專利名稱：一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法
技術領域：
本發明涉及一種洋蔥表皮細胞遺傳轉化的方法，特別涉及一種利用農
桿菌"gra^cfeWwm mme/ac/ms)介導的簡便、高效地4每外源基因轉化進 入洋蔥鱗莖葉內表皮細胞內的轉化方法。
背景技術：
洋蔥鱗莖葉內表皮因具有取材方便，細胞結構明顯，透明，無葉綠體 干擾，便于觀察，可進行活體檢測等優點，被作為植物遺傳轉化受體，廣 泛應用于蛋白的亞細胞定位，啟動子活性檢測，以及細胞動態生理活動等 方面的研究，近年來，隨著細胞生物學和分子生物學的迅猛發展，通過洋 蔥表皮細胞作為受體來研究基因、蛋白質、啟動子等的功能和特性逐漸成 為分子生物學研究的一個熱點。
目前，對洋蔥表皮細胞的遺傳轉化均采用的是粒子轟擊轉化法。但粒 子轟擊轉化法需要貴重的基因槍設備，需要昂貴的金粉作為載體材料，而 且，該轉化方法受多種理化和生理因素影響，轉化效率低，轉基因植物常 出現非正常整合的嵌合體。另外，操作者所使用的組織材料和轉化系統不 完全相同也增加了實驗的不確定因素，難度以及成本。這些因素極大地限 制了洋蔥表皮細胞在細胞生物學和分子生物學研究中的實際運用。
發明內容
為了克服現有的粒子轟擊法轉化洋蔥表皮細胞的難度大、成本高、儀 器設備要求高等問題，本發明的目的在于提供一種農桿菌介導的洋蔥表皮 細胞轉化方法。該方法只需常規的菌株和培養基，無須昂貴的實驗設備和 金粉等載體材料，而且操作簡便易行，實驗成本低，轉化頻率高，拷貝數 少，遺傳表達穩定性較好，實驗周期短。
本發明的目的通過下述技術方案來實現 一種農桿菌介導的洋蔥表皮 細胞轉化方法，包括如下步驟
(1) 在無菌環境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將洋蔥鱗 莖消毒后用無菌水洗滌干凈，切開洋蔥鱗莖，取中層靠近鱗莖內部的鱗莖 葉，撕下洋蔥單層內表皮塊。
(2) 含有農桿菌的滲透培養基的配制將含待轉化質粒的農桿菌菌株
接種至YEB液體培養液中，28'C振蕩培養過夜；將培養物離心收集農桿菌 菌體，并重懸于預冷至4'C的滲透培養基中，使該含有農桿菌的滲透培養基 濃度在OD600=0.2 1.5左右；所述滲透培養基為MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸。
(3) 轉化將洋蔥單層內表皮塊浸浮在上述含有農桿菌的滲透培養基 中，使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊充分接觸5 30分鐘進行轉化后，夾起 洋蔥單層內表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養基，于25t:, 16小時 光照/8小時黑暗的培養條件中，共培養16 24小時。
為了更好地實現本發明，所述洋蔥鱗莖消毒是采用75%乙醇消毒。而 且，在常規的滲透培養基成分(MS培養基+100mMol/L乙酰丁香酮)的基 礎上添加了 10mM MgCl2和2-N嗎啡啉乙磺酸進行優化，能進一步保存從 鱗莖剝離下來的鱗莖葉表皮細胞的生理活力，提高其轉化效率。
所述農桿菌菌株為LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株，通過 上述這些農桿菌作為攜帶載體，在農桿菌感染帶有傷口的洋蔥單層內表皮 塊時，將與GFP、 YFP或GUS等報告基因融合的外源基因或啟動子序列導入 洋蔥表皮細胞。
為了使洋蔥表皮細胞的轉化效果最為穩定和高效，特別優選步驟(2) 使該含有農桿菌的滲透培養基濃度為OD幼()-l.O，優選步驟(3)使農桿菌 與洋蔥單層內表皮塊充分接觸20分鐘進行轉化。
所述YEB液體培養液包括YEB+125ug/ ml鏈霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平 霉素+100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml慶大霉素+50 ug/ml卡 那霉素+100mMol/L乙酰丁香酮。
本發明原理是農桿菌是普通存在于土壤中的一種革蘭式陰性菌，在 自然條件下可以感染植物的受傷部位，產生冠癭瘤或發狀根，這是一種天 然的植物遺傳轉化體系。農桿菌有兩種含有Ti質粒的根癌農桿菌與含有 Ri質粒的發根農桿菌。Ti質粒是存在于根癌農桿菌細胞核處的一種雙鏈環
狀DNA分子，在低于3(TC情況下，可穩定地存在于根癌農桿菌中。農桿 菌Ti質粒是一個常用的工程質粒載體，介導轉化率很高。改造后的無害Ti 質粒，可以攜帶任何DNA序列進入被根癌農桿菌感染的植株，不會形成腫 瘤。T-DNA區和致瘤區是Ti質粒最重要的兩個區域，T-DNA是Ti質粒中 唯一能與植物染色體整合的序列，而致瘤區中的一系列基因則起輔助整合 的作用。Ti質粒自身帶有合成冠癭堿的相關基因，能合成正常植物內沒有 的冠癭堿。根癌農桿菌轉入植物細胞的一部分Ti質粒與植物基因組整合， 致使植物形式腫瘤。農桿菌轉入植物的DNA片段稱為轉移DNA。只需將 目的基因插入改造的轉移DNA區，通過農桿菌感染，即可以實現外源基因 向植物細胞的轉移與整合，經過細胞的組織培養，即可觀測到外源基因在 受體植物細胞中的表達。農桿菌介導才先在雙子葉植物中應用，在單子葉 植物中運用較晚。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果
本發明所提供的方法不依賴于基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴 的實驗載體材料，僅需一個超淨工作臺以及相關農桿菌菌株就能在最簡單 地實驗環境下實現洋蔥表皮細胞的高效轉化，全過程4天，{氐成本，洋蔥表 皮細胞的轉化效率達80%。
圖1為本發明的農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法用于檢測pasr啟 動子活性圖。
圖2為本發明的農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法用于檢測 MpASR-GFP蛋白的亞細胞定位圖。
圖3為農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化與GUS報告基因聯合使用研究 啟動子活性。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式 不限于此。
實施例一農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法用于啟動子活性鑒定 (1)選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨工作臺的無菌環
境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗漆3次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層 靠近鱗莖內部的鱗莖葉，在內表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內表皮塊撕下。
(2) 以啟動子pasr為研究對象，檢測啟動子序列的啟動子活性。將啟 動子序列和GFP報告基因的ORF序列連入pCAMBIA1391Z載體，構建包 含啟動子序列和GFP報告基因的啟動子植物表達載體 pCAMBIA1391Z-pasr-g^。將該載體導入農桿菌GV3101菌株，將經鑒定為 陽性的克隆按照1 : 100的體積比接種至200ml YEB液體培養液中(含有 50ug/ml慶大霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振蕩培養過夜。將培養物于2800轉/分鐘，離心10分鐘收集菌體，分成三 分重懸于4。C預冷的滲透培養基中(含MS， 10mM MgCl2， 100mMol/L乙 酰丁香酮，0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)，使OD柳值分別為0.2、 1.0、 1.5。
(3) 將撕下的洋蔥單層內表皮塊分別浸浮在OD6。o二0.2、 1.0、 1.5的 上述滲透培養基重懸的菌液(含MS， 10mMMgCl2， 100mMol/L乙酰丁香 酮，0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)中，使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊 充分接觸進行轉化后，間或輕輕搖動，接觸(轉化)時間^^別對應為30分 鐘、20分鐘和5分鐘，然后用鑷子輕輕夾起洋蔥內表皮塊一角，稍濾干菌 液，以貼近鱗片葉肉的一面朝下，平鋪于MS固體培養基，將轉化后并平 鋪于MS固體培養基的洋蔥單層內表皮塊于25°C， 16小時光照/8小時黑暗 的培養條件中進行共培養。
(4) 共培養20小時后用鑷子輕輕取出洋蔥單層內表皮塊，用無菌液 體MS培養基洗滌以去除可能附著的培養基碎塊及菌液，壓片法制片，采 用共聚焦熒光顯微鏡，在激發波長為488 nm左右，發射波長為500 570 nm 左右觀察洋蔥表皮細胞中GFP的表達水平，以檢測啟動子pasr的活性，結 果顯示，啟動子pasr具有啟動子活性，能驅動報告基因GFP在洋蔥表皮細 胞中表達，且轉化效率在80%以上。檢測結果如圖l所示。其中，A,、 A2、 A3分別為OD6()()=0.2轉化時間為30分鐘；OD6(K)=1.0轉化時間為20分鐘； OD6Q。=1.5轉化時間為5分鐘條件下的轉化結果。
實施例二農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法用于石開究蛋白質的亞 細胞定位
(1) 選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨工作臺的無菌環
境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗滌3次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層 靠近鱗莖內部的鱗莖葉，在內表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內表皮塊撕下。
(2) 將經鑒定為陽性攜帶pCAMBIA1301-MpASR-GFP質粒的農桿菌 LBA4404按照1 : 100的體積比接種至50ml液體YEB液體培養液中(含 125ug/ml鏈霉素，50ug/ml卡那霉素，100mMol/L乙酰丁香酮)中，28°C 振蕩培養過夜。將培養物于2800轉/分鐘，離心10分鐘收集菌體，并重懸 于滲透培養基(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)中，使OD60(p1,0。
(3 )將撕下的洋蔥單層內表皮塊浸浮在上述含有菌體的滲透培養基的 菌液(MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01% (W/V) 2-N嗎啡 啉乙磺酸)中，間或輕輕搖動。使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊充分接觸20 分鐘進行轉化后，用鑷子輕輕夾起洋蔥單層內表皮塊一角，稍濾干菌液， 以貼近鱗片葉肉的一面朝下，平鋪于MS固體培養基并于25"C， 16小時光 照/8小時黑暗的培養條件中進行共培養。
(4)共培養16小時后用鑷子輕輕取出洋蔥單層內表皮塊，用無菌液 體MS培養基洗滌以去除可能附著的培養基碎塊及菌液，壓片法制片，采 用共聚焦熒光顯微鏡，在激發波長為488 nm左右，發射波長為500 570 nm 左右進行觀察，發現MpASR-GFP定位于細胞核內且轉化效率達80%以上， 檢測結果如圖2所示。其中，Bl、 B2、 B3分別為用于檢測MpASR-GFP蛋 白的亞細胞定位的熒光、白光下電鏡圖及其疊加圖。
實施例三農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化與GUS報告基因的聯合使
用
(1)選取新鮮而且生長狀況良好的洋蔥鱗莖，在超淨工作臺的無菌環 境中，除去洋蔥鱗莖外層的3 5層鱗片葉，將鱗莖于75%乙醇中浸泡處理 IO分鐘，用無菌水洗滌2次。用無菌解剖刀十字形切開洋蔥鱗莖，取中層
靠近鱗莖內部的鱗莖葉，在內表皮(凹面)用刀片輕輕劃出面積約為lcm2的 小方塊，然后用鑷子輕輕將洋蔥單層內表皮塊撕下。
(2) 將gw報告基因與啟動子pfl^相連接構建植物表達載體 pCAMBIA1391Z-pasr-gus,并轉入農桿菌EHA105菌株。在YEB液體培養 基(含有50mg/L卡那霉素，125mg/L鏈霉素和100mMol/L乙酰丁香酮) 中，28i:振蕩培養過夜。將培養物于2800轉/分鐘，離心IO分鐘收集菌體， 并重懸于滲透培養基中(MS+10mMMgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01%
(W/V) 2-N嗎啡啉乙磺酸)，使00600=1.0。
(3) 將撕下的洋蔥單層內表皮塊浸浮在上述含有菌體的滲透培養基的 菌液中，使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊充分接觸20分鐘進行轉化后，用鑷 子輕輕夾起洋蔥單層內表皮塊一角，稍濾干菌液，平鋪于MS固體培養基， 25°C， 16小時光照/8小時黑暗的培養條件中進行共培養，共培養24小時后， 采用熒光顯微鏡進行觀察，轉化效率達80%以上，檢測結果如圖3所示。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上 述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改 變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明 的保護范圍之內。
權利要求
1、一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特征在于包括如下步驟(1)在無菌環境中，除去洋蔥鱗莖外層的3～5層鱗片葉，將洋蔥鱗莖消毒后用無菌水洗滌干凈，切開洋蔥鱗莖，取中層靠近鱗莖內部的鱗莖葉，撕下洋蔥單層內表皮塊；(2)含有農桿菌的滲透培養基的配制將含待轉化質粒的農桿菌菌株接種至YEB液體培養液中，28℃振蕩培養過夜；將培養物離心收集農桿菌菌體，并重懸于預冷至4℃的滲透培養基中，使該含有農桿菌的滲透培養基濃度在OD600＝0.2～1.5；所述滲透培養基為MS+10mM MgCl2+100mMol/L乙酰丁香酮+0.01％2-N嗎啡啉乙磺酸；(3)轉化將洋蔥單層內表皮塊浸浮在上述含有農桿菌的滲透培養基中，使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊充分接觸5～30分鐘進行轉化后，夾起洋蔥單層內表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養基，于25℃，16小時光照/8小時黑暗的培養條件中，共培養16～24小時。
2、 根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特 征在于所述洋蔥鱗莖消毒是采用75%乙醇消毒。
3、 根據權利要求l所述的一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特 征在于所述農桿菌菌株為LBA4404菌株、EHA105菌株或GV3101菌株。
4、 根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特征在于步驟(2)使該含有農桿菌的滲透培養基濃度為OD6oo-1.0。
5、 根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特 征在于步驟(3)使農桿菌與洋蔥單層內表皮塊充分接觸20分鐘進行轉化。
6、 根據權利要求1所述的一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，其特 征在于所述YEB液體培養液包括YEB+125ug/ ml鏈霉素+50ug/ ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+50ug/ ml卡那霉素+10 ug/ ml利福平霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮；或者YEB+ 50 ug/ml慶大霉素+50 ug/ml卡那霉素 +100mMol/L乙酰丁香酮。
全文摘要
本發明公開了一種農桿菌介導的洋蔥表皮細胞轉化方法，該方法將洋蔥單層內表皮塊浸浮在含有農桿菌的滲透培養基中，使農桿菌與洋蔥內表皮塊充分接觸5～30分鐘進行轉化后，夾起洋蔥表皮塊，濾干菌液后平鋪于MS固體培養基，于25℃，16小時光照/8小時黑暗的培養條件中，共培養16～24小時。本發明不依賴于基因槍等貴重儀器，不需要金粉等昂貴的實驗載體材料，僅需一個超淨工作臺以及相關農桿菌菌株就能在最簡單地實驗環境下實現洋蔥表皮細胞的高效轉化，全過程4天，低成本，洋蔥表皮細胞的轉化效率達80％。
文檔編號C12N15/82GK101113458SQ20071002887
公開日2008年1月30日 申請日期2007年6月28日 優先權日2007年6月28日
發明者劉海燕, 梁炫強 申請人:廣東省農業科學院作物研究所