利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法。其技術方案是：葡萄白粉菌菌株小種分離、純化與侵染；通過rDNA序列擴增與進化分析而獲得高致病性的葡萄白粉菌菌株NAFU1；并分析該菌株的保存與擴繁；利用該菌株接種葡萄離體葉片，用臺盼藍染色接種后不同時間病葉，通過觀察孢子萌發早晚、生長快慢、菌絲長短及有無細胞壞死出現等指標，快速準確的檢測葡萄的抗病性。本發明保存擴繁的白粉菌產孢量大，孢子新鮮，致病性強，克服了傳統田間鑒定周期長、重復性差、受氣候影響的缺點，不但可以提高大規模檢測葡萄種質資源抗病性效率，而且對開展大規模快速鑒定葡萄種質資源及其雜種后代和轉基因葡萄植株抗病性具有直接參考價值。
【專利說明】利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物抗病性鑒定方法，特別是涉及一種利用葡萄白粉菌接種葡萄 離體葉片鑒定抗病性的方法，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002] 葡萄白粉菌是嚴重危害葡萄生產的重要真菌病害之一。目前廣泛栽培的歐洲葡萄 極易感病，嚴重影響到葡萄的產量和品質。傳統的化學防治方法雖有效果，但因其殘留高， 污染重，嚴重影響葡萄產品的食用安全，威脅人體健康，污染生態環境，使其應用受到限制。 生產實踐表明，防治葡萄白粉病最經濟、有效、環保的措施就是選育抗病品種，所以抗性鑒 定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種及抗性監測等工作中重要的一環。
[0003] 長期以來，葡萄育種者從國內外廣泛收集了大量葡萄種質資源，并對其進行了抗 病性鑒定。經大量研究表明，利用抗病性鑒定的有效方法，科學、準確、快速地鑒定葡萄種質 資源對白粉病的抗性程度，是提高抗病育種效率、加速育種進程的關鍵環節。
[0004] 目前葡萄白粉病抗性鑒定方法主要有兩種，一種是田間自然發病鑒定法；第二種 是室內人工噴霧接種鑒定法，田間自然發病鑒定是目前應用最廣泛的方法，菌株來源于大 田，其小種數量和種類多樣性、代表性較好，故鑒定結果較能準確反映當地當時的實際情 況，具有成本低、操作簡便易行的特點，缺點是對氣候、季節依賴性強，鑒定次數少，重復性 差。室內人工噴霧接種鑒定法是目前常用的人工接種方法，優點是通過人工控制葡萄白粉 菌發病條件，可不受田間季節的限制而常年進行試驗，結果快速，缺點是噴霧接種的濃度控 制困難，接種用菌株的收集、保存與合理選擇是長期、連續的工作，并且接種用的小種數量、 種類的多樣性與田間試驗方法相比具有一定局限性。同時以上兩種方法的共同不足是需要 輔助材料較多，鑒定周期較長，如需要明顯觀察到病斑，然后才能根據病斑大小統計病情 指數，而這個過程至少需要15-20天，甚至更長時間，這極大地影響了葡萄種質資源大規模 鑒定利用的速度和效率，從而影響到葡萄育種進程。因此，進一步開發科學、準確、快速地鑒 定葡萄種質資源白粉病抗性的方法，無論是對加速葡萄抗病育種的實踐，還是對豐富葡萄 與病原菌互作的理論，都具有十分重要的意義。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服目前田間自然發病鑒定法與室內人工噴霧接種鑒定法鑒 定葡萄白粉病抗性所存在的缺陷，而公開一種利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定 抗病性的方法。
[0006] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0007] a.葡萄白粉菌菌株小種分離與純化
[0008] 在葡萄白粉病發病盛期，在葡萄園采集嚴重感染葡萄白粉菌的葉片，采用單孢分 離法，從采摘的病葉經分離純化獲得葡萄白粉菌，并對分離的葡萄白粉菌菌株進行致病性 鑒定，選擇其中一個菌株感病迅速，致病性強，符合鑒定需要，即為鑒定用葡萄白粉菌菌株 小種；
[0009] b.葡萄白粉菌菌株小種侵染
[0010] 采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌菌株小種接種葡萄健康葉片，檢測菌株小 種對葡萄的侵染過程；
[0011] C.葡萄白粉菌菌株小種rDNA序列擴增
[0012] 收集菌株小種純化后的白粉菌分生孢子，提取該白粉菌基因組DNA，用白粉菌保守 區通用引物ITS4和NS7進行PCR擴增，得到菌株小種保守區DNA片段序列；
[0013] d.葡萄白粉菌菌株小種進化分析
[0014] 用葡萄白粉菌菌株小種保守區DNA片段序列在NCBI進行序列比對及進化分析，表 明獲得了一個新的葡萄白粉菌菌株；
[0015] e.葡萄白粉菌菌株小種保存與擴繁
[0016] 采用直接掃落接種在盆栽葡萄葉片上，摩擦接種插于MS固體培養基上的離體葡 萄葉片和噴灑接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片三種保存方法，對葡萄白粉菌菌 株小種進行保存與擴繁；
[0017] f.用葡萄白粉菌菌株小種接種葡萄種質資源、葡萄雜交后代及轉基因葡萄植株離 體葉片鑒定抗病性
[0018] 取葡萄種質資源、葡萄雜交后代及轉基因葡萄植株離體葉片，壓片接種葡萄白粉 菌菌株小種，分別在接種后不同時間段采樣，用臺盼藍染色，普通顯微鏡觀察，通過統計孢 子萌發及菌絲生長情況，檢測葡萄對白粉病抗性。
[0019] 本發明保存擴繁的白粉菌產孢量大，孢子新鮮，致病性強，鑒定不需要較多輔助材 料，周期短，操作簡便，效果較好；利用本發明不但對開展大規模快速鑒定葡萄種質資源及 其雜種后代和轉基因葡萄植株抗病性具有直接參考價值，而且對開展相關其他植物抗病性 鑒定，具有一定借鑒意義，也對加速作物抗病育種進程，提高育種效率，豐富作物與病原菌 互作理論，提供重要支撐作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 附圖1為本發明葡萄白粉菌菌株NAFUl分離及侵染過程
[0021] A:葡萄白粉菌菌株NAFUl的單孢分離；B :NAFU1孢子僅膨大，但尚未萌發；C : NAFUl孢子開始萌發，菌絲生長正常；D =NAFUl菌絲生長旺盛，遍布葡萄葉片，可以看見明顯 的孢子梗。
[0022] 附圖2為本發明PCR擴增葡萄白粉菌菌株NAFUl保守區DNA及進化樹分析
[0023] A :M為DL2000marker ;1-5 :葡萄白粉菌NAFUl保守區序列PCR擴增片段，泳道2未 有擴增產物；B :葡萄白粉菌NAFUl進化關系分析。
[0024] 附圖3為本發明葡萄白粉菌NAFUl離體葉片保存與擴繁
[0025] A :活體植株接種保存擴繁白粉菌；B :離體葉片插于MS培養基中，采用壓片接種保 存白粉菌；C :離體葉片插于MS培養基中，采用噴灑菌液接種保存白粉菌。
[0026] 附圖4為本發明用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種大田栽植葡萄離體葉片，檢測抗病 性
[0027] 白河-35-1、通化-3、白河-13為中國野生葡萄，'無核白'為歐洲葡萄，壓片接種葡 萄白粉菌NAFUl，分別在接種后0, 24,48和96h采樣，用臺盼藍染色，普通顯微鏡觀察菌絲生 長情況，標尺為100 μ m。
[0028] 附圖5為本發明用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種葡萄雜交后代植株離體葉片，檢測 抗病性。
[0029] A :葡萄雜交后代；B :感病葡萄株系菌絲生長情況；C :抗病葡萄株系菌絲生長情 況，紅色箭頭所指為壞死的細胞，標尺為100 μ m。
[0030] 附圖6為本發明用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種溫室轉基因葡萄植株離體葉片，檢 測抗病性。
[0031] A :未轉基因葡萄菌絲生長情況；B :轉基因葡萄株系菌絲生長情況，紅色箭頭所指 為壞死的細胞；C :未轉基因葡萄在葉片清晰可見一層白粉，而轉基因葡萄未見明顯白粉， 紅色箭頭所指為出現的一些壞死斑，標尺為ΙΟΟμπι。
【具體實施方式】
[0032] 以下結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細描述：
[0033] 實施例一：用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種大田栽植葡萄種質資源離體葉片鑒定抗 病性
[0034] a.葡萄白粉菌菌株NAFUl分離與純化
[0035] 在葡萄白粉病發病盛期，在發病嚴重的葡萄園采集感染葡萄白粉菌的葉片，置于 冰壺中帶回實驗室，選取病原菌發病癥狀明顯的新鮮病葉置于密封袋中，待其發病達到特 別明顯后，從感染白粉菌的病葉上掃落白粉菌到新鮮的葡萄葉片上，然后將接種后的葡萄 葉片置于光照培養箱中，溫度22土 1°C，光照強度10000LX，相對濕度50-75 %，10-15d后， 得到單克隆菌落，待該白粉菌單克隆長到直徑為Icm時，用小毛筆蘸取該單克隆菌落再接 種到新鮮、干凈的葡萄葉片上進行培養，l〇-15d后再次重復此過程，共重復五次這種單克 隆菌落分離過程，如附圖I-A所示；將分離純化獲得葡萄白粉菌病原菌菌株編號，分別保 存，經對上述分離的葡萄白粉菌菌株進行致病性鑒定，其中一個菌株感病迅速，致病性強， 符合鑒定要求，遂將其保存擴繁，命名為NAFUl (西北農林科技大學英文名Northwest A&F University和白粉菌1號的縮寫）；
[0036] b.葡萄白粉菌菌株NAFUl侵染
[0037]為進一步檢測NAFUl對葡萄的侵染過程，采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌 接種移栽7周的葡萄組培苗健康葉片，在接種后ld、2d、3d、4d、5d、7d、10d采樣，臺盼藍染 色，普通顯微鏡下觀察菌絲生長，如附圖1-B，C，D所示，NAFUl接種葡萄葉片ld，孢子僅膨 大，但尚未萌發，接種葡萄葉片3d，孢子開始萌發，菌絲生長正常，接種葡萄葉片IOd后，菌 絲生長旺盛，遍布葡萄葉片，可以看見明顯的附著孢，表明白粉菌生長良好，可以用于后續 的快速檢測；
[0038] c.葡萄白粉菌菌株NAFUlrDNA序列擴增
[0039] 收集NAFUl純化后的白粉菌分生孢子0. 1-0. 2g，置入I. 5ml離心管中，常規CTAB 法提取NAFUl基因組DNA，無菌水溶解DNA，以NAFUl基因組DNA為模板，用白粉菌保守區通 用引物 ITS4:5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3' 和 NS7:5'GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC3' 進行 PCR 擴增，反應程序為：94°C 3min，94°C 30S，50°C 30S，72°C lmin，30 個循環；72°C lOmin， 4°C lOmin，高保真LA酶，擴增出一條800-1000bp單一條帶，電泳結果如附圖2-A所示，將 擴增出的葡萄白粉菌DNA片段連接到pMD19-T克隆載體，提取質粒，將酶切鑒定正確的菌液 送北京華大公司測序，得到葡萄白粉菌保守區DNA片段的序列；
[0040] d.葡萄白粉菌菌株NAFUl進化分析
[0041] 將得到的葡萄白粉菌NAFUl保守區DNA片段的序列在NCBI進行序列比對，用 MEGA5. 0軟件，構建進化樹，分析葡萄白粉菌菌株NAFUl的進化關系，如附圖2-B所示，確認 NAFUl是葡萄白粉菌，可以用于后續的快速檢測；
[0042] e.葡萄白粉菌NAFUl保存與擴繁
[0043] 對分離純化得到的葡萄白粉菌NAFUl進行保存，先后嘗試以下三種保存方法：
[0044] e. 1直接接種在盆栽葡萄葉片上：取感病葡萄葉片，用刷子將白粉菌孢子掃到 盆栽健康葡萄葉片上，置于光照培養箱中，溫度22 ± I °C，光照強度IOOOOLX，相對濕度 50-75%，10-15d后，如附圖3-A所不，可見到明顯的病斑；
[0045] e. 2取離體葡萄葉片插于MS固體培養基中，用病葉摩擦接種離體葉片，然后置于 光照培養箱中，溫度22± I°C，光照強度10000LX，相對濕度50-75%，10-15天后，如附圖3-B 所示，可見到明顯的病斑；
[0046] e. 3收集病葉，在無菌水中涮洗，將孢子溶于水中，噴灑接種于插于MS固體培養 基上的離體葡萄葉片，然后置于光照培養箱中，溫度22土 1°C，光照強度10000LX，相對濕度 50-75%，15-20天后，如附圖3-C所不，可見到明顯的病斑；
[0047] f.用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種大田栽植葡萄種質資源離體葉片鑒定抗病性
[0048] 取大田栽植葡萄種質資源離體葉片，壓片接種葡萄白粉菌NAFU1，分別在接種后 0,24,48和96h采樣，將樣品置于IOml離心管中，加入濃度為0.67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸 12min，冷卻后，在離心管中加入水合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片 藍色褪去，然后用普通顯微鏡觀察菌絲生長情況，如附圖4所示，剛接種時孢子尚未萌發， 接種后24h，感病材料'無核白'葡萄清晰可見菌絲生長，其余葡萄葉片上只見孢子萌發，未 見明顯菌絲，接種后48h，感病材料'無核白'葡萄菌絲生長更加旺盛，感病野生葡萄株系白 河-13可以看見明顯的菌絲生長，但沒有'無核白'葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌絲更少， 接種后96h，感病材料'無核白'葡萄不但菌絲生長更加旺盛，而且可以看見明顯、成熟的孢 子梗，但抗病葡萄如白河35-1、通化-3葉片上菌絲較短，且出現明顯的細胞壞死，表明植物 抗病性出現，通過觀察孢子萌發早晚、生長快慢、菌絲長短及有無細胞壞死出現等指標，可 以快速、準確檢測該葡萄的抗病性；
[0049] 實施例二：用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種葡萄雜交后代植株離體葉片鑒定抗病性
[0050] a.葡萄白粉菌菌株NAFUl分離與純化
[0051] 在葡萄白粉病發病盛期，在葡萄園采集嚴重感染葡萄白粉菌的葉片，采用單孢分 離法，從采摘的病葉經分離純化獲得葡萄白粉菌，并對分離的葡萄白粉菌菌株進行致病性 鑒定，其中一個菌株感病迅速，致病性強，符合鑒定需要，將該菌株命名為NAFUl ;
[0052] b.葡萄白粉菌菌株NAFUl侵染
[0053] 采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌NAFUl接種葡萄健康葉片，檢測NAFUl對葡 萄的侵染過程；
[0054] c.葡萄白粉菌菌株NAFUlrDNA序列擴增
[0055] 收集NAFUl純化后的白粉菌分生孢子，提取該白粉菌基因組DNA，用白粉菌保守區 通用引物ITS4和NS7進行PCR擴增，得到NAFUl保守區DNA片段序列；
[0056] d.葡萄白粉菌菌株NAFUl進化分析
[0057] 將得到葡萄白粉菌NAFUl保守區DNA片段的序列在NCBI進行序列比對，構建進化 樹，分析葡萄白粉菌菌株NAFUl的進化關系，表明獲得了一個新的葡萄白粉菌菌株；
[0058] e.葡萄白粉菌NAFUl保存與擴繁
[0059] e. 1直接接種在盆栽葡萄葉片上保存，
[0060] e. 2摩擦接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片保存，
[0061] e. 3噴灑接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片保存；
[0062] f.用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種葡萄雜交后代植株離體葉片鑒定抗病性
[0063] f. 1葡萄雜交后代植株準備
[0064] 將葡萄雜交后代種子播種于溫室，播種基質為泥炭：珍珠巖：蛭石=8:1:1，溫度 22土 1°C，光照強度12000LX，相對濕度70-85 %，待播種生長6周后，生長情況如圖5-A所 示，取健康、正常葉片用于后續檢測；
[0065] f. 2臺盼藍染色
[0066] 以上述溫室播種生長6周、健康、正常的葡萄雜交后代為材料，分別剪取從頂端向 下第3、第4片葉片，插于清水中，用壓片法接種葡萄白粉菌NAFU1，在接種后4-5d采樣，將 樣品置于IOml離心管中，加入濃度為0. 67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸12min，冷卻后，在離心管 中加入水合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片藍色褪去；
[0067] f. 3鏡檢觀察
[0068] 在奧林巴斯普通光學顯微鏡下觀察經上述臺盼藍染色的葉片，如圖5-B，C所示， 接種5d后，感病葡萄株系可以看見明顯的菌絲生長，而且可以看見明顯、成熟的孢子梗，但 抗病葡萄葉片上菌絲較短，且出現明顯的細胞壞死，表明植物抗病性出現。
[0069] 實施例三：用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種溫室轉基因葡萄植株離體葉片鑒定抗病 性
[0070] a.葡萄白粉菌菌株NAFUl分離與純化
[0071] 在葡萄白粉病發病盛期，在葡萄園采集嚴重感染葡萄白粉菌的葉片，采用單孢分 離法，從采摘的病葉經分離純化獲得葡萄白粉菌，并對分離的葡萄白粉菌菌株進行致病性 鑒定，其中一個菌株感病迅速，致病性強，符合鑒定需要，將該菌株命名為NAFUl ;
[0072] b.葡萄白粉菌菌株NAFUl侵染
[0073] 采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌NAFUl接種葡萄健康葉片，檢測NAFUl對葡 萄的侵染過程；
[0074] c.葡萄白粉菌菌株NAFUlrDNA序列擴增
[0075] 收集NAFUl純化后的白粉菌分生孢子，提取該白粉菌基因組DNA，用白粉菌保守區 通用引物ITS4和NS7進行PCR擴增，得到NAFUl保守區DNA片段序列；
[0076] d.葡萄白粉菌菌株NAFUl進化分析
[0077] 將得到葡萄白粉菌NAFUl保守區DNA片段的序列在NCBI進行序列比對，構建進化 樹，分析葡萄白粉菌菌株NAFUl的進化關系，表明獲得了一個新的葡萄白粉菌菌株；
[0078] e.葡萄白粉菌NAFUl保存與擴繁
[0079] e. 1直接接種在盆栽葡萄葉片上保存，
[0080] e. 2摩擦接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片保存，
[0081] e. 3噴灑接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片保存；
[0082] f.用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種溫室轉基因葡萄植株離體葉片鑒定抗病性
[0083] f. 1溫室轉基因葡萄植株準備
[0084] 將生長健壯的轉基因葡萄組培苗移栽于煉苗室，移栽基質為泥炭：珍珠巖：蛭石 =8:1:1，溫度22 土 1°C，光照強度10000LX，相對濕度90-95 %，待移栽生長8周后，移栽于 溫室中，溫度22 ± I °C，光照強度13000LX，相對濕度70-80 %，繼續生長4周后，取健康、正常 葉片用于后續檢測；
[0085] f. 2臺盼藍染色
[0086] 以上述溫室移栽生長4周、健康、正常的轉基因葡萄為材料，分別剪取從頂端向下 第3、第4片葉片，插于清水中，用壓片法接種葡萄白粉菌NAFU1，在接種后4-5d采樣，將樣 品置于IOml離心管中，加入濃度為0. 67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸12min，冷卻后，在離心管中 加入水合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片藍色褪去；
[0087] f. 3鏡檢觀察
[0088] 在奧林巴斯普通光學顯微鏡下觀察經上述臺盼藍染色的葉片，如圖6-A，B所示， 接種5d后，未轉基因葡萄可見明顯的菌絲生長，而且可見明顯、成熟的孢子梗，但抗病葡萄 葉片上菌絲較短，且出現明顯的細胞壞死，如圖6-C所示，接種15d后，未轉基因葡萄在葉片 清晰可見一層白粉，而轉基因葡萄未見明顯白粉，出現一些壞死斑，表明植物抗病性出現。
[0089] 取大田栽植葡萄離體葉片，壓片接種葡萄白粉菌NAFUl，分別在接種后0, 24,48和 96h采樣，用臺盼藍染色，普通顯微鏡觀察菌絲生長情況，根據附圖4的結果，結合原來的田 間自然發病鑒定結果，統計出葡萄對白粉病抗性結果如附表，結果表明，離體葉片和田間自 然發病鑒定結果符合程度較高。
[0090] 利用葡萄白粉菌菌株NAFUl檢測大田栽植葡萄對白粉病抗性結果統計表
[0091]
【權利要求】
1. 利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法，其特征是通過以下技術 方案實現的： a. 葡萄白粉菌菌株小種分離與純化 在葡萄白粉病發病盛期，在葡萄園采集嚴重感染葡萄白粉菌的葉片，采用單孢分離法， 從采摘的病葉經分離純化獲得葡萄白粉菌，并對分離的葡萄白粉菌菌株進行致病性鑒定， 選擇其中一個菌株感病迅速，致病性強，符合鑒定需要，即為鑒定用葡萄白粉菌菌株小種； b. 葡萄白粉菌菌株小種侵染 采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌菌株小種接種葡萄健康葉片，檢測菌株小種對 葡萄的侵染過程； c. 葡萄白粉菌菌株小種rDNA序列擴增 收集菌株小種純化后的白粉菌分生孢子，提取該白粉菌基因組DNA，用白粉菌保守區通 用引物ITS4和NS7進行PCR擴增，得到菌株小種保守區DNA片段序列； d. 葡萄白粉菌菌株小種進化分析 用葡萄白粉菌菌株小種保守區DNA片段序列在NCBI進行序列比對及進化分析，表明獲 得了一個新的葡萄白粉菌菌株； e. 葡萄白粉菌菌株小種保存與擴繁 采用直接掃落接種在盆栽葡萄葉片上，摩擦接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉 片和噴灑接種插于MS固體培養基上的離體葡萄葉片三種保存方法，對葡萄白粉菌菌株小 種進行保存與擴繁； f. 用葡萄白粉菌菌株小種接種葡萄種質資源、葡萄雜交后代及轉基因葡萄植株離體葉 片鑒定抗病性 取葡萄種質資源、葡萄雜交后代及轉基因葡萄植株離體葉片，壓片接種葡萄白粉菌菌 株小種，分別在接種后不同時間段采樣，用臺盼藍染色，普通顯微鏡觀察，通過統計孢子萌 發及菌絲生長情況，檢測葡萄對白粉病抗性。
2. 根據權利要求1所述的利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法， 其特征是通過以下步驟用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種大田栽植葡萄種質資源離體葉片鑒 定抗病性： a. 葡萄白粉菌菌株NAFUl分離與純化 在葡萄白粉病發病盛期，在發病嚴重的葡萄園采集感染葡萄白粉菌的葉片，置于冰壺 中帶回實驗室，選取病原菌發病癥狀明顯的新鮮病葉置于密封袋中，待其發病達到特別明 顯后，從感染白粉菌的病葉上掃落白粉菌到新鮮的葡萄葉片上，然后將接種后的葡萄葉片 置于光照培養箱中，溫度22 ± I °C，光照強度10000LX，相對濕度50-75 %，10-15d后，得到單 克隆菌落，待該白粉菌單克隆長到直徑為Icm時，用小毛筆蘸取該單克隆菌落再接種到新 鮮、干凈的葡萄葉片上進行培養，l〇-15d后再次重復此過程，共重復五次這種單克隆菌落分 離過程，將分離純化獲得葡萄白粉菌病原菌菌株編號，分別保存，經對上述分離的葡萄白粉 菌菌株進行致病性鑒定，其中一個菌株感病迅速，致病性強，符合鑒定要求，遂將其保存擴 繁，命名為NAFUl ; b. 葡萄白粉菌菌株NAFUl侵染 為進一步檢測NAFUl對葡萄的侵染過程，采用壓片接種法，用保存的新鮮白粉菌接種 移栽7周的葡萄組培苗健康葉片，在接種后ld、2d、3d、4d、5d、7d、10d采樣，臺盼藍染色，普 通顯微鏡下觀察菌絲生長，NAFUl接種葡萄葉片ld，孢子僅膨大，但尚未萌發，接種葡萄葉 片3d，孢子開始萌發，菌絲生長正常，接種葡萄葉片IOd后，菌絲生長旺盛，遍布葡萄葉片， 可以看見明顯的附著孢，表明白粉菌生長良好，可以用于后續的快速檢測； c. 葡萄白粉菌菌株NAFUlrDNA序列擴增 收集NAFUl純化后的白粉菌分生孢子0. 1-0. 2g，置入I. 5ml離心管中，常規CTAB法 提取NAFUl基因組DNA，無菌水溶解DNA，以NAFUl基因組DNA為模板，用白粉菌保守區通 用引物 ITS4 :5' TCCTCCGCTTATTGATATGC3' 和 NS7 :5' GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC3' 進行 PCR 擴增，反應程序為：94°C 3min，94°C 30S，50°C 30S，72°C lmin，30 個循環；72°C lOmin， 4°C lOmin，高保真LA酶，擴增出一條800-1000bp單一條帶，將擴增出的葡萄白粉菌DNA片 段連接到PMD19-T克隆載體，提取質粒，將酶切鑒定正確的菌液送北京華大公司測序，得到 葡萄白粉菌保守區DNA片段的序列； d. 葡萄白粉菌菌株NAFUl進化分析 將得到的葡萄白粉菌NAFUl保守區DNA片段的序列在NCBI進行序列比對，用MEGA5. 0 軟件，構建進化樹，分析葡萄白粉菌菌株NAFUl的進化關系，確認NAFUl是葡萄白粉菌，可以 用于后續的快速檢測； e. 葡萄白粉菌NAFUl保存與擴繁 對分離純化得到的葡萄白粉菌NAFUl進行保存，先后嘗試以下三種保存方法： e. 1直接接種在盆栽葡萄葉片上：取感病葡萄葉片，用刷子將白粉菌孢子掃到盆栽健 康葡萄葉片上，置于光照培養箱中，溫度22土 TC，光照強度10000LX，相對濕度50-75 %， l〇-15d后，可見到明顯的病斑； e. 2取離體葡萄葉片插于MS固體培養基中，用病葉摩擦接種離體葉片，然后置于光照 培養箱中，溫度22土 1°C，光照強度10000LX，相對濕度50-75%，10-15天后，可見到明顯的 病斑； e. 3收集病葉，在無菌水中涮洗，將孢子溶于水中，噴灑接種于插于MS固體培養基 上的離體葡萄葉片，然后置于光照培養箱中，溫度22土TC，光照強度10000LX，相對濕度 50-75%，15-20天后，可見到明顯的病斑； f. 用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種大田栽植葡萄種質資源離體葉片鑒定抗病性 取大田栽植葡萄種質資源離體葉片，壓片接種葡萄白粉菌NAFUl，分別在接種后0, 24， 48和96h采樣，將樣品置于IOml離心管中，加入濃度為0. 67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸12min， 冷卻后，在離心管中加入水合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片藍色褪 去，然后用普通顯微鏡觀察菌絲生長情況，剛接種時孢子尚未萌發，接種后24h，感病材料 '無核白'葡萄清晰可見菌絲生長，其余葡萄葉片上只見孢子萌發，未見明顯菌絲，接種后 48h，感病材料'無核白'葡萄菌絲生長更加旺盛，感病野生葡萄株系白河-13可以看見明顯 的菌絲生長，但沒有'無核白'葡萄多，抗病葡萄如白河35-1菌絲更少，接種后96h，感病材 料'無核白'葡萄不但菌絲生長更加旺盛，而且可以看見明顯、成熟的孢子梗，但抗病葡萄如 白河35-1、通化-3葉片上菌絲較短，且出現明顯的細胞壞死，表明植物抗病性出現，通過觀 察孢子萌發早晚、生長快慢、菌絲長短及有無細胞壞死出現等指標，可以快速、準確檢測該 葡萄的抗病性；
3. 根據權利要求2所述的利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法， 其特征在于： f.用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種葡萄雜交后代植株離體葉片鑒定抗病性 f. 1葡萄雜交后代植株準備 將葡萄雜交后代種子播種于溫室，播種基質為泥炭：珍珠巖：蛭石=8:1:1，溫度 22 土 1°C，光照強度12000LX，相對濕度70-85%，待播種生長6周后，取健康、正常葉片用于 后續檢測； f. 2臺盼藍染色 以上述溫室播種生長6周、健康、正常的葡萄雜交后代為材料，分別剪取從頂端向下第 3、第4片葉片，插于清水中，用壓片法接種葡萄白粉菌NAFU1，在接種后4-5d采樣，將樣品置 于IOml離心管中，加入濃度為0. 67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸12min，冷卻后，在離心管中加入 水合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片藍色褪去； f. 3鏡檢觀察 在奧林巴斯普通光學顯微鏡下觀察經上述臺盼藍染色的葉片，接種5d后，感病葡萄株 系可以看見明顯的菌絲生長，而且可以看見明顯、成熟的孢子梗，但抗病葡萄葉片上菌絲較 短，且出現明顯的細胞壞死，表明植物抗病性出現。
4. 根據權利要求2所述的利用葡萄白粉菌接種葡萄離體葉片快速鑒定抗病性的方法， 其特征在于： f.用葡萄白粉菌菌株NAFUl接種溫室轉基因葡萄植株離體葉片鑒定抗病性 f. 1溫室轉基因葡萄植株準備 將生長健壯的轉基因葡萄組培苗移栽于煉苗室，移栽基質為泥炭：珍珠巖：蛭石= 8:1:1，溫度22 ± I °C，光照強度10000LX，相對濕度90-95 %，待移栽生長8周后，移栽于溫室 中，溫度22 ± I °C，光照強度13000LX，相對濕度70-80 %，繼續生長4周后，取健康、正常葉片 用于后續檢測； f. 2臺盼藍染色 以上述溫室移栽生長4周、健康、正常的轉基因葡萄為材料，分別剪取從頂端向下第3、 第4片葉片，插于清水中，用壓片法接種葡萄白粉菌NAFU1，在接種后4-5d采樣，將樣品置于 IOml離心管中，加入濃度為0. 67mg/ml臺盼藍2ml，煮沸12min，冷卻后，在離心管中加入水 合氯醛3ml，靜置24h后，倒去廢液，重復三次，直到葉片藍色褪去； f. 3鏡檢觀察 在奧林巴斯普通光學顯微鏡下觀察經上述臺盼藍染色的葉片，接種5d后，未轉基因葡 萄可以看見明顯的菌絲生長，而且可以看見明顯、成熟的孢子梗，但抗病葡萄葉片上菌絲較 短，且出現明顯的細胞壞死，接種15d后，未轉基因葡萄在葉片清晰可見一層白粉，而轉基 因葡萄未見明顯白粉，出現一些壞死斑，表明植物抗病性出現。
【文檔編號】C12Q1/68GK104313117SQ201410541569
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】文穎強, 韓永濤, 高玉榮 申請人:西北農林科技大學