一種生長培養基及其用途和培養臍帶間充質干細胞的方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于培養干細胞的生長培養基，該生長培養基含有基礎培養基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。本發明還提供了所述的生長培養基在培養臍帶間充質干細胞中的用途。本發明還提供了一種培養臍帶間充質干細胞的方法，該方法包括：將臍帶間充質干細胞接種于如上所述的生長培養基中進行培養。通過上述技術方案，本發明能夠大幅度地提升臍帶間充質干細胞在體外的擴增能力。
【專利說明】一種生長培養基及其用途和培養胳帶間充質干細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞生物【技術領域】，具體地，涉及一種用于培養干細胞的生長培養基、 該生長培養基的用途和培養臍帶間充質干細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 干細胞是一類具有自我復制能力及多向分化潛能的未分化或低分化的細胞。在一 定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞的發育潛能分為三類：全能干細胞、多 能干細胞和單能干細胞。
[0003] 間充質干細胞以一種多能干細胞，是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的 中胚層和外胚層。間充質干細胞因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫 調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導 條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連 續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引 起的組織器官損傷修復。間充質干細胞由于其來源廣泛，易于分離培養，并且具有較強的分 化潛能和可自體移植等優點，具有較高的臨床應用價值。
[0004] 臍帶間充質干細胞是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多能干細胞。從人臍帶中 分離出的臍帶間充質干細胞，其細胞含量和增殖能力均優于骨髓間充質干細胞，并且免疫 原性比骨髓間充質干細胞低，此外還具有取材方便，無倫理學爭議等優點，因此在間充質干 細胞中具有更高的臨床應用價值。
[0005] 在實際臨床應用中，臍帶間充質干細胞的足夠數量是保證干細胞治療的必要因 素。在體外對臍帶間充質干細胞進行擴增是增加臍帶間充質干細胞的數量的必要途徑。但 是，目前臍帶間充質干細胞只能在體外傳代15-20代，并且傳代后3天以上才能達到80%以 上的融合度，此外在傳代15代以后還會出現丟失分化潛能的現象。因此，現有的培養臍帶 間充質干細胞的方法存在擴增能力差的缺陷。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是克服現有的培養臍帶間充質干細胞的方法存在擴增能力差的缺 陷，提供一種用于培養干細胞的生長培養基、該生長培養基的用途和培養臍帶間充質干細 胞的方法。
[0007] 本發明的發明人發現，通過在基礎培養基中添加特定的抗體和ATP，能夠大幅度地 提高臍帶間充質干細胞的擴增能力，由此得到了本發明。
[0008] -方面，本發明提供了一種用于培養干細胞的生長培養基，該生長培養基含有基 礎培養基和添加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子 受體1的抗體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
[0009] 另一方面，本發明還提供了一種培養臍帶間充質干細胞的方法，該方法包括：將臍 帶間充質干細胞接種于如上所述的生長培養基中進行培養。
[0010] 再一方面，本發明還提供了所述的生長培養基在培養臍帶間充質干細胞中的用 途。
[0011] 通過上述技術方案，本發明能夠大幅度地提升臍帶間充質干細胞在體外的擴增 能力。例如，本發明能夠將臍帶間充質干細胞的體外傳代數提高到25-40代，并且傳代后 40-60小時內能達到80%以上的融合度，此外在傳代20代以后也不會出現丟失分化潛能的 現象。
[0012] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0014] 圖1是測試實施例1中不同的生長培養基中生長的臍帶間充質干細胞的生長曲線 圖。圖1中，1和2表示制備實施例1和2, 3-6分別表示制備對比例1-4,橫坐標表示生長 時間，縱坐標表示550nm處測定各孔吸光光度值（D值）。
【具體實施方式】
[0015] 以下結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描 述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0016] 在本發明中，在未作相反說明的情況下，使用的液體的體積數值為20°C下的數值。
[0017] 本發明提供了一種用于培養干細胞的生長培養基，該培養基含有基礎培養基和添 加劑，所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子受體1的抗體、 抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
[0018] 其中，人血管內皮生長因子（human vascular endothelial growth factor， hVEGF)是指NCBI中基因登記號（NCBI Gene ID)為7422的基因的翻譯產物，其官方全稱 (Official Full Name)為血管內皮生長因子 A(vascular endothelial growth factor A， VEGFA)，其常見的別稱還包括VPF、VEGF或MVCD1。
[0019] 其中，人類表皮生長因子受體 1 (human epidermal growth factor receptor 1， HER1)是指NCBI中基因登記號（NCBI Gene ID)為1956的基因的翻譯產物，其官方全稱 (Official Full Name)為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR), 其常見的別稱還包括EGFR、ERBB、mENA、ERBB1或PIG61。
[0020] 其中，人類表皮生長因子受體 2 (human epidermal growth factor receptor2, HER2)是指NCBI中基因登記號（NCBI Gene ID)為2064的基因的翻譯產物，其官方全稱 (Official Full Name)為v-erb_b2鳥成紅細胞白血病病毒癌基因同源體2(v-erb_b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2)，其常見的別稱還包括 NEU、NGL、 TKR1、CD340、HER-2、MLN 19 或 HER-2/neu。
[0021] 其中，鳥苷-5_ 三憐酸三鈉鹽（guanosine-5 ' -triphosphate trisodium salt) 是指式（1)所示的化合物，其CAS號為36051-31-7。
[0022]
【權利要求】
1. 一種用于培養干細胞的生長培養基，該生長培養基含有基礎培養基和添加劑，其特 征在于：所述添加劑含有抗人血管內皮生長因子的抗體、抗人類表皮生長因子受體1的抗 體、抗人類表皮生長因子受體2的抗體和鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽。
2. 根據權利要求1所述的生長培養基，其特征在于：抗人血管內皮生長因子的抗體的 含量為0. 01-0. 2ng/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 01-0. Ing/mL，抗人 類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 05-0. 4ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0·2_4ng/mL〇
3. 根據權利要求2所述的生長培養基，其特征在于：抗人血管內皮生長因子的抗體的 含量為0. 05-0. Ing/mL，抗人類表皮生長因子受體1的抗體的含量為0. 03-0. 08ng/mL，抗 人類表皮生長因子受體2的抗體的含量為0. 1-0. 2ng/mL ;鳥苷-5-三磷酸三鈉鹽的含量為 0·5_2ng/mL〇
4. 根據權利要求1-3中任意一所述的生長培養基，其特征在于：所述抗人血管內皮生 長因子的抗體為貝伐單抗；所述抗人類表皮生長因子受體1的抗體為西妥昔單抗，所述抗 人類表皮生長因子受體2的抗體為曲妥珠單抗。
5. 據權利要求1所述的生長培養基，其特征在于：所述基礎培養基包括DMEM培養基、 MHM培養基、IMHM培養基和RPMI1640培養基中的至少一種。
6. 根據權利要求1所述的生長培養基，其特征在于：所述生長培養基還含有5-20體 積％的血清。
7. 權利要求1-6中任意一項所述的生長培養基在培養臍帶間充質干細胞中的用途。
8. -種培養臍帶間充質干細胞的方法，其特征在于：該方法包括：將臍帶間充質干細 胞接種于權利要求1-6中任意一項所述的生長培養基中進行培養。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于：培養的傳代周期為40-60小時。
10. 根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于：培養的傳代的代數為25-40代。
【文檔編號】C12N5/0775GK104232573SQ201410459791
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】安沂華, 董健伸 申請人:安沂華