一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗葉斑病中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種尖孢鐮刀菌，其分類命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌(Fusarium?oxysporum)，菌株號為JSNL002，現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9566，保藏日期為2014年8月15日。本發明尖孢鐮刀菌JSNL002在提高鐵皮石斛生長抗葉斑病能力等方面作用效果顯著；且能夠人工培養，繁殖速度快，便于進行規模化生產，具有良好的開發應用前景。
【專利說明】一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗葉斑病中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物【技術領域】，具體涉及一種尖孢鐮刀菌及其在鐵皮石斛抗病中的 應用。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，研究表明，從其種子萌發到苗的健 康生長，無不需要共生真菌的參與。由于野生鐵皮石斛資源瀕臨枯竭，目前，鐵皮石斛的 市場需求主要靠人工栽培，但人工種植鐵皮石斛生長速度慢，平均產量低，病害發生較為嚴 重。目前，病害的防治仍然主要依靠農藥。從保護生態環境和食品安全的角度出發，鐵皮石 斛作為名貴中藥，應盡可能減少農藥、化學肥料的施用量。菌根是土壤中菌根真菌與植物根 系形成的具有特定形態結構和功能的共生體，是自然界中普遍存在的一種共生現象。蘭科 植物對菌根的依賴性較強，菌根真菌與植物根系互為條件形成共生體，在生理上是一個相 互協調的整體，并在共同進化的過程中，形成特定的形態特征。菌根真菌與宿主植物的相互 關系多數情況下是互利的，菌根真菌從植物體內獲取生長必需的營養物質，而植物通過與 共生真菌結合，也能更好的從土壤中得到所需的養分及水分等。合理利用菌根資源，提高鐵 皮石斛的抗病能力，在一定程度上減少化學農藥的施用量，這也符合農業的可持續發展戰 略。因此，菌根菌劑相關研究已成為鐵皮石斛產業的一個重要方向。
【發明內容】
[0003] 本發明所要解決的技術問題是提供一種對鐵皮石斛抗病作用效果顯著地菌根真 菌-鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)JSNL002。
[0004] 本發明還要解決的技術問題是提供上述真菌在提高鐵皮石斛抗病能力中的應用。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：
[0006] -種尖孢鐮刀菌，其分類命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)，菌 株號為JSNL002,現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保 藏編號為CGMCC No. 9566,保藏日期為2014年8月15日。保藏地址為北京市朝陽區北辰西 路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0007] 上述菌株JSNL002是2010年10月在浙江省樂清市鐵皮石斛栽植區內生長狀況較 好的植株上分離獲得的，該菌株對鐵皮石斛促生作用不顯著。但能明顯改善鐵皮石斛的抗 病能力。
[0008] 矮小傘霉（Umbelopsis nana)JSNL002的菌落特征如下：
[0009] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002的菌落特征如下：
[0010] 形態學特征觀察表明：在PDA平叛上培養后，肉眼觀察菌落形態，發現其菌絲體呈 絨毛狀，并稍帶有紫色色素（圖1A)。大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，兩端細胞稍尖，多數 為3隔（圖1B)。小型分生孢子單胞，卵形，著生于單生瓶梗上，常在瓶梗頂端聚成團（圖 1C)。擴增ITS區全序列并進行測序，PCR擴增得到的16sRNA全序列如SEQ ID No :1所示。 toon] 上述尖孢鐮刀菌在鐵皮石斛抗葉斑病中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0012] 具體的應用方法是：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002制備成固體菌 齊U，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑 后，基質相對含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質內成活。
[0013] 其中，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以棉籽殼菌渣為培養基質、硝酸 銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體培養基，滅菌，接種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002,在28°C、12h光照+12h黑暗、pH6-8條件下培養25?35天，將培養好 的菌劑切割成lcm3大小的塊狀物，用于鐵皮石斛植株菌根菌劑的接種。
[0014] 有益效果：與現有技術相比，本發明的優點是：
[0015] (1)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002對鐵皮石斛抗病作用效果較為顯 著，對減少化學農藥的使用有一定作用，也是保證食用安全的重要手段。
[0016] (2)尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002培養條件簡單、容易保存，易于工 業化生產，具有良好的開發應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為圖1鐵皮石斛菌根真菌JSNL002的形態特征。
[0018] 圖2為JSNL002菌菌根化鐵皮石斛的抗葉斑病能力分析。
【具體實施方式】
[0019] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0020] 實施例1 :
[0021] 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002對鐵皮石斛的抗病能力作用效果分 析。
[0022] (1)以棉籽殼菌渣為培養基質、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體 培養基質裝入高壓滅菌袋內，于121°C和101. 3千帕的高壓條件下滅菌20分鐘。待培養基 質冷卻后在無菌條件下接種菌根真菌JSNL002,然后進行人工培養。具體培養條件為28°C、 12h光照+12h黑暗、pH6-8,培養25?35天。將培養好的菌劑加工成lcm 3大小的塊狀物， 置于鐵皮石斛幼苗栽培基質表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑接種量為5g，施用菌劑后， 基質相對含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質內成活。
[0023] (2)通過紫外光和黑暗處理培養在PDA培養基上的葉斑病病原菌，制得病菌孢子 懸浮液，將其稀釋到2 X 105個/mL備用。
[0024] (3)將供試鐵皮石斛植株在同等條件下進行管理，每株接種植株都選取上部第 五片葉，用針刺法人工制造傷口，表面噴灑病原菌孢子懸浮液2ml/每株，溫室內溫度為 30-35°C，濕度95%，每種處理均為100株，并設3組重復。
[0025] (4)接種后每天監控葉斑病的發病程度，統計發病率、發病指數。
[0026] 病株分級標準：病情分級主要根據接種葉片正反兩面出現病斑數量及直徑，初定 分級標準為：
[0027] 0 :正常；
[0028] I :正反兩面有少量病斑；
[0029] II :正反兩面有病斑，發病面積占葉片總面積1/4以下；
[0030] III :正反兩面有病斑，發病面積占葉片總面積的1/4-1/2 ;
[0031] IV :正反兩面有病斑，發病面積占葉片總面積1/2-3/4 ;
[0032] IV :正反兩面有病斑，發病面積占葉片總面積3/4以上。
[0033] 感病指數=Σ (各級病株數X該級代表數值）X10(V(總株數X最高一級代表 數值）；
[0034] 感病率=(感病株樹/接種株樹）X 100%。
[0035] 結果見圖2。
【權利要求】
1. 一種尖孢鐮刀菌，其分類命名為鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)，菌株 號為JSNL002,現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 9566,保藏日期為2014年8月15日。
2. 權利要求1所述的尖孢鐮刀菌在鐵皮石斛抗葉斑病中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002制備成固體菌劑，置于鐵皮石斛幼苗栽培基質表面，每叢鐵皮石斛幼苗的固體菌劑 接種量為5g，施用菌劑后，基質相對含水量維持在60%以上10天，以確保菌絲在基質內成 活。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述的固體菌劑按如下方法制備得到：以 棉籽殼菌渣為培養基質、硝酸銨為外源氮源、蔗糖為外源碳源，制備成固體培養基，滅菌，接 種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum) JSNL002,在 28°C、12h 光照 +12h 黑暗、pH6_8 條件下 培養25?35天，將培養好的菌劑切割成lcm3大小的塊狀物，用于鐵皮石斛植株菌根菌劑 的接種。
【文檔編號】C12R1/77GK104195055SQ201410457974
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月10日 優先權日:2014年9月10日
【發明者】徐超, 陳露, 楊鶴同, 趙桂華, 鄭凱, 席剛俊, 史俊, 張紅巖, 何任紅 申請人:江蘇農林職業技術學院