一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1a的特異引物組合的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合，包括ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本發明同時還提供了根據上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求1所述的特異引物組合進行PCR檢測。本發明根據能鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的ISSR引物擴增序列設計引物，通過PCR擴增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻不育系駿1A。本發明提供的三系雜交水稻不育系駿1A的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進而在輔助其育種中進行應用。
【專利說明】-種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測【技術領域】，特別涉及一種用于檢測三系雜交水稻不育系駿IA 的特異引物組合。
【背景技術】
[0002] 我國是世界上最大的雜交水稻種子生產國和消費國，具有龐大的雜交水稻種子市 場。目前國內雜交水稻年種植面積約占水稻年種植總面積的59%以上，使水稻產量大幅度 提高，為保障我國的糧食安全做出了重要貢獻。獲得高純度的雜交種子是充分發揮雜種優 勢增產潛力的基礎。機械混雜和生物學混雜是三系雜交水稻親本雜株的主要來源。種子純 度是衡量雜交水稻種子質量的主要指標，純度的下降將導致作物產量和質量的明顯降低。 低純度、真實性差的雜交水稻種子給農業生產帶來極大損失，是種子質檢部門、育種研究單 位、制種單位和種子公司共同關心的問題。三系雜交水稻不育系的純度是制約雜交稻生產 的關鍵因素。
[0003] 三系雜交水稻不育系"駿1A"為本 申請人:自主培育的，不育系"駿1A"與恢復系 "R0172"配組育成的三系雜交中稻品種"駿優172"，以及不育系"駿1A"與恢復系"R522"配 組育成的三系雜交早熟中稻品種"駿優522"，均已通過湖北省品種審定，抗稻瘟病，米質優， 是適合湖北省恩施州種植的農作物新品種。
[0004] 在實現上述研發的過程中，本申請的發明人發現現有技術至少存在以下問題：
[0005] 沒有鑒定三系雜交水稻不育系"駿1A"的特異引物，無法將上述水稻品種與其親本 區分開，不能對其進行快速的種子純度分子標記鑒定和相關的分子標記輔助育種等工作。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，解決了
【背景技術】中的問題，采用該引物組合能夠快速、準確的對三系雜交水稻不育系駿IA進行鑒 定。
[0007] 實現本發明上述目的所采用的技術方案為：
[0008] -種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，包括ZJJU01、 ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其中ZJJUOl正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0009] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0010] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0011] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0012] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0013] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0014] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0015] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0016] 本發明同時還提供了根據上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的方 法，步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求1所述的特異 引物組合進行PCR檢測。
[0017] 所述的PCR反應條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環降 低 0.7°C，72°C延伸 lmin30s，15 個循環；
[0018] 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環；72°C后延伸 lOmin。
[0019] 所述的PCR反應體系為：50ng/y 1的DNA模板0. 8μ 1，10XPCR緩沖液1μ 1，2. 5mM dNTPs 0. 8 μ 1，10 μ M 正、反向引物各 0. 2 μ 1，DNA 聚合酶 0. 5U，ddH20 補足至 10 μ 1。
[0020] 本發明還提供了一種含有上述特異引物組合的檢測試劑盒。
[0021] 上述試劑盒能夠在鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的純度以及輔助其育種中進行 應用。
[0022] 本發明根據能鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的ISSR引物擴增序列設計引物，通 過PCR擴增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻不育系駿1Α。本發明提供的三 系雜交水稻不育系駿IA的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進而在輔助其育種 中進行應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本實施例中通過PCR反應在水稻中的擴增結果圖A
[0024] 圖2為本實施例中通過PCR反應在水稻中的擴增結果圖Β。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖以及具體實施例對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護范 圍并不局限于以下實施例。
[0026] 以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等 的《分子克隆：實驗室手冊》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中 所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑均為市售商品。
[0027] 本實施例提供的用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0028] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0029] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0030] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0031] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0032] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0033] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0034] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0035] 本實施例中采用上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的方法，步驟如 下：
[0036] 1.實驗材料
[0037] I. 1植物材料
[0038] 中駿優1及其親本不育系418A、保持系418B和恢復系R964,中駿優1的相似來源 不育系中九A和保持系中九B ;駿優522及其未本不育系駿1A、保持系駿IB和恢復系R522， 駿優522的的相似來源不育系福伊A和保持系福伊B。
[0039] L 2酶與試劑
[0040] 分子生物學試劑，TAKARA rTaq DNA聚合酶，10XPCR緩沖液，dNTP Mixture (2. 5mM)購自大連寶生物公司。
[0041] 其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成。
[0042] 1. 3實驗儀器
[0043] 振蕩破碎儀（Geno/grinder, USA);
[0044] PCR 擴增儀：PTC-1OOTM (MJ, USA);
[0045] 核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠）；
[0046] DNA電泳分析系統：GeneSnap凝膠成像分析系統；
[0047] 其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、渦旋儀、純水儀、恒溫培養箱等。
[0048] 2.實驗方法
[0049] 2. 1水稻基因組DNA的提取
[0050] 水稻單粒種植，取幼嫩葉片作為DNA提取材料，依照參照冷泉港實驗室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin 和 Kaaren A. Janssen 編著的 《分子克隆》一書提取水稻材料的總DNA。
[0051] 2.2PCR 擴增
[0052] 根據能鑒定三系雜交水稻不育系駿IA及其組合的ISSR引物擴增序列設計的特異 引物，利用該4對引物組合，以水稻基因組DNA為模板進行PCR擴增.
[0053] PCR 擴增體系為：10XPCR 緩沖液 1μ l，2.5mM dNTPs 0·6μ 1，10μΜ 正、反向引物 各(λ 2 μ 1，DNA 聚合酶(λ 5U，50ng/μ I DNA 模板(λ 5 μ 1，ddH 20 補足至 10 μ 1。
[0054] PCR擴增程序：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，（其中每個循環降低 0. 7°C ) 72°C延伸 lmin30s，15 個循環；94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循 環；72°C后延伸10min。
[0055] 3.實驗結果
[0056] 擴增均以無菌水為陰性對照，只有當陰性對照擴增無任何帶型，則說明PCR結果 可靠。統計被檢測材料的擴增帶，陰性計為〇,陽性計為1。統計結果和聚類分析結果如下 表以及圖1和圖2所示。結果表明，本發明的4對分子標記組合可以將三系雜交水稻不育 系駿IA與其組合區分開。
[0057] 4對分子標記引物組合擴增2個三系雜交水稻組合的指紋圖譜統計
[0058]
【權利要求】
1. 一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合，其特征在于：包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ； ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ; ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ; ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ; ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCmTCGGCCAGGA ; ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ; ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
2. -種基于權利要求1所述的引物組合的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特 征在于步驟如下：首先提取目標植物基因組，然后以基因組為模板，用權利要求1所述的特 異引物組合進行PCR檢測。
3. 根據權利要求2所述的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特征在于：所述的 PCR反應條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環降低0. 7°C，72°C延 伸lmin30s，15個循環； 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環；72°C后延伸 10min。
4. 根據權利要求2或3所述的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特征在 于：所述的PCR反應體系為：50ng/iil的DNA模板0.8iil，10XPCR緩沖液liil，2.5mM dNTPs0.8ii l，10iiM 正、反向引物各 0.2ii 1，DNA 聚合酶 0.5U，ddH20 補足至 10ii 1。
5. -種含有權利要求1所述特異引物組合的檢測試劑盒。
6. 權利要求5所述試劑盒在鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的純度以及輔助其育種中 的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404147SQ201410693230
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】徐鑫, 劉學群, 譚艷平, 王春臺, 熊杰 申請人:中南民族大學