糖化血紅蛋白的測定方法
【專利摘要】一種含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法，其特征在于，在選自由吡啶鹽、鹽、咪唑鹽和異喹啉鹽組成的組中的至少一種鹽存在下，使含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白與蛋白質分解酶反應，使果糖基肽氧化酶作用于得到的反應產物，并測定生成的過氧化氫。根據本發明，提供準確地測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的方法。
【專利說明】糖化血紅蛋白的測定方法
[0001] 本申請是申請號為201180038604. X(國際申請號為PCT/JP2011/068104)、中國國 家階段進入日為2013年2月5日（國際申請日為2011年8月9日）、發明名稱為"糖化血 紅蛋白的測定方法"的中國發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002] 本發明涉及含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法、測定試劑及測定 試劑盒。另外，本發明涉及含有無色型色原體的水溶液的保存方法、無色型色原體的穩定化 方法。
【背景技術】
[0003] 糖化血紅蛋白是在血紅蛋白上結合葡萄糖而成的糖化物。血紅蛋白具有由α鏈、 β鏈構成的四聚體結構，但將β鏈的N末端糖化后的血紅蛋白稱為血紅蛋白Alc，血糖值 越高越增加，因此，作為糖尿病標志物，在臨床檢查中進行日常測定作為血糖控制的指標。
[0004] 作為糖化血紅蛋白的測定方法，已知HPLC法等色譜法、電泳法、膠乳免疫凝聚法 等利用抗體的免疫測定法、使用作用于糖化蛋白的酶和作用于糖化肽和/或糖化氨基酸的 酶的酶測定法等。
[0005] 作為糖化血紅蛋白的酶測定法，已知如下方法等：首先，通過改性劑使含有血紅蛋 白的試樣中的糖化血紅蛋白改性，使蛋白質分解酶作用于改性糖化血紅蛋白，接著，使糖化 肽氧化酶作用于生成的糖化肽，使生成的過氧化氫在過氧化物酶等過氧化活性物質存在下 與氧化顯色型色原體反應而導入色素中，由生成的色素的吸光度測定糖化血紅蛋白。在此， 改性劑用于使蛋白質分解酶能夠作用于糖化血紅蛋白，目前為止已知：含有乙酸基的化合 物或其鹽、N-酰基牛磺酸或其鹽、聚氧乙烯烷基醚硫酸或其鹽（專利文獻1);聚氧乙烯烷基 醚硫酸鹽類、聚氧乙烯烷基苯基醚硫酸鹽類等陰離子類表面活性劑（專利文獻2);月桂基 硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉等磺酸化合物（專利文獻3);磺酸化合物和硝基化合物（專利 文獻4);季銨鹽、烷基芐基二甲基氯化銨、月桂基二甲胺氧化物等（專利文獻5)改性劑。
[0006] 另外，糖化血紅蛋白的酶測定法中，經常使用如下方法：將糖化血紅蛋白轉變成過 氧化氫，使所生成的過氧化氫在過氧化物酶等過氧化活性物質存在下與氧化顯色型色原體 反應而導入色素中，由所生成的色素的吸光度測定糖化血紅蛋白。在此，作為氧化顯色型色 原體，經常使用無色型色原體。無色型色原體是在過氧化物酶等過氧化活性物質存在下與 過氧化氫反應而生成色素的色原體的一種，與耦合型色原體不同，無色型色原體是其本身 單獨即可生成色素的色原體，已知有吩噻嗪類的無色型色原體、三苯基甲烷類的無色型色 原體、二苯胺類的無色型色原體等（例如參照專利文獻6?8)。
[0007] 作為高靈敏度色原體，無色型色原體適合用于對試樣中僅微量存在的應該定量的 成分進行定量（例如參照非專利文獻1)。但是，另一方面，其保存穩定性差，特別是具有在 溶液中隨時間而自然顯色的缺點，由于該無色型色原體所具有的穩定性不良，產生無法準 確地測定試樣中應該定量的成分的問題。
[0008] 針對該無色型色原體所具有的穩定性不良的問題，目前為止已研究并報道了無色 型色原體在溶液中穩定化的方法（例如參照專利文獻9、10)。
[0009] 現有技術文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻I :W02006/013921小冊子
[0012] 專利文獻2 :TO2005/049858小冊子
[0013] 專利文獻3 :W02004/007760小冊子
[0014] 專利文獻4 :W02003/107011小冊子
[0015] 專利文獻5 :日本特開2009-159989號公報
[0016] 專利文獻6 :日本特開昭57-029297號公報
[0017] 專利文獻7 :日本特開平3-206896號公報
[0018] 專利文獻8 :日本特開昭62-093261號公報
[0019] 專利文獻9 :TO2005/088305小冊子
[0020] 專利文獻 10 :W02007/083703 小冊子
[0021] 非專利文獻
[0022] 非專利文獻 1 :臨床檢查，1997 年，Vol. 41，No. 9, P. 1014-1019
【發明內容】
[0023] 發明所要解決的問題
[0024] 在糖化血紅蛋白的酶測定法中，關于目前已知的糖化血紅蛋白的改性劑，由于糖 化血紅蛋白的改性不充分，因此，無法令人滿意地進行蛋白質分解酶反應，存在不能進行糖 化血紅蛋白的準確測定的問題。另外，在糖化血紅蛋白的測定方法中，關于所使用的無色型 色原體，以往已知的保存方法需要在嚴苛的條件下進行保存等，不一定可以說是能夠令人 滿意的方法。
[0025] 本發明的目的在于提供準確地測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的方 法、試劑和試劑盒、以及能夠準確地測定含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的、含有無 色型色原體的水溶液的保存方法和無色型色原體的穩定化方法。
[0026] 用于解決問題的方法
[0027] 本發明人對本問題進行了深入的研究，結果發現如下見解：通過在吡啶_鹽、憐. 鹽、咪唑镥鹽或異喹啉镥鹽存在下使含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白與蛋白質分解 酶反應，能夠使血紅蛋白和糖化血紅蛋白充分地改性，從而能夠準確地測定含有血紅蛋白 的試樣中的糖化血紅蛋白。另外發現吡啶?鹽、禱鹽、咪唑鋪鹽或異喹啉鋪鹽使無色型色原 體穩定化的見解，從而完成了本發明。即，本發明涉及以下的[1]?[18]。
[0028] [1] 一種含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法，其特征在于，在選自 由由以下通式（I)表示的吡啶镲鹽、由以下通式（II)表示的憐鹽、由以下通式（III)表示 的咪唑錈鹽和由以下通式（IV)表示的異喹啉錨鹽組成的組中的至少一種鹽存在下,使含 有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白與蛋白質分解酶反應，使果糖基肽氧化酶作用于得到 的反應產物，并測定生成的過氧化氫，
[0029]
【權利要求】
1. 一種含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白的測定方法，其特征在于，在由以下通 式a)表示的吡啶Ii鹽存在下，使含有血紅蛋白的試樣中的糖化血紅蛋白與蛋白質分解酶 反應，使果糖基肽氧化酶作用于得到的反應產物，并測定生成的過氧化氫，
式（I)中，R1表示取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的烯基，Ra表示氫原子、取 代或未取代的燒基、或者取代或未取代的烯基，η表示1?5的整數，表示1價的陰離子。
2. 如權利要求1所述的測定方法，其中，過氧化氫的測定利用過氧化氫測定試劑來進 行。
3. 如權利要求2所述的測定方法，其中，過氧化氫測定試劑為含有過氧化物酶和無色 型色原體的試劑。
4. 如權利要求3所述的測定方法，其中，無色型色原體為吩噻嗪類色原體。
5. 如權利要求4所述的測定方法，其中，吩噻嗪類色原體為10-(羧甲基氨基羰 基）-3, 7-雙（二甲氨基）吩噻嗪。
【文檔編號】C12Q1/28GK104313121SQ201410541606
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2011年8月9日 優先權日:2010年8月11日
【發明者】征矢陽代, 村上智美, 角田春樹, 大杉友, 依田彩子, 松下政嗣 申請人:協和梅迪克斯株式會社