鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株及其應用，屬于鵝副黏病毒的分離及應用領域。本發明首先分離了一株鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株，其微生物保藏編號是：CGMCC No.9901。本發明進一步公開了一種制備預防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：(1)培養鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株，收集病毒液；(2)滅活病毒液；(3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。本發明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株對雞胚成纖維細胞高度適應，適合細胞培養；免疫原性良好，與胚毒制備的疫苗相比，具有產生抗體效價高并且節約生產成本等優點。
CGMCC No. 9901
20141022
【專利說明】鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及鵝副黏病毒，尤其涉及一株分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應 株，本發明還涉及所述分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株在制備預防鵝副黏病毒病 的疫苗中的用途，屬于鵝副黏病毒的分離及應用領域。
【背景技術】
[0002] 鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus, GPMV)是副黏病毒科，副黏病毒亞科，腿腺炎 病毒屬。鵝副黏病毒病是以消化道病變為主要特征的具有高度發病率和死亡率的烈性傳染 病，一年四季均可發生，發病率為40% -100%，平均為60%左右，死亡率為30% -100%，平 均為40%左右。不同日齡的鵝均易感染，但日齡越小發病率和死亡率越高，其中15日齡以 內雛鵝的發病率和死亡率可高達100%。隨鵝群日齡的增長，發病率和死亡率也隨之下降， 部分病鵝可逐漸康復。種鵝感染發病后，除死亡外，產蛋量大大下降，受精率也很低。
[0003] 目前，部分養殖戶用新城疫疫苗免疫鵝，以預防鵝副黏病毒。根據報道，新城疫病 毒一般不感染鵝，即使感染也不發病（Gagic et al，1999)。任濤等（2000)曾用國內NDV標 準強毒株F48E8攻擊28日齡的鵝，發現NDV強毒株對鵝的發病率和死亡率均為0。鵝副黏 病毒病至今仍無有效的治療方法，預防該病最行之有效的辦法是疫苗的接種。目前，市售的 鵝副黏病毒疫苗絕大多數為雞胚生產的組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品質 量批間差較大等缺點。因此，分離一株鵝副黏病毒細胞適應毒株，對于降低鵝副黏病毒疫苗 的生產成本、穩定產品質量具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一株鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus)雞胚 成纖維細胞適應株DQ03株，其具有在雞胚成纖維細胞上增殖的特性，免疫原性良好，產生 抗體效價高，且降低疫苗生產成本。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：
[0006] 本發明首先分離了一株鵝副黏病毒株，其具有在雞胚成纖維細胞上增殖的特性； 在此基礎上，本發明進一步馴化分離出了一株細胞適應毒，命名為DQ03株。
[0007] 本發明將分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株提交專利認可的機構 進行保藏，其微生物保藏編號為：CGMCC No. 9901 ;分類命名是：鵝副黏病毒；保藏時間是： 2014年10月22日；保藏單位是：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地 址是：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0008] 本發明從黑龍江省大慶市郊某養殖場無菌采集病死鵝的肝臟、脾臟等組織中分離 出一株鵝副黏病毒。分離病毒能被ND陽性血清所抑制，HI效為2 8;不能被EDS 76陽性血清、 H5和H9禽流感陽性血清所抑制。分離毒株的EID5tl為10 81VO. lml，腦內致病指數（ICPI) 為0. 16,雞胚平均致死時間（MDT)為114h，表明本發明分離的鵝副黏病毒毒株為低毒力病 毒。
[0009] 本發明將分離毒株接種在生長良好的雞胚成纖維細胞（CEF)上，36h后開始出現 典型的細胞病變，病變初期表現為細胞聚縮，之后，合胞體數量逐漸增多、變大；60h時75% CEF出現細胞病變，細胞逐漸脫落，細胞之間的空白區逐漸增大，殘留的細胞呈拉網狀結構； 當細胞病變達70%時，測定細胞液的HA效價為1 : 512。表明，分離毒株具有CEF細胞適 應株的特性。
[0010] 本發明將分離病毒進行蝕斑純化，挑選中等大小的5個蝕斑進行傳代純化，分離 得到5個病毒株，分別命名為DQOl株、DQ02株、DQ03株、DQ04株和DQ05株。分離到的5個 病毒株（DQ01?DQ05株）的HA及TCID5tl檢測結果表明，病毒DQ03株性能最優，其對雞胚 成纖維細胞高度適應，HA效價達1 :1024, TCID5tl達10 9_ 38TCID5tlA). lml，顯著高于其他分離毒 株。
[0011] 本發明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株能夠應用于制備預防鵝 副黏病毒病的疫苗。
[0012] 本發明進一步公開了一種預防鵝副黏病毒病的疫苗組合物，包括：免疫有效量的 鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株和藥學上可接受的佐劑。
[0013] 本發明還公開了一種制備預防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，包括以下步驟：
[0014] (1)培養所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株，收集病毒液；（2)滅活病 毒液；（3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。
[0015] 其中，步驟（1)所述培養是經雞胚成纖維細胞培養或者經SPF雞胚培養；優選為， 經雞胚成纖維細胞培養。
[0016] 步驟（2)所述滅活是向病毒液中加入終濃度為0. 1 %甲醛溶液，37°C滅活24小時。
[0017] 步驟（3)所述離心是5000r/min離心30min ;所述病毒上清液與佐劑按照體積比 I :1. 5混合；所述佐劑優選為進口油佐劑。
[0018] 本發明所述方法制備得到的鵝副黏病毒滅活疫苗，能夠有效預防鵝副粘病毒。
[0019] 本發明將分離的鵝副黏病毒DQ01-DQ05株分別制備油乳劑滅活疫苗；經雞胚成纖 維細胞培養，病毒液半成品的HA及TCID 5tl測定結果表明，DQ03株HA效價達1 :1024, TCID 5Q 達IO9 38TCID5tlA). lml，高于雞胚擴增的原始病毒液及其他分離株。動物免疫保護試驗結果 表明，分離的鵝副粘病毒DQ03株免疫原性良好，免疫后不同時間抗體效價均高于其他實驗 組，免疫后21天HI抗體效價達8. 51og2 ;與胚毒制備的疫苗相比，具有產生抗體效價高，并 且節約生產成本等優點。
[0020] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0021] 本發明分離的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株對雞胚成纖維細胞高度 適應，適合細胞培養；免疫保護試驗表明，分離的鵝副粘病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03 株免疫原性良好，與胚毒制備的疫苗相比，具有產生抗體效價高，并且節約生產成本、產品 質量穩定等優點。
[0022] 本發明所渉及到的術語定義
[0023] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0024] 術語"分離的"意指所指代的材料從其天然環境中取出。因此，經分離的生物材料 可以不含某些或所有細胞組分，即其中天然材料自然存在的細胞的組分（例如細胞質或膜 組分）。如果材料存在于細胞提取物或上清液中，那么它是經分離的。
[0025] 可互換使用的術語"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動物 中誘導免疫應答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護動物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對于疫苗或疫苗組合物典型的進一步組分，包括 例如佐劑或免疫調節劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經修飾的活疫苗中作為經減毒的生物體，或在經殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領域技術人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時超 過一種上述組分。
[0026] 術語"佐劑"意指包括一種或多種物質的組合物，所述物質增強疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當緩慢釋放抗原的組織儲存，并且還充當非特異性增強免疫應答的淋巴樣 系統激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨抗原的初次疫苗接種將無法引發體液或細 胞免疫應答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為分離毒在雞胚成纖維細胞中增殖；其中，A為細胞接毒前形態；B為細胞接 毒產生病變。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是范例性的，不對本發明的范圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護范圍。
[0029] 實施例1鵝副黏病毒的分離和鑒定
[0030] 1、實驗方法
[0031] 1.1病毒的分離
[0032] 病料來自黑龍江省大慶市郊某養殖場，無菌采集病死鵝的肝臟、脾臟等病料混合 剪碎并研磨，按I : 3(v/v)加入雙抗含量為2000IU/mL的滅菌PBS，置4°C冰箱作用4h， 4000r/min離心5min ;取上清經尿囊腔接種5枚10日齡SPF雞胚，0. 2mL/枚，置37°C孵育 120h ;棄去24h內死亡雞胚，以后每天照蛋兩次，將死亡雞胚放置4°C冰箱保存4-24小時； 收取48h?120h死亡雞胚尿囊液及羊水,作為傳代毒種，-20°C保存。
[0033] 1.2病毒的鑒定
[0034] I. 2. 1 血凝試驗（HA)
[0035] 取雞胚病毒液在96孔微量凝集板上用生理鹽水作倍比稀釋至212,同時設空白對 照及雞新城疫L系毒（購自中國獸醫藥品監察所）陽性對照，再加等體積1 %雞紅細胞后于 震蕩器上震蕩2?3min，置室溫25min后觀察結果。
[0036] 1. 2. 2血凝抑制試驗（HI)
[0037] 取25 μ 1雞新城疫陽性血清、EDS76陽性血清、H5和H9禽流感陽性血清在96孔微 量凝集板上用生理鹽水作倍比稀釋至2 12,每孔加25 μ 1血凝價4個單位的分離毒，并設陽性 對照（雞新城疫陽性血清，每孔加25 μ 1血凝價4個單位的雞新城疫L系毒），同時設陰性 (陰性血清+雞新城疫L系毒）及空白對照，再加1 %雞紅細胞25 μ 1后于震蕩器震蕩2? 3min，置室溫25min后觀察結果。
[0038] 1. 2. 3雞胚血清病毒中和試驗
[0039] 分別取收集的雞胚病毒液作10倍稀釋后與新城疫病毒陽性血清等量混合，感作 后，尿囊腔接種10日齡雞胚，每組5枚胚，0. Iml/胚，同時設病毒對照組和空白對照組，觀察 雞胚死亡情況。
[0040] 1. 2. 4動物回歸試驗
[0041] 將雞胚病毒液肌肉注射15日齡的鵝、雞各5羽，每羽0. 5ml，同時分別設空白對照 組。嚴格隔離飼養，每天觀察試驗動物發病和死亡情況。
[0042] 1. 2. 5 病毒 EID5tl測定
[0043] 將分離病毒用滅菌生理鹽水作KT1?KT9稀釋，并設立空白對照組，每個稀釋度接 種5枚10日齡非免疫雞胚，棄24h死亡胚，于接種后120h4°C過夜凍死雞胚，收獲雞胚尿囊 液，測定其HA效價，并參考Reed-Muench方法計算出病毒EID 5Q。
[0044] 1. 2. 6腦內致病指數（ICPI)的測定
[0045] 按照《中華人民共和國獸用生物制品規程》規定的方法測定ICPI。取1日齡SPF 雛雞10只，各腦內注射KT1稀釋的新鮮毒液50yL(接種針頭直徑0. 45mm，長5mm);另取2 只1日齡SPF雛雞以同樣方法注射生理鹽水50 μ L。接種后，每天在相應接種的時間觀察并 記錄雛雞的狀態，分正常（活動靈活，行動無共濟失調現象）、發病（包括麻痹、臥地不起，但 不包括只表現遲鈍的雞）和死亡，觀察8d，計算正常、發病、死亡雞的總數，根據不同的權值 (正常為〇、發病為1、死亡為2)累計總分數。ICPI為累計總分除以正常、發病和死亡雞的 累計總數的平均值。
[0046] 1. 2. 7雞胚平均致死時間（MDT)的測定
[0047] 將病毒用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，自KT4?KTltl分別接種9?10日齡 SPF雞胚，每個稀釋度接種5枚，0. Iml/枚，剩余病毒液4°C保存，8h后再將每個稀釋度接種 另外5枚雞胚。接種雞胚于37°C孵化7天，每天早晚各觀察1次，記錄使所有雞胚死亡的最 高稀釋度致死雞胚的平均時間。OEI推薦的判定標準是MDT < 60h為強毒型；60?90h為 中等毒力型；90h以上為低毒力。
[0048] 1. 3分離毒在雞胚成纖維細胞中增殖
[0049] (1)在無菌條件下取9日齡雞胚，取出胚胎置于滅菌平皿中，除去頭、爪、翅、內臟， 用Hanks液漂洗3次，去除血污，并剪成1?2mm 3大小的塊，加入Hank' s液充分沖洗，并 靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸棄上層液體，再加 Hank' s液，如此反復沖洗3遍后，吸棄上 清液；于沉淀組織塊內加入約4倍量的0. 25%胰酶溶液，振蕩混勻后置于37°C水浴中感作 5min，每隔Imin輕輕搖動一次。
[0050] (2)消化完畢后立即小心吸棄上層胰酶溶液，沿瓶壁加入5?6mLDMEM輕洗2次； 之后加入20mL I XDMEM營養液，用大口吸管吹打數十次，并靜置幾分鐘，待組織塊下沉，吸 取上層液體，用6層紗布過濾；沉淀組織塊中再加20mL的I XDMEM營養液，如此反復進行3 遍。按每個雞胚80mL的量補加 DMEM營養液。
[0051] (3)吸取細胞液用計數板進行細胞計數，調整細胞濃度為2X106個/mL，以每孔 4mL的量加入到6孔培養板中，將其置入CO 2培養箱中，37°C培養24h，將6孔細胞培養板中 已長成單層的雞胚成纖維原代細胞中的營養液吸棄，用Hanks液反復沖洗單層細胞3次；之 后，用不含血清的IXDMEM培養液將分離病毒尿囊液作IXlO 4倍稀釋，接種于單層細胞，每 孔接種量為500 μ L，置37°C感作lh，其間每隔20min輕輕晃動細胞培養板一次，使病毒與 細胞充分接觸、吸附；吸附完畢后吸出病毒液，每孔補加4mL含新生牛血清為2%的I XDMEM 營養液，將其置〇)2培養箱中37°C培養；同時，設空白對照孔；每日觀察記錄CPE情況，當細 胞病變達70 %時，經3次凍融后收毒，分裝于玻璃瓶內，留樣檢測HA ;按照上述方法，將分離 到的鵝副粘病毒在雞胚成纖維細胞上連續傳8-10代，直至分離毒在雞胚成纖維細胞上增 殖良好。
[0052] 1. 4分離毒蝕斑純化
[0053] (1)按照雞胚成纖維原代細胞培養所敘述的方法，制備雞胚成纖維原代細胞并接 毒，接毒后置37°C感作lh，其間每隔20min輕輕晃動6孔細胞培養板一次，使病毒與細胞充 分接觸、吸附；吸附完畢后，吸出病毒液，鋪一層不含中性紅的營養瓊脂糖，厚度約2mm，待 瓊脂糖凝固后倒置于37°C、5% CO2培養箱中進行培養；
[0054] (2)有細胞病變出現時滴加100 μ L含量為1/10000的中性紅溶液，倒置于37°C、 5% CO2培養箱中繼續避光培養并觀察出斑情況。當細胞培養板上出現清晰可見的蝕斑時， 即可進行挑斑。選擇蝕斑間間距明顯的培養孔，從中挑取具有代表性的優勢蝕斑，用200 μ L 去尖吸頭吸取選定的蝕斑后連同瓊脂糖一起放入500 μ L不含血清的I XDMEM培養液中。 將含有蝕斑及瓊脂糖的DMEM培養液反復凍融三次，使病毒充分釋放；之后再按上述方法將 其做連續的10倍稀釋（一般為IO 1?1〇4)后接種雞胚成纖維原代單層細胞，按上述方法挑 斑。
[0055] 2、實驗結果
[0056] 2. 1病毒分離結果
[0057] SPF雞胚尿囊腔接種，雞胚在48?120h死亡；致死胚體充血，尿囊膜水腫出血。
[0058] 2. 2血凝、血凝抑制試驗檢測結果
[0059] 尿囊液的HA效價為1 : 128,隨著代次增加，HA效價增大，最高達1 : 512。
[0060] 分離病毒能被ND陽性血清所抑制，HI效為28, HI試驗呈陽性；不能被EDS76陽性 血清、H5和H9禽流感陽性血清所抑制，HI試驗呈陰性。
[0061] 2. 3病毒中和試驗結果
[0062] 試驗組雞胚IOd后全部存活，而對照組雞胚在48?120h全部死亡。
[0063] 2. 4動物回歸試驗結果
[0064] 接種病毒分離物的鵝、雞均于第2d開始發病。病禽精神萎頓，食欲與飲水減少直 至廢絕。病程2?3d，至接種后第6d全部死亡。對照組均未受影響。
[0065] 病死鵝的臨診癥狀和剖檢病變與自然感染相似，接種后5d左右死亡，剖檢腸道可 見散在性淡黃色痂塊，易剝離，剝離后見潰瘍面，胰腺有灰白色壞死灶，腺胃及肌胃粘膜充 血、出血。病死雞的臨診癥狀和剖檢病變與雞新城疫非常相似。
[0066] 2. 5EID5(^UlJ定結果
[0067] 用 Reed 和 Muench 法計算毒株 EID5tl，得出分離毒株 EID5tl= 10 81V〇. 1ml。
[0068] 2. 6腦內致病指數（ICPI)及（MDT)的測定結果
[0069] ICPI = 13/80 = 0. 16 ;雞胚平均致死時間（MDT)為114h，確定分離的毒株為低毒 力病毒。
[0070] 2. 7分離毒在雞胚成纖維細胞中增殖結果
[0071] 將分離株接種在生長良好的CEF上，36h后開始出現典型的細胞病變，病變初期表 現為細胞聚縮，之后，合胞體數量逐漸增多、變大；60h時75% CEF出現細胞病變，細胞逐漸 脫落，細胞之間的空白區逐漸增大，殘留的細胞呈拉網狀結構（圖1);當細胞病變達70% 時，收集細胞連同細胞液反復凍融三次，測定細胞液的HA效價為1 : 512。結果表明，分離 株具有CEF細胞適應株的特性。
[0072] 2. 8分離毒蝕斑純化結果
[0073] 分離株滴加中性紅5?8h后形成無色、透明、清亮的圓形蝕斑；鏡檢發現蝕斑中 心為圓縮成葡聚團狀的不著色的死細胞，周圍被吞噬大量中性紅顆粒的正常細胞所包圍。 挑選中等大小的5個蝕斑進行傳代純化，將分離到的5個病毒株（DQ01-DQ05)蝕斑克隆作 5 X IO3倍稀釋，接種雞胚成纖維細胞后置37°C孵育72h ;當細胞病變達70%時，經3次凍融 后收毒，并進行雜菌檢驗。同時，測定其血凝價（HA)及TCID5Q。
[0074] 分離到的5個病毒株DQOl?DQ05株HA及TCID5tl檢測結果見表1。
[0075] 表IDQO1?DQ05株HA及TCID5tl檢測結果
[0076]
【權利要求】
1. 一株分離的鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus)雞胚成纖維細胞適應株DQ03株，其 特征在于，其微生物保藏編號是：CGMCC No. 9901。
2. 權利要求1所述的鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株在制備預防鵝副黏病 毒病的疫苗中的用途。
3. -種預防鵝副黏病毒病的疫苗組合物，其特征在于，包括：免疫有效量的權利要求1 所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株和藥學上可接受的佐劑。
4. 一種制備預防鵝副黏病毒滅活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)培養權利要求1所述鵝副黏病毒雞胚成纖維細胞適應株DQ03株，收集病毒液；（2) 滅活病毒液；（3)離心，取病毒上清液，與佐劑混合，乳化，即得。
5. 按照權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（1)所述培養是經雞胚成纖維細胞 培養或者經SPF雞胚培養；優選為，經雞胚成纖維細胞培養。
6. 按照權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（2)所述滅活是向病毒液中加入終 濃度為〇. 1%甲醛溶液，37°C滅活24小時。
7. 按照權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（3)所述離心是5000r/min離心 30min〇
8. 按照權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（3)所述病毒上清液與佐劑按照體 積比1 :1. 5混合；所述佐劑優選為進口油佐劑。
9. 由權利要求4至8任何一項所述方法制備得到的鵝副黏病毒滅活疫苗。
【文檔編號】C12N7/00GK104498440SQ201410707310
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】孫德君, 丁國杰, 楊萬秋, 梁宛楠, 李來旭, 宋揚, 藏玉婷, 劉鑫瑩, 張智明, 李鑫, 竇海艷 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司