一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法，屬于生物【技術領域】。所述方法包括以下步驟：選取待測水稻和對照水稻，選取的所述對照水稻為未感染白葉枯病但與待測水稻在相同條件下栽培的水稻；分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示；根據所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA166b基因的表達量，判斷實驗是否成功，若成功，進一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。本發明提供的預測方法獲得了成功，可以在水稻白葉枯病癥出現前數天實現準確預報，為早防早治贏得了時間，減少了白葉枯病對水稻造成的損失。
【專利說明】—種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別涉及一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法。
【背景技術】
[0002]水稻是我國主要糧食作物，白葉枯病是水稻兩大主要病害之一，屬世界性病害，亞洲稻區發生尤重。白葉枯病發病率高、傳染快，發病稻田減產20-30%，甚至50%。與大部分病害一樣，白葉枯病發病早期防治效果較佳。發病中后期，病菌已大量繁殖，已對水稻造成了傷害，防治效果較差。由此可見，早期預報是水稻白葉枯病預防的關鍵所在。
[0003]傳統水稻白葉枯病預報主要依據氣候、天氣、品種抗性、氮肥施用情況、以及病害歷史等進行推測，也可依據田間水稻白葉枯病癥狀表現，對后期病情發展進行預報。
[0004]在實現本發明的過程中，發明人發現現有技術至少存在以下問題:
[0005]根據天氣、氣候、品種抗性、栽培現狀和歷史等進行的預報結果是很模糊的，可說明在一定區域與時間范圍內病害發生的概率，但不能預報病害發生的具體時間與地點，預報結果的可應用性較差。例如，高溫高濕常作為水稻白葉枯病的流行預報的氣候條件，但不能確定高溫高濕下病害是否一定出現、在那塊田出現、在那天出現。由于以上的不確定性，農民不能決定是否開始防治白葉枯、對哪塊田進行防治、以及何時防治。同時，病癥出現表明白葉枯病已進入中后期，病菌已大量繁殖，白葉枯病流行已難以避免，使得利用病癥調查進行預報的工作也無太大實際意義。
【發明內容】
[0006]為了解決現有技術中水稻白葉枯病預報不及時、不準確的缺點，本發明實施例提供了一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法。所述技術方案如下:
[0007]選取9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻；
[0008]栽培所述待測水稻和所述對照水稻；
[0009]分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因；
[0010]分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示；
[0011]根據所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA166b基因的表達量,判定實驗是否成功，若成功，則進一步判定所述待測植株是否感染白葉枯病。
[0012]具體地，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
[0013]進一步地，所述保護性栽培措施包括對土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0014]具體地，在上午8:55~9:05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。
[0015]具體地，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA166b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。
[0016]進一步地，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括:
[0017]利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度；
[0018]向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質量的0.05 %，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0019]將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環化的所述總miRNA基因和環化的所述外源參考miRNA基因的混合液；
[0020]將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄，得到的逆轉錄產物用于進行所述實時定量PCR檢測。
[0021]進一步地，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA166b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括:
[0022]將2 μ I所述逆轉錄產物、3 μ I濃度為I μ M的引物、10 μ I定量PCR混合物和
0.4 μ I 50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，67°C 30秒，共45個循環，其中，66°C 30秒和67V 30秒這兩步在每循環一次后分別增加0.1°C和0.2°C，在每一次循環的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少；
[0023]所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA166b基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA166b基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
[0024]進一步地，將所述總miRNA基因的5’端與3’端連接的步驟包括:
[0025]取5 ng所述第一混合液、2 μ I 1X反應緩沖液、I μ I 50mM的MnCl2、4 μ I 5Μ的甜菜堿和I μ I 5 u/μ I的環化酶，用水補足20μ I后混勻，得到第三混合液，將所述第三混合液于60°c保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活，得到所述環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液。
[0026]進一步地，將所述環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液體進行逆轉錄的步驟包括:
[0027]取所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5μ1濃度為I μΜ的逆轉錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5 μ I濃度為100 mM的DTT和20 U的逆轉錄酶，用水補足50 μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉錄產物；所述逆轉錄引物包括mi RNA166b基因的逆轉錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉錄引物，所述miRNA166b基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示。
[0028]具體地，所述判定實驗是否成功方法為:若所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量最大值與表達量最小值的比值小于1.5，則實驗成功；若所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量最大值與表達量最小值的大于等于1.5，則實驗不成功。
[0029]具體地，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測水稻的miRNA166b基因的表達量小于2倍所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量，則所述待測水稻未感病；若所述待測水稻的miRNA166b基因的表達量大于或等于2倍的所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量，則所述待測水稻感病。
[0030]本發明實施例提供的技術方案帶來的有益效果是:本發明提供的一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法，可將miRNA166b基因的表達變化可作為水稻感染白葉病菌的標志物，用以明確待測水稻是否染病，以及明確發病的時間與田塊，避免了傳統病害預報的模糊性。同時，本發明的預測時間早，可在水稻感染白葉枯病24小時內作出預報。
【具體實施方式】
[0031]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施方式作進一步地詳細描述。本發明中未標注說明的試劑均為常用市售試劑，在大多數生物技術公司均可購買到且效果幾乎無差別。
[0032]實施例
[0033]本發明實施例將9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻，其中，待測水稻是指種植于大田正常栽培條件下，需要監控是否感染白葉枯病的水稻；對照水稻是指通過保護性技術措施和白葉枯病防治措施，確保其為沒有感染白葉枯病的健康水稻，除保護性栽培措施和防治白葉枯病外，對照水稻與待測水稻的栽培條件保持一致，其中，保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
[0034]種子的選取:待測水稻的種子和對照水稻的種子均收獲于健康的9311水稻植株，并且種子表面無明顯病蟲害危害癥狀。
[0035]種子的前處理、播種與栽培條件:對照種子與待測種子均用濃度為70%的酒精浸泡2分鐘，再用去離子水洗2次，在30°C的水中浸泡過夜，在30°C的溫度下對種子進行催芽，種子出芽后播種。
[0036]從待測水稻生長的田塊中取土壤，利用滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產，型號為YSQ-LS-50S11)對土壤進行高溫高壓消毒滅菌，消毒滅菌條件為:120°C，30分鐘。消毒后的土壤作為對照水稻的種植土壤。將對照水稻在隔離條件下播種、移栽、生長于填有消毒土壤的塑料盆中，待測水稻則種植于大田環境中，栽培待測水稻和對照水稻時，除保護性栽培措施與白葉枯病防治措施外，待測水稻與待測水稻的栽培條件保持一致。
[0037]保護性栽培措施包括:(I) 土壤隔離:利用盆栽，使對照水稻生長的土壤與大田土壤隔離，避免通過土壤傳病感染白葉枯病；(2)水源隔離:采用自來水灌溉對照水稻，確保大田水源不進入對照水稻，避免通過水源感染白葉枯病；(3)空間隔離:對照水稻周圍10米不種植其它水稻，避免與帶白葉枯菌的水稻葉片摩擦感染白葉枯病。待測水稻不防治白葉枯病，除保護性栽培措施與白葉枯病防治措施外對照水稻與待測水稻的栽培條件盡可能保持一致，包括播種、移栽、施肥、防蟲、防病(除白葉枯病外其它病害)等生產管理措施同時、同步進行。
[0038]具體地，在對照水稻周圍10米范圍內，不播種或種植其它水稻；對照水稻灌溉水采用干凈的自來水；除以上條件外，對照與待測水稻的其它栽培條件與普通大田常規栽培條件相同，但所有栽培措施在對照水稻與待測水稻間保持一致，如播種、移栽、施肥、防蟲、防病(除白葉病外其它病害)等生產管理措施同時、同步進行。本次試驗中，播種期為2010年11月27日，地點為海南瓊海。
[0039]將對照水稻和待測水稻采用相同的栽培條件種植，使對照水稻和待測水稻能夠在相同的條件下生長，保證對照水稻和待測水稻的表達量不受栽培條件的影響。
[0040]在需要預報白葉枯病是否發生的時期，如苗期和破口期至抽穗揚花期，在上午8:55~9:05分別取倒數第二片中部2/3的部位的葉片。每次對照水稻與待測水稻各取至少3片葉片混合，用于代表對照水稻與待測水稻的樣本。所取葉片立即置于液氮中保存至總miRNA基因的提取。在本實施例中，取樣時間段為2011年2月28號至當年3月3號，連續取樣5天，共獲得對照水稻與待測水稻各5個樣本，分別編號為Cl~C5和Tl~T5，其中C表示Control, T表示Treatment,其中，對照水稻與待測水稻取樣的時間點是一致的,對照水稻和待測水稻所選取的葉片位置也是相同的，這能夠使對照水稻和待測水稻之間的生物時鐘與發育狀態是相同的，只有選取生物時鐘與發育狀態均相同的葉片才能進一步保證對照水稻和待測水稻間的miRNA表達量比較不受生物時鐘與發育的影響。
[0041]分離總miRNA基因:利用miRNA基因分離試劑盒(miRNA基因分離試劑盒為市售，貨號:R6727，生產公司:0mega，該試劑盒具體包括:RNA離心柱、基因組DNA去除離心柱、離心管、MCL裂解緩沖液、XD結合緩沖液、RNA洗脫液II和DEPC水)分離上述Cl~C5和Tl~T5水稻葉片中的總miRNA基因。
[0042]具體操作方法如下:從液氮中分別取出Cl~C5和Tl~T5水稻葉片樣本，分別置于10個研缽中，并立即向研缽中倒入液氮，充分研磨，分別研磨可以避免交叉污染。向每個研缽中取大約10mg研磨好的粉末置于1.5ml的離心管中，加700 μ L的裂解液，渦旋30秒以混勻樣品，55°C保溫30分鐘，在離心力為12000Xg的室溫條件下離心5分鐘，得到上清液，并將上清液轉移至離心柱中離心，用于去除基因組中的DNA，經12000Xg室溫離心2分鐘，并將流出的液體轉移至一個新的1.5mL的離心管中，向該流出的液體中加入該液體體積1.1倍的無水乙醇并渦旋20秒混勻，將該渦旋后的液體轉移至RNA離心柱中經12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L濃度為96-100%的乙醇到RNA離心柱中，再經12000 Xg室溫離心I分鐘，棄離心液，加入500 μ L XD結合緩沖液到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，再加入750 μ L RNA洗脫液II到RNA離心柱中，12000 X g室溫離心I分鐘，棄離心液，將RNA離心柱在大于12000Xg的最大速度下，室溫離心2分鐘，向RNA離心柱中加入30-50 μ L DEPC水，室溫下放置5分鐘后，在大于12000 Xg的最大速度下，室溫離心I分鐘，離心獲得的液體即為含有總miRNA基因的溶液，將該溶液保存于_70°C備用。
[0043]實時定量PCR(polymerase chain react1n,聚合酶鏈式反應)方法的前處理步驟包括:
[0044]總miRNA基因的定量:利用分光光度計(分光光度計由美國Quawell公司生產，型號為Q5000)中RNA定量程序，測定并獲得分離的總miRNA基因的濃度，根據濃度與體積計算總miRNA基因的質量。
[0045]向分離的總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液:外源參考miRNA基因的加入量為分離的總miRNA基因質量的0.05%，外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，其由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。
[0046]miRNA基因環化:取含有約5ng總miRNA基因的第一混合液、2 μ I 1X反應緩沖液、I μ I 50 mM的MnCl2、4 μ I 5 M的甜菜堿和I μL 5 u/μ I的環化酶,用水補足20 μ I后混勻，得到第三混合液；將第三混合液于60°C保溫15分鐘后，80°C保溫10分鐘，使酶失活。將總miRNA基因和外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，獲得環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液，該混合液用于滾環逆轉錄。其中，環化酶由美國Epicentre公司生產，貨號為CL9021K。隨該酶一起提供的還有:10X反應緩沖液、50mM的MnCl2、5M的甜菜堿和無酶水。
[0047]環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液的逆轉錄:取環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5y I濃度為100 mM的DTT、20 U的逆轉錄酶(美國Invitrigen公司生產,貨號為18064-014)和5μ I 1X的逆轉錄緩沖液(隨逆轉錄酶一起提供)，用水補足50 μ I混勻后，42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活。該逆轉錄引物包括miRNA166b基因的逆轉錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉錄引物，miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；據此設計的miRNA166b基因的逆轉錄引物如序列表中SEQ ID N0:7所示；外源參考miRNA基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示，上述逆轉錄引物均由美國Invitrigen公司合成。其中，逆轉錄包括兩類，一類為目標基因，即miRNA166b基因的逆轉錄，另一類為外源參考miRNA基因(外源參考miRNA基因命名為ECK基因)的逆轉錄，兩個逆轉錄過程平行進行，且所有反應成份與條件均相同，僅逆轉錄引物不一致。對于miRNA166b基因的逆轉錄反應來說，所設計的逆轉錄引物的最后一個堿基(決定引物特異性的關鍵堿基)不能與miRNA166家族中miRNA166c和miRNA166g兩個成員配對，因而不能對它們進行逆轉錄，降低了它們對結果的干擾。在前期研究中發現:除miRNA166b、miRNA166c和miRNA166g外，miRNA166家族中其它成員要么在感染白葉枯病24小時內，表達也上升2倍以上，要么表達量僅miRNA166b的1/20左右，而miRNA166b在感染白葉枯后24小時內，表達量上升了 4倍以上，因此，上升2倍是一個寬松的判斷標準。因此，在逆轉錄引物設計時，并不刻意區分除miRNA166c和miRNA166g外的miRNA166家族的其它成員，因為它們并不干擾對結果的判斷。
[0048]實時定量PCR方法檢測逆轉錄產物的表達量:實時定量PCR同樣包括兩類，一類為目標基因，即miRNA166b基因的實時定量，另一類為外源參考miRNA基因的實時定量，二者平行進行，所有反應成份與條件均相同，僅引物不相同。引物包括:miRNA166b基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:3所示；miRNA166b基因反向引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所不,其中設計的miRNA166b的反向引物和最后一個喊基(決定引物特異性的關鍵喊基)不能與miRNA166家族中miRNA166c和miRNA166g兩個成員配對，因而不能對它們進行PCR擴增，降低了它們對結果的干擾。在前期研究中發現:除miRNA166b、miRNA166c和miRNA166g外，miRNA166家族中其它成員要么在感染白葉枯病24小時時內，表達也上升2倍以上，要么表達量僅miRNA166b的1/20左右，而miRNA166b在感染白葉枯后24小時內，表達量上升了 4倍以上，因此，上升2倍是一個寬松的判斷標準。因此，在定量PCR引物設計時，并不刻意區分除miRNA166c和miRNA166g外的miRNA166家族的其它成員他們，因為它們并不干擾對結果的判斷。引物還包括:外源參考miRNA基因正向引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所示；外源參考miRNA基因反向引物序列為如序列表中SEQ ID N0:6所示。實時定量PCR引物均由美國Invitrigen公司合成。
[0049]實時定量PCR方法的具體步驟如下:取2 μ I上述逆轉錄產物、3 μ I濃度為I μ M的引物(這里的引物指正向引物和反向引物等摩爾比混合物，即指序列如序列表中SEQ IDΝ0:3所示的miRNA166b基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA166b基因反向引物的等摩爾比的混合物，或者指序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物和序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物的等摩爾比的混合物)、10 μ I日本Toyobo公司生產的定量PCR混合物(貨號為QPS-201)和0.4 μ 150倍的ROX熒光校正染料(由日本Toyobo公司生產，并且隨QPS-201—起提供)混合均勻，得到第二混合液，將該第二混合液在ABI StepOne實時定量PCR儀中按如下程序進行實時定量PCR檢測:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66°C 30秒，670C 30秒，共45個循環，其中，66°C 30秒和67°C 30秒在每循環一次后分別增加0.1°C和
0.2°C，在每一次循環的最后一步收集熒光信號，熒光信號的強弱用于衡量表達量的多少。實時定量的結果由Microsoft Excel 2010進行處理，數據處理時以外源參考miRNA基因為miRNA166b表達分析的參考基因。結果見表1:
[0050]表1 miRNA166b基因在對照水稻與待測水稻間的相對表達量
[0051]
【權利要求】
1.一種利用miRNA166b基因預報水稻白葉枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 選取9311水稻品種作為待測水稻和對照水稻； 栽培所述待測水稻和所述對照水稻； 分別分離所述待測水稻和所述對照水稻中的總miRNA基因； 分別檢測所述待測水稻和所述對照水稻中的所述總miRNA基因中的miRNA166b基因的表達量，所述miRNA166b基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示； 根據所述待測水稻和所述對照水稻中的miRNA166b基因的表達量，判定實驗是否成功，若成功，則進一步判斷所述待測植株是否 感染白葉枯病。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待測水稻和所述對照水稻時，所述對照水稻在栽培時采用保護性栽培措施并防治白葉枯病，除所述保護性栽培措施和防治白葉枯病外，所述對照水稻與所述待測水稻的栽培條件保持一致。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述保護性栽培措施包括土壤隔離、水源隔離和空間隔離。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8:55~9:05利用所述待測水稻和所述對照水稻的相同葉片的相同部位進行所述總miRNA基因的分離。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA166b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述實時定量PCR方法的前處理步驟包括: 利用分光光度計測定并獲得分離的所述總miRNA基因的濃度； 向所述總miRNA基因中加入外源參考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源參考miRNA基因的加入量為所述總miRNA基因質量的0.05%，所述外源參考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示； 分別將所述總miRNA基因和所述外源參考miRNA基因的5’端與3’端連接，得到環化的所述總miRNA基因和環化的所述外源參考miRNA基因的混合液； 將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄，得到的逆轉錄產物用于進行所述實時定量PCR檢測。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用實時定量PCR方法，檢測所述miRNA166b基因在所述待測水稻和所述對照水稻中的表達量，包括: 將2 μ I所述逆轉錄產物、3 μ I濃度為I μ M的引物、10 μ I定量PCR混合物和0.4μ I 50倍的ROX熒光校正染料混合均勻，得到第二混合液，將所述第二混合液在實時定量PCR儀中進行反應，所述反應程序為:50°C 2分鐘；95°C 10分鐘；95°C 45秒，56°C 45秒，66V 30秒，67°C 30秒，共45個循環，其中，66°C 30秒和67V 30秒在每循環一次后分別增加0.1°C和0.2°C，在每一次循環的最后一步收集熒光信號，所述熒光信號的強弱用于衡量所述表達量的多少； 所述引物包括:序列如序列表中SEQ ID N0:3所示的miRNA166b基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:4所示的miRNA166b基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID N0:5所示的外源參考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID N0:6所示的外源參考miRNA基因反向引物。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，將所述環化的總miRNA基因和所述環化的外源參考miRNA基因的混合液進行逆轉錄的步驟包括: 取所述環化的總miRNA基因和環化的外源參考miRNA基因的混合液2 μ 1、5 μ I濃度為I μ M的逆轉錄引物、2 μ I濃度為10 mM的dNTP、5 μ I濃度為10mM的DTT和20 U的逆轉錄酶，用水補足50 μ I混勻后，得到第四混合液，將所述第四混合液于42°C保溫2小時，75°C保溫15分鐘，使酶失活，得到所述逆轉錄產物；所述逆轉錄引物包括miRNA166b基因的逆轉錄引物和外源參考miRNA基因的逆轉錄引物，所述miRNA166b基因的逆轉錄引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示，所述外源參考miRNA基因的逆轉錄引物序列如序列表中 SEQ ID NO:8 所示。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定實驗是否成功的方法為:若所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量最大值與表達量最小值的比值小于1.5，則實驗成功；若所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量最大值與表達量最小值的比值大于等于1.5，則實驗不成功。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，判定所述待測植株是否感染白葉枯病的方法為:若所述待測水稻的miRNA166b基因的表達量小于2倍所述對照水稻的miRNA166b基因的表達量，則所述待測水稻未感病；若所述待測水稻的miRNA166b基因的表達量大于或等于2倍的所述對照 水稻的miRNA166b基因的表達量，則所述待測水稻感病。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131076SQ201410305410
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月30日 優先權日:2014年6月30日
【發明者】馮濤, 陳利紅 申請人:江漢大學