一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種融合蛋白及含該融合蛋白的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物與應用。所述融合蛋白包括綠膿桿菌外毒素A結構域I與II、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗原性蛋白及羧基末端部分，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗原性蛋白包括Nsp9蛋白、Nsp10蛋白。本發明還公開了含免疫量的融合蛋白的疫苗組合物及其在制備預防和/或治療高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。所述疫苗組合物可通過基因工程手段對疫苗組合物的組分進行大量重組表達，不僅耗時短，還可便于大規模生產。
【專利說明】一種融合蛋白及其疫苗組合物的制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于獸用生物制品【技術領域】，具體涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 病毒的融合蛋白及含該融合蛋白的疫苗組合物及其應用。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 又稱"豬藍耳病"，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)所引起的豬的一種高度傳染病，以母豬發熱、厭食、早期流產、死 胎、木乃伊胎、產弱仔等繁殖障礙及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為主要特征（殷震，劉景 華.動物病毒學.第2版.北京：科學出版社.1997)。同時，PRRSV可引起動物機體發生免 疫抑制，進而繼發多種病原的感染。
[0003] 該疾病首先于1987年在美國被發現，隨后在歐洲發現，二十世紀九十年代早期在 亞洲被鑒定。通過對全球不同地域分離的PRRSV進行系統進化分析，發現PRRSV主要存在 兩種基因型：1型（歐洲型），以荷蘭分離到的Lelystad病毒（LV株）為代表；II型（美洲 型），以美國分離到的VR2332株為代表。
[0004] 1996 年，國際病毒學分類委員會（International committee on taxonomy of virus，ICTV)在世界病毒學大會上正式將豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV、馬動脈炎病毒 (equine arteritis virus, EAV)、鼠乳酸脫氫酶病毒（lactate dehydrogenase elevating virus, LDV)、猴出血熱病毒（simian haemorrhagic fever virus, SHFV)都歸到新建立的動 脈炎病毒科（Arteriviridae)中，并將動脈炎病毒科歸到套式病毒目（Nidovirales)中 (Cavanagh D. Nidovirales:a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Archives of virology, 1997, 142(3) :629-633 ；Gonzalez JM, Gomez-Puertas P,Cavanagh D, et al. A comparative sequence analysis to revise the current taxonomy of the family Coronaviridae. Archives of virology, 2003, 148(II):2207-2235)。
[0005] PRRSV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約15. Okb，由結構蛋白編碼區、 非結構蛋白編碼區、5'非編碼區（5'UTR)和3'端非編碼區（3'UTR)組成，其中5'UTR上游為 帽子結構，3' UTR下游為Poly (A)尾，包含9個開放閱讀框（Open reading frame, 0RF)，分別 為 ORFI a、ORFI b、0RF2a、0RF2b、0RF3、0RF4、0RF5、0RF6、0RF7，分別編碼 pp I a、pp I ab、GP2a、 GP2b (又稱 E)、GP3、GP4、GP5、M、N 蛋白（Snijder EJ, Meulenberg JJ. The molecular biology of arteriviruses. Journal of general virology, 1998(79):961-979 ；Dea S1Gagnon CA, Mardassi H，et al.Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates. Archives of Virology, 2000, 145:659-688 ；ffu WH, Fang Y, Farwell R, et al. Al〇-kDa structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by 0RF2b. Virology, 2001, 287:183-191)。其中，ppla 和 pplab 是由ORFl通過核糖體移碼機制編碼產生的兩個多聚蛋白，經ORFla編碼產生的三種蛋白 酶切割產生12種非結構蛋白，分別為：為Nspl a、NsplP、Nsp2、Nsp3、Nsp4、Nsp5、Nsp6、 Nsp7 a、Nsp7 P、Nsp8、Nsp9 (RNA 依賴的 RNA聚合酶）、NsplO (解旋酶）、NsplI 和 Nspl2 (Fang Y, Snijder EJ. The PRRSV replicase: exploring the multifunctionality of an intriguing set of nonstructural proteins. Virus research, 2010, 154:61-76 ；Charerntantanakul ff. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: immunogenicity, ef ficacy and safety aspects. World Journal of Virology, 2012, I (I) :23-30)。已有研究證 實，單獨Nsp9、NsplO對病毒致病性以及病毒在體內的復制無影響（姜一峰，周艷君，王亞 欣，等.豬繁殖和呼吸綜合征病毒HuM株Nsp9、N SplO、Nspll對毒力影響的研究.中國動 物傳染病學報，2011，19 (6) : 1-6)。
[0006] 目前，PRRS已普遍存在于世界范圍內，每年都會造成巨大的經濟損失，已經成 為養豬業的巨大威脅。尤其是2006年在我國爆發的"豬高熱綜合征"（porcine high fever syndrome, PHFS)或"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征"（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome, HP-PRRS)，傳播范圍多達 10 個省，感染超過 200 萬頭豬，約40萬頭豬死亡的病例。經研究表明：該病的主要病原為發生遺傳變異的美洲型 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRS virus, HP-PRRSV) (Tian KG, Yu XL, Zhao TZ, et al. Emergence of fatal PRRSV variants!Unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark. PLoS ONE, 2007, 2 (6) : e526) 〇
[0007] 目前，已有的HP-PRRS商品化疫苗包括滅活疫苗和弱毒活疫苗，但滅活疫苗接種 次數多，抗體產生慢，保護效果不穩定，經常導致免疫失敗；不能誘導針對異源HP-PRRS病 毒株的強的免疫作用；弱毒活疫苗是將強毒株經連續傳代致弱而成，需要投入大量的人力 和物力，研發周期長，甚至還存在毒力返強的風險，弱毒活疫苗對于不同型和變異較大的毒 株之間的免疫保護也很弱。因此，迫切需要研發一種安全、有效疫苗。
【發明內容】
[0008] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種融合蛋白，以及含該融合蛋白的疫 苗組合物與應用。
[0009] 本發明的主要目的在于提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0010] ⑴假單胞桿菌外毒素 A結構域I，
[0011] (2)假單胞桿菌外毒素 A結構域II，
[0012] (3)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白，以及
[0013] (4)羧基末端部分。
[0014] 其中，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白位于假單胞菌外毒素 A 結構域II與羧基末端部分之間，且假單胞桿菌外毒素 A結構域II位于假單胞桿菌外毒素 A結構域I與所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白之間。
[0015] 本發明所用術語"假單胞桿菌外毒素 A結構域I"是指與假單胞桿菌外毒素 A (Pseudomonas exotoxin A，簡稱為PEA)的氨基末端細胞受體結構域具有相同序列或具有 功能相當片段的肽片段。
[0016] 本發明所用術語"假單胞桿菌外毒素 A結構域II"是指與假單胞桿菌毒素 A的中 間易位結構域具有相同序列或具有功能相當片段的肽片段。
[0017] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白"是指含有天然 性的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗原性蛋白的一個或多個T表位的蛋白，針對該抗原性 蛋白產生的免疫效應是所尋求的目的。
[0018] 優選地，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白含有Nsp9蛋白、 NsplO蛋白。
[0019] 更優選地，所述Nsp9蛋白為SEQ ID No. 1編碼的蛋白，所述NsplO蛋白為SEQ ID No. 2編碼的蛋白。
[0020] 所述羧基末端部分為含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7。
[0021] 本發明所述羧基末端部分為KDEL家族蛋白中的成員。所用術語"KDEL家族蛋 白"是指一組蛋白質，其具有與細胞內質網膜結合的相似羧基端，并進一步具有可將該蛋 白質留存于內質網腔中以實現醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片 段。通常，該羧基端的長度介于4-16個殘基之間。根據針對存在于不同分子中且執行 特定生物機能的相似序列所做的研究顯不：一種可在內質網中留存新形成蛋白的序列為 Lys Asp Glu Leu(KDEL) (SEQ ID NO. 3)。從而說明：根據這一發明的融合抗原的羧基端上 的序列可作為某種類型的識別序列，協助融合抗原從內吞區室易位至內質網內，并將其留 置于內質網腔內。在一個較佳的實施方式中，該羧基末端部分包含I?EL的序列如SEQ ID NO. 3所示。在一個更理想的實施方式中，該羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL(SEQ ID NO. 4)或 KKDL-RDEL-KDEL 的序列（SEQ ID NO. 5)、KKDELRDELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 6)或 KKDELRVELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 7)，其中 R 為 D 或 V。
[0022] 本發明的另一目的在于提供一種制備所述融合蛋白的方法，所述方法包括：通 過人工合成所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白與羧基末端部分添加的含 KDEL多肽的基因，通過基因工程手段分別擴增所述PEA基因以及人工合成的基因，將擴增 后的膠產物回收、混合以作為模板擴增融合蛋白的整段基因，連接至克隆載體即融合蛋白 的克隆載體；將構建的所述融合蛋白的克隆載體、表達載體通過酶切，構建同時包含PEA、 抗原性蛋白-KDEL基因的表達載體，即融合蛋白的表達載體；將所述融合蛋白的表達載體 導入受體菌進行誘導表達，并對表達的融合蛋白進行純化和鑒定以獲得高致病性豬繁殖與 呼吸綜合征病毒融合蛋白。
[0023] 優選地，所述基因工程手段是指運用分子生物學方法獲得所述PEA基因，人工合 成所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原性蛋白與羧基末端部分添加的含KDEL多肽 的基因，用分子生物學手段分別擴增并以膠產物混合為模板對融合蛋白進行擴增，進一步 優選為通過重疊延伸PCR方法擴增融合蛋白的基因；優選地，所述克隆載體為分子生物學 可接受的克隆載體，進一步優選為PMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、pBR322 ;優選地，所述表達 載體為PET，進一步優選為pET-28a、pET-32a ;所述受體菌為大腸桿菌，進一步優選為BL21。
[0024] 本發明的再一目的在于提供一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物，包括 免疫量的所述融合蛋白及獸醫學上可接受的佐劑。
[0025] 優選地,所述融合蛋白在所述疫苗組合物中的含量為50-200 ii g/mL。
[0026] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS) "可以在出現以下一 種或幾種臨床癥狀的豬中檢測到：皮膚發紅（rubefaction)、出血點（blood spots)、瘀斑 (petechiae)、紅斑轉白疹和小膿包（pimple)，常見于耳、口、鼻、背和大腿內側。其他常見 癥狀可包括：高熱（超過40°C )、抑郁（depression)、厭食（anorexia)、咳嗽（cough)、哮喘 (asthma)、跋行（lameness)、戰栗、呼吸道疾病和腹瀉（diarrhea)。高致病性豬繁殖與呼吸 綜合征（HP-PRRS)是由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV)引起的。
[0027] 本發明所用術語"高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物"是指能夠用于預防 和/或治療由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所知病癥或疾病的疫苗，該疫苗組合 物可包括任何能夠有效預防和/或治療豬受高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫 苗，能夠用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物包括（但不限于）完全或部分 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征細胞制劑、滅活或改良活體疫苗、亞單位疫苗。優選地，所述 的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物優選為亞單位疫苗，所述"亞單位疫苗"包含一 個或多個高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒衍生的多肽或蛋白質，或所述多肽或蛋白質的 免疫原性片段，或編碼所述一個或多個高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒衍生多肽或蛋白 質，或所述多肽或蛋白質免疫原性片段的一個或多個高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基 因或核酸，且所述基因或核酸能在豬體內進行表達。
[0028] 本發明所用術語"預防和/或治療"在涉及高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感 染時是指抑制高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的復制、抑制高致病性豬繁殖與呼吸綜合 征病毒的傳播或防止高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒在其宿主體內定居，以及減輕高致 病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所之疾病或病癥的癥狀。若病毒荷載量減少、感染減輕 和/或攝食量和/或生長增加，那么就可以認為所述治療達到了治療效果。
[0029] 本發明所用術語"豬"是指任何屬于豬科（Suidae)成員的動物，如豬。
[0030] 本發明所用術語"免疫量"是指提供針對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合 物的免疫劑量，主要取決于以下因素：被免疫動物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態 以及動物之前是否接受過對抗同樣病毒的疫苗。
[0031] 本發明所用術語"佐劑"可包括鋁膠佐劑；皂苷（saponin)，如Quil A、 QS-21(Cambridge Biotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL);油包水乳劑；水包油乳劑；水包油包水 乳劑；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物 選出的化合物。
[0032] 本發明所用術語"乳劑"可尤其基于輕液體石錯油（^European Pharmacopea類 型）；因烯經寡聚產生的類異戊二烯油（isoprenoidoil)，如角S燒（squalane)或角S烯 油（squalene oil),尤其異丁烯或葵烯；酸或醇的含線性燒基的酯，更尤其植物油、油酸乙 酯、丙二醇二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支鏈 脂肪酸或醇的酯，尤其異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以便形成乳劑。乳化劑優選非離 子表面活性劑，尤其山梨聚糖的酯、二縮甘露醇（mannide)的酯（如無水甘露醇油酸酯）、 脂肪族二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、異 硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羥基硬脂酸的酯，它們任選乙氧基化，還有聚氧丙烯-聚氧乙 烯嵌段共聚物，尤其Pluronic產品，特別是L121。參見Hunter等編寫的《The theory and practical application of adjuvants》（Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等編寫的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell M 和 Newman M 編寫的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147頁描述的SPT乳劑及第183頁描述的MF59乳劑。
[0033] 本發明所用術語"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"優選為交聯的丙烯酸或甲基 丙烯酸聚合物，尤其是與糖（sugar)的聚鏈烯基醚或聚醇交聯，這些化合物已知被稱為 卡波姆（Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8(2))。本領域技術人員還可 參見美國專利US2909462,其描述了這類丙烯酸聚合物，其與聚羥基化的化合物交聯，所 述化合物具有至少3個羥基，優選不超過8個，其中至少3個羥基的氫原子被具有至少2 個碳原子的不飽和脂烴基（aliphatic radical)取代。優選的基團是那些含有2-4個碳 原子的基團，例如乙烯基、烯丙基和其它烯屬不飽和基團（ethylenically unsaturated group)。所述不飽和基團自身可包含其它取代基，如甲基。這些產品以卡波普的名義出 售，（BF Goodrich, Ohio, USA)特別合適。它們與烯丙基鹿糖或與烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交聯。這其中可提及卡波普974P、934P和971P，最優選使用卡波普971P。 [0034] 本發明所用術語"順丁烯二酸酐和鏈烯基衍生物的共聚物"也可考慮順丁烯二酸 酐與乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，這些聚合物在水中溶解產生酸性溶液，經中和，優選中 和至生理pH，以便產生佐劑溶液，能向其中摻入免疫原性、致免疫性或疫苗性組合物本身。
[0035] 本發明所用術語"佐劑"還包括，但不限于，RIBI佐劑系統（Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、單憐醜脂質 A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素（重組或其 它）、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐劑等。
[0036] 優選地，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、 丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI 佐劑系統、Block c〇-polymer、SAF-M、單磷酰脂質A、Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐 熱腸毒素、霍亂毒素、MS1314、胞壁酰二肽或Gel佐劑中的一種或幾種；優選地，所述佐劑 為Gel佐劑。
[0037] 更優選地，所述佐劑在所述疫苗組合物中的體積比為5 % -30 %。
[0038] 優選地，所述疫苗組合物還包括其他抗原，所述其他抗原包括豬圓環病毒抗原、副 豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻 炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；進一步 優選地，所述其他抗原為豬圓環病毒抗原。
[0039] 本發明又一目的在于提供所述疫苗組合物在制備預防和/或治療高致病性豬繁 殖與呼吸綜合征的藥物中的應用。
[0040] 本發明具有以下突出的優點：
[0041] 所述疫苗組合物可通過基因工程手段對其組分進行大量重組表達，不僅耗時短， 還可便于大規模生產。
[0042] 序列表
[0043] 序列1為HP-PRRSV JXAlNsp9的氨基酸序列；
[0044] 序列2為HP-PRRSV JXAlNsp 10的氨基酸序列；
[0045] 序列3為羧基末端部分的氨基酸序列1 ;
[0046] 序列4為羧基末端部分的氨基酸序列2 ;
[0047] 序列5為羧基末端部分的氨基酸序列3 ;
[0048] 序列6為羧基末端部分的氨基酸序列4 ;
[0049] 序列7為羧基末端部分的氨基酸序列5 ;
[0050] 序列8為NLNK的核苷酸序列；
[0051] 序列9為假單胞桿菌外毒素 A結構域I與II的核苷酸序列。
【具體實施方式】
[0052] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0053] 本實施例中所用HP-PRRSV JXAl株Nsp9蛋白、NsplO蛋白的基因序列在NCBI中的 登錄號為FJ548854. 1，但該實施方式無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
[0054] 本實施例中所用的HP-PRRSV攻毒株為JXAl株，該毒株的保藏號為CGMCC No. 1964,保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，在中國專利 CN101045917A 中公開。
[0055] 本實施例中所用的pH7. 2PBS液配方為：1000mL蒸餾水中加入NaC19g、 Na2HPO4 ? 12H206g、NaH2PO4 ? 2H200. 4g，本發明中所用到的化學試劑均為分析純，購自國藥集 團。
[0056] 本發明實施例以Montanide?Gel01 (法國SEPPIC公司）作為佐劑，并以體積比為 10%的佐劑，制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物為例進行闡述，但該實施方式 無論在任何情況下均不構成對本發明的限定。
[0057] 下述實施例中所述的實驗方法，若無特殊說明，均為常規方法；所述的生物材料， 若無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0058] 實施例INLNK基因的合成
[0059] 為使融合蛋白有良好的空間結構自由伸展，提高藥物學及生物學活性，設計由谷 氨酸和絲氨酸構成的疏水柔性肽（GGGGSGGGGSGGGGS)作為Linker連接在Nsp9、NsplO之 間。
[0060] 根據NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的高致病性豬繁殖與 呼吸綜合征病毒JXAl株（登錄號：FJ548854. 1)中的Nsp9蛋白、NsplO蛋白中的基 因序列，以及Linker(GGGGSGGGGSGGGGS)與羧基末端部分（KKDELRVELKDEL)的基因 序列，由上海生物工程有限公司采用人工合成的方法合成，將合成后的基因命名為 Nsp9-Linker-NSpl〇-KDEL(簡寫為NLNK)，所合成的基因片段全長為243bp，測序結果如序 列表SEQ ID No. 8所示。
[0061] 實施例2融合蛋白PEA-NLNK的制備、鑒定與純化
[0062] 2. IPEA基因的合成與擴增
[0063] 根據NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov)中報道的假單胞桿菌外毒素 A (Pseudomonas aeruginosa exotoxin type A，登錄號：K01397. 1)結構域 I 與 II 的基因序 列（見SEQ ID NO. 9)，用PCR方法擴增相應的目的基因。其中，PEA基因引物設計如下：
[0064] 上游引物 Fl :5' -CGGGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3'，
[0065] 下游引物 Rl :5, -CAACTTCCTCTTTGCCGTCGCCGAGGAACT-3'，
[0066] PCR擴增程序：95°C預變性 5min，94°C變性 45s，52°C復性 30s，72°C延伸 60s，35 個 循環，最后72°C延伸IOmin。
[0067] 將獲得的PCR擴增產物用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測結果顯示：在1200bp左 右出現相應的目的條帶，與PEA結構域I與II片段的大小相符。將獲得的目的片段使用 DNA凝膠回收試劑盒回收，并于-20°C保存。
[0068] 2. 2NLNK基因的擴增
[0069] 用PCR方法擴增實施例1合成的NLNK基因，引物設計如下：
[0070] 上游引物 F2 :5' -CGGCGACGGCAAAGAGGAAGITG-3'，
[0071] 下游引物 R2 :5' -CCGCTCGAGCAGTTCGTCTTTCAGTT-3'，
[0072] PCR 擴增程序：95°C 預變性 5min，94°C變性 45s，52°C 復性 30s，72°C 延伸 30s，35 個 循環，最后72°C延伸IOmin。
[0073] 將獲得的PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測結果顯示：在240bp左右 出現相應的目的條帶，與NLNK片段的大小相符。將獲得的目的片段使用DNA凝膠回收試劑 盒回收，并于_2〇°C保存。
[0074] 2. 3重疊延伸PCR擴增PEA-NLNK基因片段
[0075] 將實施例2. 1至2. 2部分回收的膠產物混合，并將混合物作為模板，以上游引物Fl 和下游引物R2為引物序列，用重疊延伸PCR進行擴增。
[0076] 重疊延伸PCR擴增程序：95°C預變性5min，94°C變性45s，52°C復性60s，72°C延伸 3〇8,35個循環，最后721：延伸1〇111111。
[0077] 將獲得的重疊延伸PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測結果顯示：在 1500bp左右出現相應的目的條帶，與PEA-NLNK片段的大小相符。將獲得的目的片段使用 DNA凝膠回收試劑盒回收，并于-20°C保存。
[0078] 2. 4pMD18-T-PEA_NLNK 克隆載體的構建
[0079] 將實施例2. 3回收后的目的基因片段連接至pMD18-T載體，以構建 PMD18-T-PEA-NLNK。連接體系為：目的基因20ii L、pMD18-T載體0. L、連接酶緩沖液 2. 0 ii L、T4DNA連接酶I. 0 ii L、滅菌雙蒸水8. 5 ii L ;反應條件為：16。。、30min。將連接產物 加入DH5 a感受態細胞，冰上放置30min，然后42°C加熱90s，置冰上lmin，加入890 ii L的 LB液體培養基，37°C振蕩培養60min，將培養物接種含100 ii g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培 養板，37°C培養過夜進行藍白斑篩選。觀察結果顯示：LB固體培養基均出現白色小菌落。挑 白色典型菌落，分別接種于含有100 U g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，200rpm培養過夜。 使用質粒回收試劑盒提取各轉化菌質粒，命名為PMD18-T-PEA-NLNK，并進行酶切鑒定。酶切 鑒定結果顯示：pMD18-T-PEA-NLNK酶切后，出現2600bp左右的載體片段和1500bp左右的 PEA-NLNK片段，將酶切正確的質粒送基因公司測序，測序結果表明：pMD18-T-PEA-NLNK載 體構建正確。
[0080] 2. 5pET-28a-PEA_NLNK 載體的構建
[0081] 將鑒定正確的pMD18-T-PEA-NLNK質粒、pET-28a質粒分別使用BamHI、XhoI雙酶 切，使用凝膠回收試劑盒分別回收PEA-NLNK、pET-28a片段，并使用DNA連接試劑盒進行連 接，將連接產物轉化入BL21細胞，后將培養物接種含100 ii g/mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養 板，37°C培養過夜。觀察結果顯示：LB固體培養基均出現白色小菌落。挑白色典型菌落，分 別接種于含有1〇〇 U g/mL氨芐青霉素的LB液體培養基，200rpm培養過夜。將培養物進行 PCR鑒定，并測序，將鑒定正確的質粒命名為pET-28a-PEA-NLNK。
[0082] 2. 6pET-28a-PEA_NLNK 的表達
[0083] 將鑒定正確的pET-28a-PEA_NLNK導入大腸桿菌進行表達，將表達后的蛋白使 用親和層析柱進行純化，純化產物經SDS-PAGE電泳，目的蛋白片段與預期大小相符；經 Western-Blotting鑒定，表達后的蛋白可被PRRSV陽性血清所識別。
[0084] 將純化蛋白透析后進行濃縮，濃縮蛋白含量為lmg/mL，冷藏備用。
[0085] 實施例3高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物的制備
[0086] 將實施例2制備的融合蛋白PEA-NLNK使用pH7. 2PBS溶液稀釋，將稀釋后的融合 蛋白溶液與Gel佐劑按表1所示進行制備，以500-800r/min的轉速攪拌10-15min，在終止 攪拌前加入體積比為1 %的硫柳汞溶液，使其終濃度不超過萬分之一，充分振蕩混勻，即為 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物。將其分裝后于2-8°C保存備用。
[0087] 表1高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物所含組分及比例
【權利要求】
1. 一種融合蛋白，所述融合蛋白包含： (1) 假單胞桿菌外毒素 A結構域I， (2) 假單胞桿菌外毒素 A結構域II， (3) 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗原性蛋白，以及 (4) 羧基末端部分。
2. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗 原性蛋白包括Nsp9蛋白、NsplO蛋白。
3. 根據權利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述Nsp9蛋白為SEQ ID No. 1編碼的 蛋白，所述NsplO蛋白為SEQ ID No. 2編碼的蛋白。
4. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述羧基末端部分為含有氨基酸序列 KDEL 的多肽，其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6 或 SEQ ID NO. 7。
5. 根據權利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗 原性蛋白位于假單胞菌外毒素 A結構域II與羧基末端部分之間，且假單胞桿菌外毒素 A結 構域II位于假單胞桿菌外毒素 A結構域I與所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征抗原性蛋 白之間。
6. -種制備如權利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：通過基因 工程手段，依次構建所述融合蛋白的克隆載體、表達載體，并對所述融合蛋白進行表達、純 化及鑒定。
7. -種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物包括 免疫量的如權利要求1-5任一項所述融合蛋白以及獸醫學上可接受的佐劑。
8. 根據權利要求7所述疫苗組合物，其特征在于，所述佐劑為鋁膠佐劑、皂苷、油包水 乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、順丁烯二酸酐和鏈烯 基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐劑系統、Block co-polymer、SAF-M、單磷酰脂質A、 Avridine脂質-胺佐劑、大腸桿菌不耐熱腸毒素、霍亂毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐 劑中的一種或幾種；優選地，所述佐劑為Gel佐劑。
9. 根據權利要求7-8任一項所述疫苗組合物，其特征在于，所述疫苗組合物還包括其 他抗原，所述其他抗原包括豬圓環病毒抗原、副豬嗜血桿菌抗原、豬細小病毒抗原、大葉性 肺炎放線桿菌抗原、大腸桿菌抗原、豬萎縮性鼻炎抗原、豬偽狂犬病病毒抗原、豬霍亂病原 抗原、豬流感病毒抗原中的一種或多種；優選地，所述其他抗原為豬圓環病毒抗原。
10. 權利要求7-9任一項所述疫苗組合物在制備預防和/或治療高致病性豬繁殖與呼 吸綜合征的藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK104277116SQ201410281235
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】張許科, 孫進忠, 王瑩, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司