一種腫瘤細胞廣譜高活性啟動子及其用途
【專利摘要】本發明屬于分子生物學領域，涉及一種腫瘤細胞廣譜高活性啟動子及其用途。所述啟動子能在腫瘤細胞內廣譜高效表達外源基因，其在一系列腫瘤細胞中的表達活性高于現有的CAG啟動子，且序列穩定（不會在原核細胞及真核細胞轉移過程中發生序列丟失）。該啟動子可適用于在腫瘤基因治療過程中，驅動外源基因在腫瘤細胞內的高效表達。
【專利說明】一種腫瘤細胞廣譜高活性啟動子及其用途
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及一種腫瘤細胞廣譜高活性啟動子及其用途。所 述啟動子為人工合成的嵌合啟動子，該啟動子在腫瘤細胞中具有廣譜的高活性。本發明還 涉及含有該啟動子的重組載體、重組病毒、以及所述啟動子控制治療基因用于基因治療的 用途。
【背景技術】
[0002] 啟動子是基因的一個組成部分，通常位于結構基因5'端上游，是RNA聚合酶識別、 結合和開始轉錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶（holoenzyme)同模板正確結合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉錄，從而控制基因表達（轉錄）的起始時間和表達的程度。啟動 子是影響轉基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效率表達外源基因的 關鍵。
[0003] 根據啟動子的轉錄模式可將其分為3類：組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調控下，不同組織器官和發育 階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。
[0004] 哺乳動物中常用的組成型啟動子包括病毒來源：鼠或人巨細胞病毒（CMV)啟動子 (分別簡稱mCMV與hCMV)、猴空泡病毒SV40啟動子；人基因組天然來源：EFla啟動子、泛素 啟動子（Ubiquitin，簡稱Ubi)、β -actin啟動子、PGK-I啟動子、Rosa26啟動子、HSP70啟動 子、GAPDH啟動子、eIF4Al啟動子、Egrl啟動子、FerH啟動子、SM22 α啟動子、Endothelin-I 啟動子等。
[0005] 哺乳動物常用組織特異性啟動子有：Β29啟動子（Β細胞特異性）、CD14啟動子（單 個核細胞特異性）、CD43啟動子（淋巴細胞及血小板特異性）、CD45及INF- β啟動子（造 血細胞特異性）、⑶68啟動子（巨噬細胞特異性）、Desmin及Myoglobin啟動子（肌肉細 胞特異性）、CD105及CD102啟動子（內皮細胞特異性）、GFAP啟動子（星形膠質細胞特異 性）、GPIIb啟動子（巨核細胞特異性）、Surfactant Protein B啟動子（肺特異性）、NSE 啟動子（成熟神經元細胞特異性）、Alb啟動子（肝特異性）等。
[0006] 常用腫瘤特異性啟動子有：AFP啟動子（肝癌特異性）、CCKAR啟動子（胰腺癌特異 性）、PSA啟動子（前列腺癌特異性）、Tyr啟動子（黑色素瘤特異性）、hTERT啟動子/CEA 啟動子 /Survivin 啟動子 /CXCR4 啟動子 /COX-2/L-plastin 啟動子 /epididymis protein 4啟動子/E2F1啟動子（腫瘤廣譜特異性）等。
[0007] 常用誘導型啟動子有：基于四環素（Tet)系統的誘導型啟動子（包括Tet-On或 Tet-off)、脫皮激素類誘導系統的誘導型啟動子、FK506調控系統的誘導型啟動子、納巴霉 素誘導系統的誘導型啟動子、RU486誘導系統的誘導型啟動子等。
[0008] 在腫瘤基因治療中，維持外源基因的高效穩定表達非常重要。然而，一些病毒來源 的組成型啟動子盡管瞬時表達活性較高（如CMV啟動子），但容易因表觀遺傳修飾而被關 閉表達；而一些人源天然組成型啟動子或腫瘤特異性啟動子雖然表達穩定，但表達活性相 對較弱，難以滿足基因治療需求。因而，研究人員又設計構建了一系列人工嵌合啟動子，它 們包含了一些順式調控元件，主要包括能發揮穩定表達作用的啟動子核心序列，以及能增 強表達效率的上游增強子或下游內含子，代表者是嵌合啟動子CAG (包含人CMV增強子-雞 β -actin啟動子-兔β -globin內含子），廣泛應用于外源基因的表達。
[0009] 尚需要開發適合在腫瘤細胞內廣譜高效表達外源基因的啟動子，其在一系列腫瘤 細胞中的表達活性高于CAG啟動子，且序列穩定（不會在原核細胞及真核細胞轉移過程中 發生序列丟失），并能夠適用于驅動外源基因在腫瘤細胞內的高效表達。
【發明內容】
[0010] 本發明人經過大量的試驗和創造性的勞動，設計構建了一系列新型嵌合啟動子， 并從中篩選獲得一個能在腫瘤細胞內廣譜高效表達外源基因的啟動子。本發明人驚奇地發 現，該啟動子序列穩定，不會隨著其在原核細胞或真核細胞內的轉移而發生序列丟失現象， 并且能夠穩定地表達驅動外源基因的表達。由此提供了下述發明：
[0011] 本發明的一個方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含如下元件：
[0012] hCMV增強子、β -Actin啟動子和mCMV增強子；
[0013] 具體地，其還包含Ubi增強子；更具體地，Ubi增強子位于上述3種元件的下游；
[0014] 具體地，上述4種元件各自獨立地為1個、2個、3個或3個以上；
[0015] 具體地，所述多核苷酸具有啟動子功能。
[0016] 根據本發明任一項所述的多核苷酸，其依次包含：
[0017] hCMV增強子+ β -Actin啟動子+mCMV增強子，或者
[0018] mCMV增強子+hCMV增強子+ β -Actin啟動子；
[0019] 優選地，其依次包含：
[0020] hCMV增強子+ β -Actin啟動子+mCMV增強子+Ubi增強子，或者
[0021] mCMV增強子+hCMV增強子+ β -Actin啟動子+Ubi增強子。
[0022] 根據本發明任一項所述的多核苷酸，其中：
[0023] hCMV增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 17所示；
[0024] β -Actin啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO :18所示；
[0025] mCMV增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 19或SEQ ID NO :20所示；優選為SEQ ID NO ：20 ；
[0026] Ubi增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO :21所示。
[0027] 根據本發明任一項任一項所述的多核苷酸，其各個元件之間有或沒有連接序列或 者剪接位點；具體地，在mCMV增強子和/或hCMV增強子和/或Ubi增強子的上游和下游分 別有剪接供體和剪接受體；更具體地，所述剪接供體的核苷酸序列如SEQ ID NO :22所示； 所述剪接受體的核苷酸序列如SEQ ID NO :23所示。
[0028] 剪接供體（splice donor，SD) :AAAACAGGTAAGTCC(SEQ ID NO :22)
[0029] 剪接受體（splice acc印tor，SA) :GCCTCTACTAACCATGTTCATGTTTTCTTTTTTTTTCTAC AGGTCCTGGGTGACGAACAG(SEQ ID NO ：23)
[0030] 在本發明的一個實施方案中，不拘于理論的限制，啟動子后面的增強子序列兩端 含有剪切位點，保證在轉錄后，位于啟動子下游的增強子序列能被準確剪切掉，不影響目的 蛋白的翻譯；其余元件直接連接。
[0031] 本發明的另一方面涉及一種分離的多核苷酸，其包含或者為選自如下的a - e中 任意一組的多核苷酸：
[0032] a. SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列所示的多核苷酸；
[0033] b.與SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列互補的多核苷酸；
[0034] c.在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的多核苷酸雜交并具有啟動子功能的多核 苷酸；
[0035] d.對上述a或b所示多核苷酸進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾并具有 啟動子功能的多核苷酸；和
[0036] e.與上述a或b所示多核苷酸具有至少90%同一性并具有啟動子功能的多核苷 酸；
[0037] 具體地，a或b中的多核苷酸具有啟動子功能。
[0038] 本發明的上述多核苷酸為啟動子；具體地，是嵌合啟動子。
[0039] SEQ ID NO : I-SEQ ID NO :4 的具體序列如下：
[0040] CAC啟動子（含hCMV增強子+ β -Actin啟動子+mCMV增強子）：
【權利要求】
1. 一種分離的多核苷酸，其包含如下元件： hCMV增強子、β -Actin啟動子和mCMV增強子； 具體地，其還包含Ubi增強子；更具體地，Ubi增強子位于上述3種元件的下游； 具體地，上述4種元件各自獨立地為1個、2個、3個或3個以上； 具體地，所述多核苷酸具有啟動子功能。
2. 根據權利要求1所述的多核苷酸,其依次包含： hCMV增強子+ β -Actin啟動子+mCMV增強子，或者 mCMV增強子+hCMV增強子+ β -Actin啟動子； 優選地，其依次包含： hCMV增強子+ β -Actin啟動子+mCMV增強子+Ubi增強子，或者 mCMV增強子+hCMV增強子+ β -Actin啟動子+Ubi增強子。
3. 根據權利要求1所述的多核苷酸,其中： hCMV增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 17所示； β -Actin啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 18所示； mCMV增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO :19或SEQ ID NO :20所示；優選為SEQ ID NO: 20 ； Ubi增強子的核苷酸序列如SEQ ID NO :21所示。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的多核苷酸，其各個元件之間有或沒有連接序列 或者剪接位點；具體地，在mCMV增強子和/或hCMV增強子和/或Ubi增強子的上游和下 游分別有剪接供體和剪接受體；更具體地，所述剪接供體的核苷酸序列如SEQ ID NO :22所 示；所述剪接受體的核苷酸序列如SEQ ID NO :23所示。
5. -種分離的多核苷酸，其包含或者為選自如下的a - e中任意一組的多核苷酸： a. SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列所示的多核苷酸； b. 與SEQ ID NO :1 - SEQ ID NO :4中任一序列互補的多核苷酸； c. 在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的多核苷酸雜交并具有啟動子功能的多核苷 酸； d. 對上述a或b所示多核苷酸進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾并具有啟動 子功能的多核苷酸；和 e. 與上述a或b所示多核苷酸具有至少90%同一性并具有啟動子功能的多核苷酸； 具體地，a或b中的多核苷酸具有啟動子功能。
6. -種核酸構建體，包含權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸，以及可操作地連接 的外源基因；具體地，所述外源基因選自p53、GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-24、Trail、pl6、TK、 IFN γ、TNFa、Rb、Sirpa等中的任意一種或多種；具體地，所述外源基因為SEQ ID NO :12 所示 p53 和 / 或 SEQ ID NO :4 所示 GM-CSF。
7. -種重組載體，其含有權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸或者權利要求6所 述的核酸構建體；具體地，所述重組載體為重組病毒載體；具體地，所述重組載體為權利要 求1至5中任一項所述的多核苷酸或者權利要求6所述的核酸構建體與pDC315質粒或 SG655經重組得到的重組載體。
8. -種藥用組合物，其包含權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸或者權利要求6 所述的核酸構建體或者權利要求7所述的重組載體，以及可選的藥學上可接受的輔料。
9. 選自如下的⑴或⑵的用途： (1) 權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸或者權利要求6所述的核酸構建體或者 權利要求7所述的重組載體在制備治療和/或預防和/或輔助治療癌癥或者抗腫瘤的藥物 中的用途；具體地，所述癌癥或者腫瘤為肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、 卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列 腺癌； (2) 權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸或者權利要求6所述的核酸構建體或者 權利要求7所述的重組載體在制備抑制腫瘤細胞的藥物或者試劑中的用途；具體地，所述 腫瘤細胞為如下腫瘤的細胞：肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳腺癌、卵巢癌、宮 頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺癌；在具 體的實施方案中，所述腫瘤細胞為選自H印3B、Huh7、H印G2、PLC/PRF/5、BEL-7404、H460和 H1299細胞中的任意一種。
10. -種在體內或體外抑制腫瘤細胞的方法，包括使用有效量的權利要求1至5中任一 項所述的多核苷酸或者權利要求6所述的核酸構建體或者權利要求7所述的重組載體的步 驟；具體地，所述腫瘤細胞為如下腫瘤的細胞：肺癌、肝細胞癌、淋巴瘤、結腸癌、大腸癌、乳 腺癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌、膽管癌、膽囊癌、食管癌、腎癌、神經膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌 或前列腺癌；在具體的實施方案中，所述腫瘤細胞為選自H印3B、Huh7、H印G2、PLC/PRF/5、 BEL-7404、H460和H1299細胞中的任意一種。
11. 權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸在作為啟動子中的用途。
12. -種分離的多核苷酸，其包含或者為SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列或其互補序 列。
13. 權利要求12所述的多核苷酸在制備啟動子中的用途；具體地，所述啟動子為具有 啟動子功能的權利要求1至5中任一項所述的多核苷酸。
【文檔編號】C12N15/113GK104212802SQ201410495099
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】錢其軍, 金華君, 李振海, 呂賽群, 吳紅平, 丁娜, 李林芳, 俞德超, 吳孟超 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學東方肝膽外科醫院, 上海白澤生物科技有限公司