一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株及其分離培養方法和應用
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及病毒微生物領域，屬于獸用生物制品領域，具體涉及一株豬流行性腹 瀉病毒變異毒株、其分離培養方法和在制備豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗中的應用。 二、
【背景技術】：
[0002] 豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea, PED)最早于1971年在英國的初生 仔豬和育肥豬群中被發現，19世紀80年代，亞洲也報道了 PED的發生，并在之后持續流行。 隨著PED弱毒疫苗和滅活疫苗的廣泛使用，在多年內，全世界PED的流行得到了一定的控 制。但是2010年底，中國再次暴發了 PED，此次流行的PED主要侵害1周齡內仔豬，造成感 染仔豬嘔吐、腹瀉、繼而脫水和急性死亡，隨后日本、韓國、泰國等亞洲國家以及德國、法國、 瑞士、匈牙利、意大利等歐洲國家也相繼報道了 PED的暴發。2013年4月，美國愛荷華州首 例PH)被公布，之后一年時間內，快速席卷了美國31個州，造成了養豬業重大的經濟損失。
[0003] 引起PED的兀兇PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬α冠狀病毒，該病毒屬于單股 正義RNA病毒，基因組全長約28Kb，至少編碼7個開放閱讀框，編碼順序為5' UTR-ORFla-O RFlb-S-0RF3-E-M-N-3'UTR，病毒粒子直徑為130nm(95nm~190nm)，囊膜上有花瓣狀纖突， 長18nm~23nm，由核心向四周呈放射狀。
[0004] PEDV的體外分離一直相對困難，Vero細胞的來源、毒株間的差異及培養條件上的 一些細節把握均會對PEDV的分離造成影響。本發明在多次成功分離PEDV的經驗基礎上， 總結了一套實用的病毒分離和培養方法，同時，大量的基因組序列測定及進化樹分析發現， 新出現的流行毒株同傳統的如CV777之類的疫苗毒株相比已經發生了較大的變化，使得傳 統疫苗不能夠對新的病毒感染提供足夠的保護力，因此，分離新的流行毒株并且在此基礎 上制備新的疫苗已經迫在眉睫，本發明便是在此背景下應運而生。 三、
【發明內容】
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[0005] 本發明要解決的技術問題是：提供一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株及其分離培養 方法和應用。本發明所分離的一株毒株經過序列測定，對S基因和0RF3基因（基因序列詳 見附件seql和seq2)的序列比較表明，該變異毒株同國內外早期毒株和經典疫苗株均存在 差異，利用該變異毒株制備的滅活疫苗免疫母豬后對所產仔豬能夠起到很好的保護作用。
[0006] 本發明通過以下技術方案實現上述目的：
[0007] 本發明提供的一株豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus)變異 毒株，其菌種微生物保藏號為：CGMCC NO. 10893。
[0008] 所述豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus)變異毒株的保藏信 息如下：
[0009] 分類命名：豬流行性腹瀉病毒；
[0010] 保藏單位：中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心（CGMCC);
[0011] 保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；
[0012] 保藏日期：2015年6月18日；
[0013] 保藏編號：CGMCC NO. 10893。
[0014] 本發明的積極有益效果：
[0015] 本發明技術方案將為豬流行性腹瀉病毒的分離培養提供一種穩定可靠的方法，為 目前豬流行性腹瀉病毒變異毒株所造成的豬流行性腹瀉疾病提供有效的防制手段。 四、
【附圖說明】：
[0016] 圖1 :采集腹瀉仔豬小腸內容物的PCR產物電泳檢測圖；
[0017] 圖1中，M :DL2000 DNA Marker ;1 :CV777細胞毒；2 :空白對照；3-7 :采集的腹瀉仔 豬小腸內容物。
[0018] 圖2 :間接免疫熒光對病毒的檢測圖；
[0019] 圖2中，無水乙醇固定，3% BSA封閉，一抗為抗PEDV S蛋白的兔多克隆抗體（1:50 稀釋），二抗為FITC (異硫氰酸熒光素）標記的羊抗兔IgG (1:500稀釋）；顯示比例200 X。
[0020] 圖3 :透射電鏡對病毒的檢測圖。 五、
【具體實施方式】：
[0021] 實施例1 :本發明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株：
[0022] 本發明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株，毒株命名為CH/ZMDZY/11，于2015年6月 18日保藏于中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO. 10893。保藏 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0023] 本發明一株豬流行性腹瀉病毒變異毒株的分離培養方法，詳細步驟為：
[0024] a、病料的采集與處理：
[0025] 采集出現水樣腹瀉仔豬的小腸內容物，用IXPBS緩沖液以1 :1的體積比進行稀 釋，震蕩混勾后于1000 OXg條件下離心l〇min，取上清，采用0. 22 μπι濾器過濾除菌，所得處 理液分裝凍存于-70°C，備用。
[0026] b、病料的RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈式擴增反應）檢測：
[0027] 取步驟a所得處理液200 μ L，采用TRizol法提取RNA ;然后建立 如下反轉錄反應體系：5XM-MLV Buffer 4 μ L、dNTP(10mM)l μ L、下游引物 5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3 (25 μ Μ) 1 μ L、M-MLV 反轉錄酶（200U · μ L 3 0· 5 μ L、 RRI (Recombinant RNase Inhibitor) (40U· yL、RNA200ng，DEPC (焦碳酸二乙酯） 水補足20 μ L，混勻后置于PCR儀上，反應采用如下程序：42°C處理lh，70°C滅活15min ;
[0028] 反轉錄后獲得的cDNA用下述引物進行PCR，上游引物：5-CTTCCGAGTGT AGTTGAGAT-3，下游引物：5-TTACCACCAAAGAGCAAT-3，引物定位于PEDV的N基因，擴增產物大 小 629bp，擴增采用 50 μ L 反應體系：10 XBuffer (含 Mg2+) 5 μ L、dNTP (IOmM) 1 μ L、上下游引 物（25 μ Μ)各 1 μ L、Taq 聚合酶（5U · μ L 3 0· 5 μ L、cDNA 100ng，CldH2O 補足 50 μ L ;PCR 反 應條件為：95°(：預變性51^11;95°(：變性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8,30個循環 ；最后 72°C延伸5min ;同時設立空白對照（以去離子水為空白對照）和CV777毒株陽性對照；
[0029] 反應結束后，取IOyL PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（結果詳見附圖 1);檢測為PCR陽性的病料，分別進行豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、豬偽狂犬病毒（PRV)、豬 圓環病毒2型（PCV2)和豬瘟病毒（CSFV)四種外源病毒的檢測，檢測結果為陰性的病料進 行下一步的病毒分離；
[0030] c、豬流行性腹瀉病毒的分離傳代：
[0031] 6孔板每孔接種I X IO6個Vero細胞（ATCC CCL-81)，24h內接種步驟a中除菌分 裝凍存的處理液，產物依次進行5倍稀釋，取5 2-5 4三個稀釋度各500 μ L接種，接種前棄 去培養液，用PBS液清洗兩遍，同時設置陰性對照孔（采用DMEM培養基為陰性對照），于 37°C、5% CO2培養箱吸附Ih后，每孔補加 I. 5mL維持液（維持液中含0. 3%胰蛋白胨磷酸 鹽肉湯、0. 02%酵母提取物和5 μ g/ml胰酶的I XDiffiM培養基），37°C、5% CO2培養箱培養， 24h后，其中一個樣品接種稀釋度為5 2的孔出現典型的病變，即細胞融合、合胞體形成，繼 續傳代至第10代，仍然出現典型的病變，分離得到一株可穩定傳代的PEDV毒株，命名為CH/ ZMDZY/ll〇
[0032] 本發明豬流行性腹瀉病毒變異毒株的間接免疫熒光檢測：
[0033] 6孔板每孔接種I X IO6個Vero細胞，24h內按感染復數0. 1接種上述分離出來的 病毒，接種前棄去培養基，采用PBS緩沖液清洗兩遍，同時設立不接毒的細胞對照孔（加入 DMEM培養基）；于37°C、5% CO2培養箱吸附lh，棄上清，每孔加入與上述步驟c中同樣的 維持液，24h后在顯微鏡下觀察，接毒細胞發生病變，棄去上清，采用PBS緩沖液洗滌3遍， 用-20°C預冷的無水乙醇固定30min，PBS洗滌3次，然后采用3% BSA封閉lh，棄上清，每 孔加入500 yL的抗PEDV S蛋白的兔多克隆抗體（1:50稀釋，3%BSA稀釋），37°C孵育Ih 后，PBS洗滌3次，每次5min ;接著每孔加入500 μ L FITC (異硫氰酸熒光素）標記的羊抗兔 IgG (1:500稀釋，3% BSA稀釋），37°C孵育30min后，PBS洗滌3次，每次3min ;倒置熒光顯 微鏡觀察結果。結果顯示：陰性對照細胞沒有熒光，接毒孔在細胞病變處均有很亮的熒光， 進一步證明本發明所分離病毒為豬流行性腹瀉病毒，結果詳見附圖2。
[0034] 本發明豬流行性腹瀉病毒變異毒株的電鏡檢測：
[0035] T25細胞培養瓶接種2 X IO6個Vero細胞，24h內按感染復數0. 1接種病毒，接種 24h后在顯微鏡下觀察，病變達到80%，細胞刮刀刮下細胞層，收集到1.5mL EP管中，反復 凍融3次，10000 X g離心30分鐘，取上清用3 %磷酸鎢負染，透射電鏡檢測