添加成分(osteogenicsupplements)、抗壞血酸(50mg/L)、地塞米松(1×10-8mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)并且含15％胎牛血清的α-MEM礦化培養基將擬胚體挑出吹散后種植于成骨定向誘導GXBZX-C細胞培養基內進行貼壁培養，7天后用倒置顯微鏡實時觀測誘導中的細胞形態學變化。人成骨細胞，呈現多偽足樣或鱗片樣表面存在鈣鹽顆粒沉積，具有鈣結節形成，茜素紅染色陽性，S-P法免疫組化染色示骨組織中的主要表達膠原蛋白成分-I型膠原以及骨組織中的主要非膠原蛋白成分、晚期成骨標志物—骨鈣素呈陽性。
6、定向誘導胰島素分泌細胞分化擬胚體挑出吹散后種植于覆蓋有左旋賴氨酸和纖維素的培養板中，用添加有胰島素、人轉鐵蛋白和硒酸鈉的無血清培養基中培養6天。此期其它細胞死亡，nestin陽性細胞比例增加。細胞在N2無血清培養基中培養，N2培養基中含10ng/ml bFGF和B27添加劑，促進細胞分裂擴增6天后，細胞在含有B27、10mM尼可酰胺和10uM LY294002的N2培養基中培養至少6天，LY294002可以促進分化細胞的生長。對分化細胞進行免疫細胞化學鑒定，顯示Nestin陽性的胰島前體細胞，并表達胰島細胞早期分化標志PDX-1。在培養時加入HGF/activin A，在2.5mM葡萄糖濃度下胰島前體細胞形成細胞團，并表達胰島素、胰高血糖素和GLP-1。
7、定向誘導心肌細胞分化擬胚體形成后，添加5-氮雜胞苷，二甲基亞砜作為誘導分化劑誘導向心肌細胞進行定向分化；在誘導后4-13天密切觀察自發搏動的心肌細胞的出現并拍照記錄。比較誘導前后發育早期心肌細胞特異性轉錄因子和蛋白表達的變化(包括量和類型)如，半定量RT-PCR和Western blot檢測GATA4，Nkx2.5和MEF2C；MLC-2v，cTnI和ANP。在誘導后不同時間取細胞進行心肌細胞鑒定(免疫熒光標記)。如，cTnT，β-MHC，ANP，Cx43。采用β-MHC和ANP作為標記物，采用流式細胞儀檢測自體基因胚胎干細胞的心肌分化率為20％。
應用前景和展望通過體細胞核移植技術構建的與病人細胞核基因完全相同的ES細胞，由此而建立的ES細胞系可望為人類組織器官重建提供無限的種子細胞來源，經體外定向誘導分化獲得大量自體同源組織細胞，可從根本上解決組織工程種子細胞來源不足和移植排斥反應問題，對臨床醫學有著極其重要的應用開發價值。如果能將人胚胎干細胞及其衍生的細胞、組織等成功應用于臨床，許多疑難疾病(如帕金森病、阿爾茨海姆病、糖尿病等)都將根治，干細胞、組織工程技術使再生醫學得到飛速發展，成為21世紀生命科學研究領域的焦點之一，并標志著醫學將走出器官移植的范疇，步入再生組織和器官的新時代。治療性克隆的科學價值、醫學應用價值和市場前景不言而喻。
權利要求
1.克隆人自體基因的胚胎干細胞定向誘導人成體細胞分化技術主要包括以下步驟(1)、采用體細胞核移植克隆技術構建人自體基因的胚胎干細胞；(2)建立人自體基因的胚胎干細胞系；(3)人胚胎干細胞系的鑒定；(4)人自體基因的胚胎干細胞定向誘導成體細胞分化。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，核移植所采用的供體細胞為人皮膚成纖維細胞、血液單個核細胞、骨髓有核細胞等。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，核移植所采用的受體細胞為去極體和紡錘體的動物(兔、牛和鼠等)卵母細胞和人卵母細胞。
4.如權利要求1所述的人自體基因的胚胎干細胞系的建立方法，其特征在于培養液組成為高糖DMEM培養基、20％FBS、0.1mmol/L β-巰基乙醇(β-ME)、10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)、1％非必需氨基酸、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸鈉、5ng/ml bFGF、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所建立的人胚胎干細胞系含人自體基因。
6.如權利要求5所述，其特征在于，所獲得的胚胎干細胞細胞核基因與人供體細胞的細胞核基因完全相同。
7.如權利要求6所述，其特征在于，所采用的鑒定技術為DNA-微衛星序列測定。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，異種間核移植構建的人胚胎干細胞線粒體含有人和動物(兔、牛或鼠等)線粒體DNA兩種成分。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，人自體基因的胚胎干細胞體外在一定條件下可定向誘導分化成為各種人成體細胞。
10.如權利要求9所述的定向誘導分化為人成體細胞主要包括神經細胞、造血干細胞、成骨細胞、胰島細胞和心肌細胞等機體細胞。
11.如權利要求9所述的定向誘導分化過程中，其特征在于，擬胚體形成是進一步定向誘導分化的前提。
12.如權利要求11所述，其特征在于，擬胚體形成所用培養液含有非必需氨基酸、2-巰基乙醇、谷氨酰胺和甲基纖維素。
13.如權利要求11所述，其特征在于，擬胚體培養采用懸浮培養。
14.如權利要求13所述，其特征在于，懸浮培養采用低粘附細胞培養板或用明膠處理培養板底阻止細胞貼壁生長。
15.如權利要求10所述，定向誘導神經細胞分化，其特征在于，條件培養基有兩組。
16.如權利要求15所述，其特征在于，定向神經干細胞分化條件培養基為GXBZX-A-1(20ng/mlEGF、20ng/ml bFGF及2％B27，不含血清)。
17.如權利要求15所述，其特征在于，神經干細胞定向神經細胞分化條件培養基為GXBZX-A-2(GXBZX-A-1培養液中去除生長因子，加入10％胎牛血清或臍血血清)。
18.如權利要求10所述，定向誘導造血干細胞分化，其特征在于，條件培養基有兩組。
19.如權利要求18所述，其特征在于，條件培養基，GXBZX-B-1為15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlVEGF，DMEM添加體積到1.5ml。GXBZX-B-2為DMEM中含有15％FBS、10ng/mlSCF、10ng/mlIL-3、10ng/mlIL-6、2IU/mlEPO、20％胎肝組織液。
20.如權利要求10所述，定向誘導成骨細胞分化，其特征在于，條件培養基GXBZX-C為包含成骨添加成分(osteogenic supplements)、抗壞血酸(50mg/L)、地塞米松(1×10-8mol/L)、β-甘油磷酸(10mmol/L)，并且含15％胎牛血清的α-MEM礦化培養基。
21.如權利要求10所述，定向誘導胰島素分泌細胞分化，其特征在于，條件培養基為用添加有胰島素、人轉鐵蛋白和硒酸鈉的無血清培養基。
22.如權利要求10所述，定向誘導心肌細胞分化，其特征在于，條件培養基為基礎培養基中加有5-氮雜胞苷，二甲基亞砜作為誘導分化劑。
全文摘要
克隆人自體基因的胚胎干細胞定向誘導成體細胞分化技術涉及采用體細胞核移植技術克隆人自體基因的胚胎，建立胚胎干細胞系和體外定向誘導人成體細胞分化技術。解決人類細胞、組織和器官移植所面臨的供體嚴重缺乏和排斥反應兩大難題。采用核移植克隆技術將人體細胞的細胞核轉移到健康人或動物的去核卵母細胞中，經融合激活后，培養發育至囊胚。取囊胚內細胞團，可得到與供者同基因的胚胎干細胞。建立胚胎干細胞系，大量擴增的胚胎干細胞在一定條件下可定向誘導分化為人體所需要的，具有相同組織特異性的神經細胞、造血干細胞、成骨細胞、胰島細胞和心肌細胞等成體細胞，臨床移植不會產生移植排斥反應。另外，胚胎干細胞系可用于基因治療等多種類型研究。
文檔編號C12N5/08GK1778906SQ20041009089
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月17日 優先權日2004年11月17日
發明者李建遠, 王海燕, 劉雪霞, 王延偉, 劉運祥 申請人:李建遠, 王海燕, 劉雪霞