一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，包括以下步驟：（1）以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調節至50-60℃，加入木瓜蛋白酶和Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液；（2）將酶解液過截留分子量為1-10kDa超濾膜，取濾過液；（3）將濾過液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值為7.0-7.5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4.0-4.5的純凈水進行洗脫，收集洗脫液；（4）將洗脫液經真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結合肽。該方法較為簡便，產品安全，可應用于實際生產。
【專利說明】一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于功能性肽【技術領域】，具體涉及一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備 方法。
【背景技術】
[0002] 功能性肽是指對生物機體的生命活動有益或具有特定生理作用的肽類化合物，其 對保健食品及生化藥物的開發具有極其重要的作用。其中，礦物元素結合肽即促礦物元素 吸收肽，是一種具有螯合礦物離子能力的功能性肽，其可在pH值呈中性至微堿性的動物小 腸下端，能與礦物離子，如鋅離子等結合，阻止礦物離子與磷酸根產生沉淀，使小腸內可溶 性的礦物離子濃度增加，并借助小肽的轉運吸收特點和機制以螯合物整體的形式通過小腸 被主動吸收，從而促進這些必需礦物離子的吸收和利用，可預防因礦物質缺乏而引起的各 種疾病。此外，由于礦物元素結合肽可與金屬離子螯合，能抑制以金屬離子為輔酶或輔基的 脂質過氧化反應，并減少由金屬離子產生的活性氧，因此其可能具有一定的抗氧化活性。
[0003] 近年來，以食源性蛋白為原料采用酶解法制備抗氧化肽已取得了很大的進展，獲 得了較多具有高抗氧化活性的肽段。但目前關于制備兼具抗氧化與促礦物元素吸收的雙效 功能性肽的方法尚未見報道。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，該制備方法 制備獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽具有促進鋅離子吸收的生物活性，是一種兼具抗氧 化與促鋅離子吸收的雙效功能性肽。
[0005] 本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：一種羅非魚抗氧化鋅元素結合 肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 控制酶解：以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調節至50_60°C，加入木瓜蛋白酶和 Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液； (2) 超濾分離：將酶解液采用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜過濾，取濾過液； (3) 固定化金屬離子親和層析：將濾過液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然 后用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進行洗 脫，收集洗脫液； (4) 真空濃縮、冷凍干燥：將洗脫液經真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結合肽。
[0006] 本發明的原理是：本發明先將羅非魚酶解再經超濾后得具有抗氧化活性的酶解產 物，然后采用IMAC分離柱從酶解產物中把具有鋅離子結合能力的組分分離出來，即為抗氧 化鋅元素結合肽。經過鑒定，羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的主成分結構為二肽結構，具體結 構為 Lys-Leu 或 Lys_IIe〇
[0007] 其中固定化金屬離子親和層析，即IMAC，是利用蛋白質、肽等表面暴露的一些氨基 酸殘基和載體之上的金屬離子的親和力的不同來進行分離純化的技術，具有配基簡單、吸 附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，適用于某些蛋白質、肽、氨基酸與酶的分離純化。
[0008] 在上述羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法中： 步驟（1)中水的用量為羅非魚原料總重量的2-3倍。
[0009] 步驟（1)中滅酶時的溫度為85-95°C，滅酶時間為10-20min。
[0010] 步驟（1)中離心時離心機轉速為4000-8000r/min，離心時間為15_30min。
[0011] 其中步驟（1)中水解度的測定方法：水解度（%) =酶解液中游離氨基態氮含量/原 料總氮含量X100,式中：酶解液中游離氨基態氮含量采用甲醛電位滴定法測定；原料總氮 含量采用半微量凱氏定氮法測定。
[0012] 步驟（2)中將酶解液先過截留分子量為3-10 kDa的超濾膜，再采用截留分子量為 lkDa的超濾膜過濾，取濾過液；或將酶解液直接采用截留分子量為lkDa的超濾膜過濾，除 去未酶解的蛋白，獲得所需的小分子肽類。
[0013] 步驟（3)中預先固載好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用 0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實現鋅離子在柱子上的固 載，再用純凈水沖洗5-10個柱體積，去除未結合的鋅離子，即制備獲得預先固載好鋅離子 的IMAC分離柱。
[0014] 本發明所述的層析柱優選為GE公司生產的HiPr印IMAC FF 16/10預裝柱。
[0015] 與現有技術相比，本發明具有以下優點： (1) 本發明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽具有與天然抗氧化劑谷胱甘肽相似 的抗氧化性，安全無毒，在抗氧化保健方面具有優越性； (2) 本發明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽具有促進鋅離子吸收的生物活性， 是一種兼具抗氧化與促鋅離子吸收的新型雙效功能性肽； (3) 本發明方法制備的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備工藝較為簡便，產品安全，可 應用于實際生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1為實施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的IMAC分離純化圖； 圖2為實施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的總離子流圖； 圖3實施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的一級質譜圖； 圖4實施例1-4中獲得的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的二級質譜圖； 圖5為實施例1中羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的DPPH自由基清除率； 圖6為實施例1中羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的0H自由基清除率。
【具體實施方式】
[0017] 以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
[0018] 第一部分羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法 實施例1 本實施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，包括以下步驟： (1)以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1: 2的料水重量比加水，水溫調節至50°C，加入木 瓜蛋白酶，酶解至水解度為15%，85°C滅酶20min，再以轉速為4000r/min離心30min，取上清 液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為1 kDa的超濾膜，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調節為7. 2的純 凈水沖洗2個柱體積，再用pH值調節為4. 0的純凈水進行洗脫，收集洗脫液，其中預先固載 好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或 ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實現鋅離子在柱子上的固載，再用純凈水沖洗5-10個柱 體積，去除未結合的鋅離子，即制備獲得預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，采用的層析柱 為GE公司生產的HiPr印IMAC FF 16/10預裝柱； (4) 真空濃縮經IMAC分離后的洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結合肽，獲得的羅非 魚抗氧化鋅元素結合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示，從圖1中可以看出，圖中第1個 高峰是用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積后出現的峰，這個峰代表的組分是不 能與鋅離子結合的肽，因此被洗脫下來，這部分是不要的，能結合鋅離子的肽此時被吸附在 柱子上，其在酸性條件下可以被洗脫下來，因此用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進行洗脫，收集 到的洗脫液則為鋅元素結合肽，為圖中第2峰。
[0019] 羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的肽序結構測定采用電噴霧電離串聯質譜分析 (ESI-MS/MS, Bruker Daltonics Inc.，Billerica, MA)。樣品以流動注射方式注入電噴 霧（ESI)質譜，采用正離子掃描模式，霧化氣和干燥氣為高純氮氣，氣體流速為6L/min，氣 體壓力為1. 5Bar，掃描范圍為質/核比50-1000 (m/z)，噴霧電壓3. 5kV。MS/MS肽序列分 析借助 BioTools (Version3. 0，Bruker Daltonics Data Analysis 3. 3)軟件并結合手動 計算。具體結果如圖2-4中所示。經過鑒定，羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的主成分結構為 二肽結構，具體結構為Lys-Leu或Lys-IIe。
[0020] 實施例2 本實施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:3的料水重量比加水，水溫調節至55°C，加入 Alcalase，酶解至水解度為17%，90°C滅酶15min，再以轉速為6000r/min離心25min，取上清 液，得酶解液； (2) 將酶解液先過截留分子量為5 kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子 量為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調節為7. 3的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調節為4. 2的純凈水進行洗脫，收集洗脫液，預先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實施例1 ; (4) 真空濃縮經IMAC分離后的洗脫液吧，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結合肽，該抗氧化 鋅元素結合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的肽序結構 同實施例1。
[0021] 實施例3 本實施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，包括以下步驟： (1)以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:2的料水重量比加水，水溫調節至52°C，加入木 瓜蛋白酶與Alcalase( 1:1，w/w)，酶解至水解度為18%，95°C滅酶10min，再以轉速為7000r/ min離心20min，取上清液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為3 kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子量 為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調節為7. 5的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調節為4. 0的純凈水進行洗脫，收集洗脫液，預先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實施例1 ; (4) 真空濃縮經IMAC分離后的洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結合肽，該抗氧化鋅 元素結合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的肽序結構同 實施例1。
[0022] 實施例4 本實施例提供的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，包括以下步驟： (1) 以羅非魚為原料，取肉絞碎，按照1:3的料水重量比加水，水溫調節至53°C，加入木 瓜蛋白酶與Alcalase( 1:2, w/w)，酶解至水解度為20%，90°C滅酶15min，再以轉速為8000r/ min離心15min，取上清液，得酶解液； (2) 將酶解液過截留分子量為10kDa的超濾膜，以除去未酶解的蛋白，再過截留分子量 為lkDa的超濾膜，獲得小分子肽，取濾過液； (3) 將超濾液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然后用pH值調節為7. 4的純凈 水沖洗2個柱體積，再用pH值調節為4. 1的純凈水進行洗脫，收集洗脫液，預先固載好鋅離 子的IMAC分離柱的制備過程等同實施例1 ; (4) 真空濃縮經IMAC分離后的超濾液洗脫液，冷凍干燥得抗氧化鋅元素結合肽，該抗 氧化鋅元素結合肽的IMAC分離純化圖如圖1中所示。羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的肽序 結構同實施例1。
[0023] 第二部分羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的抗氧化性測試 抗氧化性的測定方法： 2. 1 DPPH自由基清除率的測定方法：取2mL樣液(實施例1中獲得的抗氧化鋅元素結 合肽，樣品用純凈水溶解，下同）加入〇. 15mM DPPH (95%乙醇溶解），混勻后于室溫下避光 反應30 min，在517 nm處測得其吸光值Ai，空白為2 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，力口 入2 mL樣液混勻，在517nm處測得其吸光值Aj，對照組為2 mL DPPH溶液加入2 mL 95%乙 醇，在517 nm處測得其吸光值A0。對樣品溶液做梯度稀釋，測定不同濃度下的自由基清除 率，經線性回歸后計算出自由基清除率為50%時的濃度，即IC 5(I值。清除率按以下公式進行 計算：清除率（％) = [1-%4) / AJ X 100%，式中人為對照組吸光值夂為樣品組吸光值； Aj-為空白組吸光值，羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的DPPH自由基清除率結果見圖5,用公認 的抗氧化劑谷胱甘肽做對照，DPPH自由基半清除率IC 5(I值越低表明其抗氧化性越好，從圖5 中可以看出，本發明中的抗氧化鋅元素結合肽的抗氧化性與抗氧化劑谷胱甘肽的抗氧化性 兩者沒有顯著性差異，具有相似的活性。
[0024] 2. 2 0H自由基清除率的測定方法：取0. 6 mL 5mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液， 先加入 0· 4mL 0· 15 mol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH 7. 40)和 0· 6mL 0· 75 mmol/L 的 FeS04,再 加入2mL樣品液混勻后，最后加入0. 4mL 0. 1% (V/V)的H202搖勻，37°C下水浴60 min后 在536 nm處測定得吸光值為A樣品；以去離子水代替樣品和H202溶液重復上述操作，在536 nm處測得其吸光值為A未損傷；以去離子水代替樣品液來重復以上操作，在536 nm處測得 吸光度A損傷。對樣品溶液做梯度稀釋，測定不同濃度下的自由基清除率，經線性回歸后計 算出自由基清除率為50%時的蛋白濃度，即IC5Q值。清除率按如下公式進行計算：清除率 (%)= (A樣品-A損傷V( A未損傷-A損傷）X100%，式中：A樣品為樣品組的吸光值；A損傷為損傷管 的吸光值;A#i^為未損傷管的吸光值。羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的OH自由基清除率結 果見圖6,用公認的抗氧化劑谷胱甘肽做對照，OH自由基半清除率IC 5(I值越低表明其抗氧化 性越好，從圖6中可以看出，本發明中的抗氧化鋅元素結合肽的抗氧化性與抗氧化劑谷胱 甘肽的抗氧化性兩者沒有顯著性差異，具有相似的活性。
[0025] 本發明的實施方式不限于此，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知 識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修 改、替換或變更，均落在本發明權利保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 控制酶解：以羅非魚為原料，粉碎，加水，水溫調節至50-60°C，加入木瓜蛋白酶和 Alcalase中的一種或兩種，酶解至水解度為15-22%，滅酶，離心后，取上清液，得酶解液； (2) 超濾分離：將酶解液采用截留分子量為1-10 kDa的超濾膜過濾，取濾過液； (3) 固定化金屬離子親和層析：將濾過液通過已預先固載好鋅離子的IMAC分離柱，然 后用pH值為7. 0-7. 5的純凈水沖洗2-3個柱體積，再用pH值為4. 0-4. 5的純凈水進行洗 脫，收集洗脫液； (4) 真空濃縮、冷凍干燥：將洗脫液經真空干燥和冷凍濃縮，得抗氧化鋅元素結合肽。
2. 根據權利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1)中水的用量為羅非魚原料總重量的2-3倍。
3. 根據權利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1)中滅酶時的溫度為85-95°C，滅酶時間為10_20min。
4. 根據權利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (1) 中離心時離心機轉速為4000-8000r/min，離心時間為15_30min。
5. 根據權利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于：步驟 (2) 中將酶解液先過截留分子量為3-10 kDa的超濾膜，再采用截留分子量為lkDa的超濾膜 過濾，取濾過液；或將酶解液直接采用截留分子量為lkDa的超濾膜過濾。
6. 根據權利要求1所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在 于：步驟（3)中預先固載好鋅離子的IMAC分離柱的制備過程如下：選取層析柱，先用 0. 05-0. 2mol · Γ1的ZnCl2或ZnS04溶液沖洗0. 5-2個柱體積，以實現鋅離子在柱子上的固 載，再用純凈水沖洗5-10個柱體積，去除未結合的鋅離子，即制備獲得預先固載好鋅離子 的IMAC分離柱。
7. 根據權利要求6所述的羅非魚抗氧化鋅元素結合肽的制備方法，其特征在于：所述 的層析柱為GE公司生產的HiPr印IMAC FF 16/10預裝柱。
【文檔編號】C12P21/06GK104195207SQ201410476725
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】胡曉, 李來好, 楊賢慶, 陳勝軍, 吳燕燕, 郝淑賢, 林婉玲, 馬海霞 申請人:中國水產科學研究院南海水產研究所