硫酸軟骨素abc酶融合蛋白、其編碼基因以及其制備方法和應用的制作方法

硫酸軟骨素abc酶融合蛋白、其編碼基因以及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白、其編碼基因以及其制備方法。此外本發明還涉及一種生產低分子量硫酸軟骨素A，B或C的方法。本發明的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白采用一步純化的方法，純化方法簡單，并且得到高純度的ChSase?ABC。得到的ChSase?ABC具有高酶活，能夠用于生產硫酸軟骨素，并且硫酸軟骨素的生成條件不高、方法簡便且容易控制。
【專利說明】硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白、其編碼基因以及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和發酵工程領域中一種硫酸軟骨素酶ABC融合蛋白及其編碼基因以及其制備方法和應用。此外本文還提供了純化硫酸軟骨素酶ABC融合蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或 chondroitin sulfateyase,簡稱為“ChSase”)是一類能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖(ADi及寡糖)的裂解酶。
[0003]隨著對ChSase的深入研究，發現硫酸軟骨素酶ABC(簡稱為“ChSase ABC”)有著廣泛的應用價值。科研人員利用ChSase ABC檢測硫酸軟骨素和生產低分子量硫酸軟骨素。鮑倫軍，楊建成等用ChSase ABC酶解-高效液相色譜的方法檢測魚翅中的透明質酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外檢測波長為226nm，檢測到魚翅中透明質酸的質量分數為0.86-1.96% (鮑倫軍等.魚翅中硫酸軟骨素的酶解-高效液相色譜法測定.色譜，2002, 20(6):557-559)。朱昱寧，敖雷等同樣用酶解高效液相色譜的方法檢測CS的含量，采用Ultimate XB-NH2柱，紫外檢測波長為232nm，流動相為醋酸鈉緩沖液(pH5.6)-乙腈(950:50)，流速為1.0mL/min，此色譜條件可將CSA，B, C分開(朱昱寧等.酶解高效液相色譜法測定硫酸軟骨素的含量.中國生化藥物雜志，2012，33(6):827-829)。
[0004]另外ChSase ABC在臨 床應用方面也有很大的作用。在緩解視網膜變性方面，可降解硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中樞神經系統(CNS)損傷后膠質瘢痕的重要組分，可抑制神經軸突再生。CSPGs主要通過糖氨多糖鏈抑制神經再生，因此去除GAG或者干擾其合成均可使軸突再生。黃玉苗，高朋芬等通過玻璃體腔注射ChSase ABC酶，免疫熒光法觀察CSPGs的表達，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測多功能蛋白聚糖mRNA的表達，檢測光感受器凋亡情況，結果表明Chase ABC能通過降解變性大鼠視網膜異常沉積的CSPGs，抑制光感受器細胞的凋亡，從而促進損傷網膜的修復(黃玉苗等.硫酸軟骨素酶緩解視網膜變性大鼠光感受器細胞凋亡.揚州大學學報，2012，33 (4): 19-23.)。
[0005]在提高后肢運動能力方面，ChSase ABC可以修復脊柱損傷。脊髓損傷是脊柱骨折的常見并發癥，可致肢體癱瘓，大小便失禁及呼吸肌癱瘓等一系列嚴重并發癥，脊髓損傷后神經再生和功能修復，是當今醫學領域中的一大難題，ChSase ABC可以降解CSPGs。孫永新，劉寧等利用ChSase ABC聯合高壓氧預處理對成年大鼠脊髓損傷后不同時期后肢運動功能及腓腸肌運動終板內乙酰膽堿酯酶(AChE)含量的影響，來檢測ChSase ABC的作用。結果表明高壓氧預處理可以改善大鼠患肢的運動功能和提高AChE的活性，聯合ChSase ABC作用更強(孫永新華等.硫酸軟骨素酶ABC聯合高壓氧預處理對脊髓損傷大鼠后肢運動功能的影響.解剖科學進展，2012，18(6):526-529.)。Nicole J.Tester 等用 ChSase ABC 來治療受傷的貓，ChSase ABC修復了貓的脊柱損傷，提高了貓的運動能力(參見=Nicole J.etal.Chondroitinase ABC improves basic and skilled locomotion in spinal cord injuredcats.Experimental Neurology, 2008, 209(2): 483-496)。
[0006]近年來，Mark R Brown等經研究發現,突出椎間盤內的主要組分為蛋白聚糖，而用ChSase ABC及ChSase AC則可特異性降解掉突出的椎管內的糖胺聚糖、降低椎管內壓，同時對椎管外周組織無損害(Brown, M D.Method for treating intervertebral discdisplacement with enzymes [P]:US, 4696816, 1987-09-29)。2001 年 Denholm EM 等發現ChSase AC、ChSase B能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤細胞的轉移與增生等(Denholm EM, Lin Y Q, Silver P J.Ant1-tumor activities of chondroitinase AC and chondroitinaseB:1nhibition of angiogenesis, proliferation and invasion.European Journal ofPharmacology, 2001, 416(3):213-221)。Lee MC 等發現當軟骨用 ChSase ABC 處理后，移植的軟骨細胞與軟骨創面的黏附能力大大增強；(Lee M C，Sung K L, Kurtis M S，etal.Adhesive force of chondrocytes to cartilage effects of chondroitinase ABC.ClinOrthop, 2000，370(I):286-294)。
[0007]對低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復雜的實驗設備并且會污染環境，比較而言，酶解法需要的條件不高、方法簡便且容易控制。酶解法的關鍵在于獲得大量的硫酸軟骨素裂解酶。分離純化硫酸軟骨素裂解酶的方法非常復雜，通常需要經過多步的色譜純化，收率很低。異源重組表達ChSase ABC是常用來提高ChSase ABC產量的手段之一。然而對ChSase ABC的異源重組表達研究非常有限，到目前為止國內還沒有這方面的報道。只有Pojasek等在E.coil中表達了硫酸軟骨素酶AC酶和B酶的基因(chsase基因)，并分離純化到活性蛋白，在其研究中所用的載體為pET15b和PCRT7/NT，這兩個載體中的融合標簽均為His_tag。但是His_tag存在明顯的缺點，即跟親和載體的親和力不強，不能增加與之結合蛋白質的可溶性，難以提高純化效果和蛋白質可溶性比例等(參見:Kevin Pojasek, Zachary Shriver, Patrick Kiley, GaneshVenkataraman and Ram Sasisekharan.Recombinant Expression, Purification and KineticCharacterization of Chondroitinase AC and Chondroitinase B from Flavobacteriumhparinum.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 286:343-351)。
[0008]專利申請CN103305496A公開了一種從微生物提取硫酸軟骨素酶的方法，但是該方法提取步驟繁瑣，成本較高。

【發明內容】

[0009]為解決現有技術的不足，本發明采用融合表達的方法，獲得了大量可溶性的ChSase ABC的融合蛋白， 且采用一步純化的方法，純化方法簡單，并且得到高純度的ChSaseABC。
[0010]本發明的主要目的在于提供一種硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其中，所述硫酸軟骨素酶ABC融合蛋白包括硫酸軟骨素ABC酶和麥芽糖結合蛋白，其中，所述麥芽糖結合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素ABC酶N端連接。
[0011]優選地，所述硫酸軟骨素ABC酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸；所述麥芽糖結合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸。
[0012]優選地，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸。[0013]優選地，所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白酶活為3.18IU/mL,比酶活為19IU/mg。
[0014]本發明的另一目的在于提供一種DNA，所述DNA序列編碼所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的DNA。
[0015]本發明的再一目的在于提供一種重組載體，所述重組載體包括載體和所述的編碼硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白DNA，優選地，所述載體包括pMAL-c2x。
[0016]本發明的又一目的在于提供一種轉化體，所述轉化體是將所述的重組載體導入宿主細胞而得到的轉化體，其中，所述宿主細胞包括E.coli TBU ToplO, JM109、BL21、BL21 (DE3)和 DH5 α，所述宿主細胞優選 Ε.coli BL21 (DE3)。
[0017]本發明的還一目的在于提供一種制備所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，所述制備方法包括:(I)將所述硫酸軟骨素ABC酶的基因連接到含麥芽糖結合蛋白基因的質粒載體上得到包含重組載體所述硫酸軟骨素ABC酶和麥芽糖結合蛋白的融合蛋白的重組載體；(2)轉化所述步驟(1)中的重組載體到所述宿主細胞，表達所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白；以及(3)破碎所述轉化體，使用麥芽糖結合蛋白親和層析分離所述表達的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白。
[0018]優選地，所述步驟(3)中麥芽糖結合蛋白親和層析包括使用直鏈淀粉樹脂、馬鈴薯淀粉柱分離。
[0019]本發明的還供 了一種生產低分子量硫酸軟骨素A，B或者C的方法，所述方法包括:使用所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白降解底物，生產低分子量硫酸軟骨素A，B或者C，反應溫度為30-55°C，時間為5-10h。
[0020]本發明的還供了所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白在制備低分子量硫酸軟骨素A，B或者C中的用途。
[0021]本發明的還供了所述的方法制備的低分子量硫酸軟骨素A，B或者C，其中，所述硫酸軟骨素A，B或者C的分子量為0.5~25kDa，優選的范圍為2~lOkDa。
[0022]本發明人使用硫酸軟骨素裂解酶替代物一硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其具有硫酸軟骨素ABC酶的活性，能夠用于生產硫酸軟骨素，并且硫酸軟骨素的生成條件不高、方法簡便且容易控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為從普通變形桿菌中PCR擴增得到的硫酸軟骨素ABC酶基因電泳圖譜，1-12各泳道分別對應不同退火溫度的PCR產物。
[0024]圖2為轉化子菌落PCR驗證電泳圖。
[0025]圖3為轉化子酶切驗證電泳圖譜。
[0026]圖4為pMAL-ChSase ABC在6種不同的大腸桿菌(E.coli)宿主中的表達情況:酶活測定以硫酸軟骨素A為底物。
[0027]圖5為E.coli BL21 (DE3) /pMAL-ChSase ABC工程菌株表達硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的SDS-PAGE圖譜以及硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離產物的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0028]序列表中:
[0029]序列I為普通變形桿菌(Proteus vulgari)硫酸軟骨素ABC酶氨基酸序列；[0030]序列2為大腸桿菌(Escherichia coli)麥芽糖結合蛋白氨基酸序列；
[0031]序列3為本發明硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白氨基酸序列；
[0032]序列4為本發明硫酸軟骨素酶ABC酶融合蛋白DNA序列；
[0033]序列5為PCR擴增硫酸軟骨素ABC酶的上游引物核苷酸序列；
[0034]序列6為PCR擴增硫酸軟骨素ABC酶的下游引物核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0035]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0036]以下，對本文的實施方式進行具體說明。
[0037]硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白
[0038]本文涉及的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白(以下，有時也簡稱為“MBP-ChSaseABC”)，其融合有硫酸軟骨素ABC酶和麥芽糖結合蛋白(以下，有時也簡稱為“MBP”)。
[0039]本文涉及的硫酸軟骨素ABC酶可以是任何硫酸軟骨素酶，優選選自普通變形桿菌(Proteus vulgaris)、嗜水氣單抱菌(Aeromonas Iiquefaciens)及肝素黃桿菌(Flavobacteriumheparinum)來源的硫酸軟骨素酶。根據本文的一個優選的實施方案，硫酸軟骨素ABC酶是普通變形桿菌來源的硫酸軟骨素酶；特別地，硫酸軟骨素酶是去除了編碼信號肽堿基的普通變形桿菌的硫酸軟骨素ABC酶。根據本文一個優選的實施方案，本文硫酸軟骨素ABC酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸。
[0040]硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白中，硫酸軟骨素ABC酶直接與麥芽糖結合蛋白融合。
[0041]本文涉及的麥芽糖結合蛋白可以是任何本領域普通技術人員能夠得到的麥芽糖結合蛋白。優選來自于大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白。來自大腸桿菌的天然的MBP能夠與麥芽糖特異吸附，參與大腸桿菌對麥芽糖的轉運和利用。MBP不但能與直鏈淀粉結合，實現親和分離，也能與馬鈴薯淀粉實現親和分離，從而可以大大降低酶的分離純化成本，有利于實現工業化規模的分離純化。在一個更優選的實施方案中，本文的麥芽糖結合蛋白具有SEQID NO:2所示的氨基酸。
[0042]優選，本文的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸。
[0043]DNA
[0044]本文還涉及一種編碼上述所有硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的DNA，其是該融合蛋白的編碼序列。
[0045]用于本說明書的術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產物的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0046]編碼序列的邊界通常由開讀框決定，所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。 [0047]根據本文一個優選的實施方案，DNA具有SEQ ID NO:4所示的堿基序列。
[0048]重鉬載體[0049]本文還涉及重組載體，其包含編碼上述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白DNA。
[0050]本文涉及的重組載體包含編碼上述所有的融合蛋白的DNA序列、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。本文中所述的DNA序列可以和其它調控序列結合在一起，產生重組載體，該載體可以包括一個或多個(數個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼肽段的DNA序列。備選的，可以通過在適當的用于表達的載體中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列來表達本文的DNA序列。在制備重組載體的過程中，將編碼序列導入載體中，從而將該編碼序列與適當的表達調控序列可操作地連接。
[0051]啟動子、轉錄信號、翻譯終止信號以及其它調控序列是任何本領域普通技術人員能夠可以根據常規選擇而確定的。
[0052]重組載體可以是任何載體(例如,質粒或病毒)，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環狀質粒。
[0053]載體可以是自主復制載體，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的構建。或者，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質粒或兩個或更多個載體或質粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA，或可以使用轉座子。
[0054]根據本文一個優選的實施方案，本文的重組載體是pMAL-c2x。優選，該重組載體是通過以下步驟構建:
[0055]將SEQ 10勵:4所示 的0嫩片段插入質粒？嫩1^-021的多克隆位點，得到重組載體。
[0056]轉化體
[0057]本文還涉及轉化體，其是將包含編碼上述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白DNA導入宿主細胞而得到的轉化體。
[0058]本文涉及的轉化體可用于蛋白質的生產，通過將包含本文DNA序列的載體導入宿主細胞而得到該轉化體，并在適當的培養基中培養該轉化體，可以用來生產所需要的目標蛋白質。
[0059]術語“宿主細胞”包括母體細胞的任何后代，其由于復制過程中發生的突變而不同于母體細胞。宿主細胞可以是在本文的肽段的重組產生中有用的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本文的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于，不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。宿主細胞還可以是真核生物，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個具體的方面，宿主細胞是真菌細胞。在一個具體的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。在另一個具體的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。
[0060]根據本文一個優選的實施方案，細菌宿主細胞是大腸桿菌。根據進一步優選的實施方案，細菌宿主細胞是大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0061]構建硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法
[0062]本文還涉及一種構建硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，包括
[0063](i).提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體；和
[0064](ii).將硫酸軟骨素ABC酶的基因連接到上述載體上。
[0065]本文的另一實施方式涉及構建硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，其中，該硫酸軟骨素ABC酶的N端通過肽段連接部分與麥芽糖結合蛋白結合。
[0066]其中涉及的質粒載體如上文所述。
[0067]純化硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法
[0068]本文還涉及純化硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，其包括:
[0069]a.利用直鏈 淀粉樹脂吸附含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物的步驟，以及
[0070]b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的步驟。
[0071]本文涉及的純化硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，在所述a和b之前，該方法還包括:
[0072]提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體；
[0073]將硫酸軟骨素ABC酶的基因連接到上述質粒載體上提供重組載體；
[0074]將重組載體導入宿主細胞而得到轉化體；以及
[0075]利用培養基培養該轉化體并獲得所述含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物。
[0076]其中，轉化體的培養可以使用包含碳源、氮源、無機鹽、各種維生素等的常規營養培養基來進行，作為碳源，可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等糖類，乙醇、甲醇等醇類，檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸等有機酸類，廢糖蜜等。作為氮源，可以單獨或混合使用例如氨氣、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素等。此外，作為無機鹽，可以使用例如磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等。此外，培養基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸、生物素等各種維生素等營養素。
[0077]培養通常在通氣攪拌、振蕩等需氧條件下進行。對培養溫度沒有特殊限制，只要是宿主微生物能夠生長繁育的溫度即可，此外，對培養過程中的PH也沒有特殊限制，只要是宿主微生物能夠生長繁育的PH即可。培養中的pH調整可以通過添加酸或堿來進行。
[0078]根據本文一個優選的實施方案，對上述的轉化體培養是在誘導的條件下進行的培養，由此表達得到硫酸軟骨素ABC酶。誘導培養的條件是:0.5mM的IPTG。在一個進一步優選的實施方案中，上述誘導培養條件是:10-42°C誘導培養15-28小時。在一個更優選的方面，上述誘導培養條件是:16°C誘導培養20小時。
[0079]根據本文一個優選的實施方案，進行上述誘導培養的培養基的溶劑是水，溶質是10g/L NaCl, 5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨和100 μ g/L氨芐青霉素。
[0080]對于制備含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物的方法，沒有特別地限制，可以使用各種的方法。通常，可以如下制備:利用上述的適當的培養基培養的轉化體，通過使用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法，或者利用了表面活性劑等化學方法，或者酶處理等破碎或可溶化，以及離心分離或過濾等操作，從而得到含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物。
[0081]根據本文一個優選的實施方案，將上述培養的轉化體培養物菌體米用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法進行破碎而得到含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物。
[0082]根據本文一個優選的實施方案，采用超聲破碎獲得含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物。
[0083]根據本文一個優選的實施方案，將是上述含硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的粗產物通過直鏈淀粉樹脂(amylose樹脂)實現一步親和分離。直鏈淀粉樹脂是任何本領域普通技術人員能夠可以根據常規選擇而確定的，可以使用可以商購的直鏈淀粉樹脂，例如MBPTrap HP (商品號28-9187-78，GE Healthcare。在一個優選的實施方案中，通過直鏈淀粉樹脂的上清液的流速為lmL/min。在一個優選的實施方案中，用于洗脫的麥芽糖的濃度為10mM。在一個優選的實施方案中，用于洗脫的麥芽糖的流速為lmL/min。在一個優選的實施方案中，該直鏈淀粉樹脂是經過預平衡的。
[0084]低分子暈硫酸軟骨素A或者C的生產方法
[0085]本文涉及生產低分子量硫酸軟骨素A, B或者C的方法,其包括:使用硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白降解硫酸軟骨素A，B或者C原料、生產低分子量硫酸軟骨素A，B或者C的方法，其中得到的低分子量硫酸軟骨素A，B或者C的分子量為0.5kDa~25kDa，優選的范圍為2~IOkDa0
[0086]當將硫酸軟骨素的分子量降低至2kDa~IOkDa時，其藥效更為明顯，對防止動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效。
[0087]用于生產硫酸軟骨素的底物可以任意選擇，這要是能夠被硫酸軟骨素ABC酶降解的底物均可。可以選自:硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B、硫酸軟骨素C、以及透明質酸中的任何。根據本文的一個優選的技術方案，硫酸軟骨素選自硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素B或硫酸軟骨素C。
[0088]生產硫酸軟骨素的底物的濃度是本領域技術人員可以根據所添加的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的濃度而適當確定的。硫酸軟骨素與硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白反應的時間也可以根據目標的低分子量硫酸軟骨素的分子量來進行確定。
[0089]實施例
[0090]下面結合具體實施例對本文作進一步說明，但本文并不限于以下實施例。
[0091]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。所述引物合成及測序工作均由華大基因完成，Q5? High_Fidelity2XMaster Mix和所有的限制性內切酶均購自New EnglandBiolabs公司；所有感受態細胞(如:DH5 α、TBl和ToplO)購自北京博邁德生物技術有限公司);硫酸軟骨素ABC酶酶活測定底物硫酸軟骨素A購自南京奧多福尼生物科技有限公司，其它的化學藥品均為一般分析純試劑，購自北京化工廠。
[0092]實施例1、硫酸軟骨素酶AC融合蛋白(MBP-ChSase AC)的表達
[0093]一、去除信號肽的普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC酶編碼序列的克隆
[0094]表達載體pMAL-ChSase ABC構建的具體過程如下:
[0095]1、引物的設計及合成[0096]經Genbank查詢得到普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC酶的DNA序列(Tam K.ff.Studyof chondroitin sulphate abc lyases and their use in combination for promotion ofneurite growth.University of Hong Kong, 2010.),再根據去除編碼信號肽堿基的普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC酶的DNA序列設計引物，并在引物序列中引入限制性內切酶BamH I和Pst I的識別位點，所用的上下游引物分別為:
[0097]上游引物Pl:5’ -CGGGATCCATGGCCACCAGCAATCCTGCATT-3> (SEQ ID NO: 5)(帶下劃線的堿基為BamH I的酶切位點)，
[0098]下游引物P2:5’ -AACTGCAGTTATCAAGGGAGTGGCGAGAGTTTG-3> (SEQ ID NO:6)(帶下劃線的堿基為Pst I的酶切位點)，擴增后，即分別引入BamH I和Pst I酶切位點。
[0099]2、PCR擴增去除信號肽的普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC酶的編碼序列
[0100]PCR擴增的反應體系為:50ng普通變形桿菌基因組DNA模版，IOOpmol每種引物，響應體積的2 XMaster Mix ;擴增程序為:98攝氏度預變性30秒，98攝氏度變性7秒，40-60攝氏度引物退火30秒，72攝氏度延伸2分鐘，30個循環后，72攝氏度延伸2分鐘結束反應。該PCR結果如圖1所示，表明擴增得到了 3kb的硫酸軟骨素酶AC基因片段，測序表明并比對正確。圖1中，泳道1-12分別為退火溫度為40-60攝氏度擴增結果，泳道M為分子量marker (條帶大小依次為IOkb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、Ikb)，箭頭所指處為3kb目標片段，從左到右1-12各泳道對應的退火溫度分別為40.0,40.6,41.9,44.0,46.4,48.7,51.3、53.6,56.0,58.1、59.4、60.0攝氏度。由圖1可知，最優的退火溫度為60攝氏度。
[0101]3、構建含有目的片段的克隆載體
[0102]參照試劑盒說明書 進行操作，將步驟一中2中的PCR擴增的目的片段克隆入載體pMAL-c2x，得連接產物。
[0103]4、轉化大腸桿菌及陽性克隆轉化子的篩選及測序
[0104]將步驟3獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，具體方法為:將10 μ I的連接產物與50μ1的大腸桿菌DH5a感受態細胞混勻，冰浴30分鐘，42攝氏度熱激90秒，冰浴2分鐘，然后加入500 μ I LB液體培養基(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaC13g，水300mL)中，37攝氏度孵育60分鐘，涂于含100 μ g/mL氨芐青霉素的LB抗性培養平板(蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaC13g，瓊脂粉4.5g，水300mL)進行篩選。37攝氏度培養12-20小時。挑選菌落并以此為模版，用引物Pl和P2進行菌落PCR鑒定，PCR反應體系及反應條件與步驟2相同。反應結束后，對擴增產物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，可含轉化子的陽性克隆，結果如圖2，泳道1-6分別為菌落PCR擴增結果，3、4、6泳道菌落PCR擴增為陽性，
1、2、5泳道菌落PCR擴增為陰性，泳道M為分子量marker (條帶大小依次為5kb、3kb、lkb、750bp、500bp、250bp、100bp)，箭頭所指處為3kb目標片段。酶切驗證，如圖3，泳道1,2,3,5為陽性轉化子，出現箭頭所指的目標條帶，泳道M為分子量marker (條帶大小依次為10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、lkb)。將篩選得到的陽性克隆轉至4mL含100 μ g/mL氨節青霉素的LB液體培養基中，37攝氏度、220rpm振搖12小時，將菌液交由華大基因進行測序，將含有硫酸軟骨素ABC酶蛋白編碼基因的pMAL-c2x重組載體命名為pMAL-c2x_ChSase ABC。
[0105]二、硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白MBP-ChSase ABC的表達
[0106]提取步驟一中含有pMAL-ChSase ABC的大腸桿菌DH5a中的質粒，按照常規方法轉化大腸菌TBU ToplO, JM109、BL21和BL21 (DE3))。經過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中步驟I提供的引物進行菌落PCR鑒定，得到含有pMAL-ChSase ABC的大腸桿菌 TBl、ToplO, JM109 和 BL21 (DE3)，即 TBl/pMAL-ChSase ABC、ToplO/pMAL-ChSase ABC、JM109/pMAL-ChSase ABC、BL21/pMAL_ChSase ABC、BL21 (DE3) /pMAL-ChSase ABC 和 DH5 a /pMAL-ChSase AC 作為表達 MBP-ChSaseABC 的工程菌。
[0107]以質粒pMAL-c2x轉化大腸桿菌TBl、Topl0、JM109、BL21、BL21(DE3)和DH5a，得到空載體對照 TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、JM109/pMAL-c2x、BL21/pMAL-c2x、BL21 (DE3) /pMAL-c2x 和 DH5 a /pMAL_c2x。
[0108]以下操作對上面的工程菌平行進行。
[0109]將空載體對照和工程菌分別在含氨芐青霉素抗性的LB培養基(NaC110g/L，酵母提取物為5g/L，蛋白胨10g/L，含100 μ g/L氨芐青霉素)37攝氏度培養2.5小時后，加入終濃度為0.5mM IPTG16攝氏度誘導20小時。6000rpm，6分鐘離心收集菌體并用20mMTris-HCl (pH7.4)洗滌兩次，然后重懸菌體。將重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲5秒和間歇6秒，處理總時間為15分鐘)，6000rpm，6分鐘離心，超聲破碎后離心所得的上清液即為含硫酸軟骨素ABC酶的粗產物。酶活力(單位為IU/L)的檢測采用232nm的光吸收法，IIU的酶活定義為37攝氏度每分鐘產生I μ moL不飽和鍵的反應效力。取硫酸軟骨素A底物溶液2mL(20mg/mL硫酸軟骨素A，20mM Tris-HCl，pH7.4)，加入上步中所得的200 μ L的粗產物，最終的反應體積為1.5mL,測單位時間內在232nm的吸光度變化Λ A232。消光系數ε = 3800Μ'比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗產物蛋白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監測采用常規的Bradford法。
[0110]以硫酸軟骨素A為底物的宿主優化結果如圖4所示，空載體對照菌株TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、JM109/pMAL_c2x、BL21/pMAL_c2x、BL21 (DE3)/pMAL_c2x 和DH5 a /pMAL-c2x誘導培養后無酶活，工程菌都表達出了有活性的可溶性MBP-ChSase ABC融合蛋白。并且經過測序,表達出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:3所示；并且該融合蛋白MBP-ChSase ABC中的MBP的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；該融合蛋白中的ChSase ABC的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0111]可以發現，以硫酸軟骨素A為底物，E.coli BL21(DE3)具有最高的酶活，因此最佳宿主為 E.coli BL21(DE3)。
[0112]對最佳宿主E.coli BL21(DE3)表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳:取上述超聲破碎后離心所得的上清夜(粗產物)30 μ I做可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳，取上述超聲破碎后離心所得的沉淀來做不可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳。結果如圖5所示，圖5中M為marker (由上至下分子量依次均為 170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa)，泳道1-4分別為空白對照、E.coli BL21 (DE3)/MAL-ChSase AC的可溶蛋白、不可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分，箭頭所指處為融合蛋白MBP-ChSase ABC(HOkDa)。
[0113]實施例2、通過肓鏈淀粉柱純化硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白MBP-ChSase ABC
[0114]本實施例利用融合伴侶(fusion partner)麥芽糖結合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉親和吸附實現一步分離。具體的親和分離步驟如下:將終濃度為0.5mM IPTG誘導表達20小時的菌體IOOmL,6000rpm離心6分鐘；同時設未誘導表達的菌體對照。接著按以下兩個方案分別操作:
[0115] 用柱平衡液Column buffer (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl,ρΗ7.4)洗漆兩次，重懸在30mL Column buffer中，進行超聲破碎(輸出功率為300W，每次超聲5秒和間歇6秒，處理總時間為15分鐘)。
[0116]離心后上清液以lmL/min通過ImL預平衡的直鏈淀粉親和分離柱,通過IOmMlmL/min麥芽糖洗脫并收集。
[0117]目標蛋白經過直鏈淀粉(amylose)樹脂吸附后，用IOmM麥芽糖在2個柱體積下能夠將目標蛋白洗脫。結果如圖5所示，表明經過直鏈淀粉樹脂一步純化后目標蛋白可占90%以上。圖5中，M為marker(由上至下分子量依次均為170kDa、130kDa、lOOkDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa)，1-4 分別為空白對照、E.coli BL21 (DE3)/pMAL-ChSaseAC的可溶蛋白、不可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分，箭頭所指處為融合蛋白MBP-ChSaseABC(HOkDa)。
[0118]綜上，通過融合蛋白首次實現硫酸軟骨素ABC酶在大腸桿菌中70%以上有活性、正確折疊的可溶蛋白形式存在；實施例的結果說明利用麥芽糖結合蛋白(MBP)作為融合標簽，克服了 His-tag標簽的缺點，具有起始轉錄效率高、顯著提高酶重組表達的可溶性等優點。
[0119]本發明還可通過親和分離實現了該融合蛋白的一步純化。與現有技術中使用的魚精蛋白沉淀(參考ANA LYDIA TKALEC, DOMINIQUE FINK等人，Isolation and Expression in Escherichia coli of cslA and cslB，Genes Codingfor the Chondroitin Sulfate-Degrading Enzymes Chondroitinase AC andChondroitinase B，Respectively,from Flavobacterium heparinum.APPL.ENVIRON.MICROBIOL 2000,66(1):29-35)和一步柱純化法相比(參見表1)，可以大大縮短純化需要的時間，并且純化所 用的設備明顯減少，降低了純化硫酸軟骨素酶的生產成本。利用直鏈淀粉樹脂的純化僅需要進行2個小時左右，即可獲得能夠用于工業生產的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。純度達到可以應用的95%以上。
[0120]表1魚精蛋白沉淀和本發明一步柱純化法相比
[0121]
【權利要求】
1.一種硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其中，所述硫酸軟骨素酶ABC融合蛋白包括硫酸軟骨素ABC酶和麥芽糖結合蛋白，其中，所述麥芽糖結合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素ABC酶N端連接。
2.根據權利要求1所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其中所述硫酸軟骨素ABC酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸；所述麥芽糖結合蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸。
3.根據權利要求2所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其中所述融合蛋白具有SEQIDNO:3所示的氨基酸。
4.根據權利要求1~3任一項所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白，其中，所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白酶活為3.18IU/mL,比酶活為19IU/mg。
5.一種DNA，所述DNA序列編碼權利要求1~3中任一項中所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的DNA。
6.一種重組載體，所述重組載體包括載體和權利要求4所述的編碼硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白DNA,優選地,所述載體包括pMAL-c2x。
7.一種轉化體，所述轉化體是將權利要求8所述的重組載體導入宿主細胞而得到的轉化體，其中，所述宿主細胞包括E.coli TBU ToplO, JM109、BL21、BL21 (DE3)和DH5 α，所述宿主細胞優選Ε.coli BL21 (DE3)。
8.一種制備權利要求1~4任一項所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白的方法，所述制備方法包括: (I)將所述硫酸軟骨素ABC酶的基因連接到含麥芽糖結合蛋白基因的質粒載體上得到包含重組載體所述硫酸軟骨素ABC酶和麥芽糖結合蛋白的融合蛋白的重組載體；(2)轉化所述步驟(1)中的重組載體到所述宿主細胞，表達所述硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白；以及 (3)破碎所述轉化體，使用麥芽糖結合蛋白親和層析分離所述表達的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其中，所述步驟(3)中麥芽糖結合蛋白親和層析包括使用直鏈淀粉樹脂、馬鈴薯淀粉柱分離。
10.一種生產低分子量硫酸軟骨素Α，B或者C的方法，所述方法包括:使用權利要求1~4任一項所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白降解底物，生產低分子量硫酸軟骨素Α，B或者C，反應溫度為30-55°C，時間為5-10h。
11.根據權利要求1~4任一項所述的硫酸軟骨素ABC酶融合蛋白在制備低分子量硫酸軟骨素A，B或者C中的用途。
12.根據權利要求10所述的方法制備的低分子量硫酸軟骨素A，B或者C，其中，所述硫酸軟骨素A，B或者C的分子量為0.5~25kDa，優選的范圍為2~lOkDa。
【文檔編號】C12N15/62GK103992993SQ201410222796
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】李曄, 陳振婭, 王曉杰 申請人:北京電子科技職業學院