一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法
【專利摘要】一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法屬病毒的分離接種【技術領域】。按照以下步驟進行：收獲樣品接種雞胚的尿囊液、胚體，混合研磨，2500～4500rpm離心10～20min；取上清，繼續尿囊腔途徑盲傳，接種樣品0.1～0.3ml/胚。本發明在雞胚水平的流感病毒分離的傳統傳代方法基礎上，通過增加處理病毒可感染的靶組織，采用胚體與尿囊液混合研磨接種的傳代方式，成功提高了野外樣品的流感病毒分離率，尤其對因高溫、強紫外線等特殊生境難以新鮮采集或質量不太理想的野外樣本進行“挽救性”的病毒分離，提供了一個有效、可明顯提高病毒分離率的處理方法。
【專利說明】一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒的分離接種技術，特別涉及一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚 體分離方法。
【背景技術】
[0002] 雞胚分離病毒是一種經典的病毒分離方法，來自禽類的病毒，均可在雞胚中繁殖， 哺乳動物的病毒如藍舌病病毒、流感病毒等也可在雞胚中增殖，近期發現CCHFV病毒也可 在雞胚中增殖。目前雞胚尤其是SPF雞胚被廣泛利用于分離病毒、制造疫苗和抗原等，其來 源豐富，操作簡便。除病毒外，衣原體、立克次氏體也可用雞胚來培養。常用的雞胚接種的 途徑一般分為3種：絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、尿囊腔接種、羊膜腔接種、卵黃囊接 種。其中尿囊腔接種的方法適用于新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、腺病毒、禽流感病毒 等病原的分離。近年來，H5N1、H1N1、H7N9等流感病毒肆虐，WHO歷年在應對全球性流感病 毒防控時，都推薦使用接種雞胚尿囊腔的方法來進行流感病毒的分離。
[0003] 傳統禽流感病毒雞胚尿囊腔傳代方法般采用孵化9-11日齡的雞胚，暗室內畫 出氣室邊緣和胚頭位置，氣室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚頭一側氣室邊緣上方 0. 5cm處打一針孔；進針至尿囊腔內接種樣品0. 1-0. 2ml/胚，以融化的石蠟封孔，氣室朝 上立于卵架上繼續孵化，棄去24h內死亡雞胚，至96小時全部取出于4°C冰箱過夜。收毒 ： 無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼觀察雞胚病理變 化，尿囊液進行HA效價測定。對于HA效價〈1:8的樣品，取上一代收獲尿囊液繼續以相同 接種方式和劑量盲傳3代。在實際應用中，我們發現對于野外樣品（遷徙鳥糞、禽糞等），存 在外部環境的不可控性，樣本質量良莠不齊，即便對于同樣的一批樣本，因為各種不同的因 素的影響，病毒分離率不盡相同。
【發明內容】
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[0004] 針對上述問題，本發明提供一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，采 用增加處理病毒可感染的靶組織從而達到增加病毒分離幾率的目的，因此提高了病毒的分 離率。
[0005] 本發明一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，按照以下步驟進行：收 獲樣品接種雞胚的尿囊液、胚體，混合研磨，2500?4500rpm離心10?20min ;取上清，繼續 尿囊腔途徑盲傳，接種樣品〇. 1?〇. 3ml/胚。
[0006] 所述的尿囊液、胚體混合時，尿囊液的體積與胚體組織的質量比為1?3ml/g。
[0007] 本發明在雞胚水平的流感病毒分離的傳統傳代方法基礎上，通過增加處理病毒可 感染的靶組織，采用胚體與尿囊液混合研磨接種的傳代方式，成功提高了野外樣品的流感 病毒分離率，尤其對因高溫、強紫外線等特殊生境難以新鮮采集或質量不太理想的野外樣 本進行"挽救性"的病毒分離，提供了一個有效、可明顯提高病毒分離率的處理方法。
【具體實施方式】
[0008] 實施例1
[0009] 采用傳統雞胚尿囊腔傳代法和本發明雞胚胚體混合傳代法，進行禽流感病毒分離 率比較。同一份樣品同時采用兩種方法，分別各接種一枚雞胚。
[0010] 樣品為2008年青海省某縣新鮮疑似禽流感野鳥樣品196份。具體操作方法如下： 采用孵化9-11日齡的雞胚63枚，經照視后劃出氣室及胚胎位置，于氣室側方打一針孔；胚 胎位置朝上橫置卵架上，直接進針尿囊腔內接種樣品〇. 2ml/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個 針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4°C冰 箱過夜。收毒：無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼觀 察雞胚病理變化（如胚體發育不良、有出血點、充血或出血等），同時收獲雞胚胚體組織，尿 囊液進行HA效價測定。傳代：HA實驗陰性的樣品，無菌取第1代尿囊液1. 5ml，取胚體組織 約lg，研磨，3000rpm離心15min，取上清0. 2ml直接進針尿囊腔內接種樣品，作為第2代； 96小時后收毒，檢測尿囊液HA效價，HA實驗仍為陰性的樣品，無菌取第2代尿囊液及胚胎 組織，按上述同樣方式進行盲傳第3代，尿囊液進行HA效價測定。結果見表1。
[0011] 比較例1
[0012] 樣品為2008年青海省某縣新鮮疑似禽流感野鳥樣品196份。具體操作方法如下： 采用孵化9-11日齡的雞胚63枚，經照視后劃出氣室及胚胎位置，于氣室側方打一針孔；胚 胎位置朝上橫置卵架上，直接進針尿囊腔內接種樣品〇. 2ml/胚，以融化的石蠟封孔閉兩個 針孔，氣室朝上立于卵架上繼續孵化，棄去24小時內死亡雞胚，至96小時全部取出于4°C冰 箱過夜。收毒：無菌操作打開氣室部位蛋殼，撕開殼膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼觀 察雞胚病理變化（如胚體發育不良、有出血點、充血或出血等），尿囊液進行HA效價測定。 傳代：HA實驗陰性的樣品，無菌取第1代尿囊液0. 2ml按上述同樣方式進行盲傳第2代，96 小時后收毒，檢測尿囊液HA效價，HA實驗仍為陰性的樣品，無菌取第2代尿囊液0. 2ml按 上述同樣方式進行盲傳第3代，尿囊液進行HA效價測定。結果見表1。
[0013] 表1 :2008年青海省某縣新鮮疑似禽流感野鳥樣品病毒分離方法比較實驗結果
[0014]
【權利要求】
1. 一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，其特征在于按照以下步驟進行： 收獲樣品接種雞胚的尿囊液、胚體，混合研磨，2500?4500rpm離心10?20min ;取上清，繼 續尿囊腔途徑盲傳，接種樣品〇. 1?〇. 3ml/胚。
2. 按照權利要求1所述的一種提高禽流感病毒分離率的雞胚胚體分離方法，其特征在 于所述的尿囊液、胚體混合時，尿囊液的體積與胚體組織的質量比為1?3ml/g。
【文檔編號】C12R1/93GK104046595SQ201410292500
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】唐霜, 張忠, 夏菡, 范兆軍, 李天憲 申請人:中國科學院武漢病毒研究所