一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2?1及應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1及應用。

背景技術：

水稻作為世界上主要的糧食作物之一，其產量的高低直接影響全球糧食安全。水稻稻瘟病作為真菌性病害已成為熱帶和溫帶國家水稻最主要的病害，其大規模爆發可使水稻嚴重減產甚至絕收。尤其表現在中國的雜交水稻育種中，由于雜交水稻發展過程中親本間的遺傳關系較近，遠緣優異抗病資源引入較少，導致雜交水稻抗病性改良進展緩慢。目前對于水稻稻瘟病主要以預防為主，在水稻生長抽穗初期噴施化學農藥加以防治。然而這樣又帶來了水稻生產成本的的提高、水稻食用安全以及環境污染等問題。

培育抗稻瘟病水稻新品種是解決以上諸多問題既經濟環保又安全高效的有效途徑。傳統的育種方法將抗病品種與感病品種雜交，在后代根據抗病表型選擇優異后代的方法，具有表型鑒定年際間不穩定、選擇過程容易丟失抗病性的弊端。隨著生物技術的發展，尤其水稻基因組學，為稻瘟病基因的鑒定克隆奠定了良好的基礎。截至目前，已經克隆的水稻抗稻瘟病基因已有21個，另有多個已被精細定位。伴隨著水稻抗稻瘟病基因的精細定位與克隆，與水稻抗稻瘟病基因緊密連鎖甚至共分離的分子標記則可用于水稻抗稻瘟病分子標記輔助選擇。

水稻抗稻瘟病基因Pi2于2006年被克隆，該基因具有廣譜抗性，被廣泛應用于水稻抗稻瘟病遺傳改良。現有技術中水稻抗稻瘟病基因Pi2的應用主要體現在開發與Pi2緊密連鎖的分子標記用于Pi2分子標記輔助選擇。然而，這些開發的標記多為SSR標記與Pi2為連鎖關系，位于Pi2基因外部，隨著遺傳選擇世代的增加，標記與Pi2的連鎖關系往往會被打破，導致標記跟蹤失效，利用效率低下。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記及應用，本發明根據基因內部核苷酸序列在不同品種之間的差異(包括變異和缺失)，通過設計基因內部的In-Del(插入-缺失)標記，將不同水稻品種類型的基因型分開，該方法具有穩定性(不同的堿基缺失在不同水稻品種中穩定存在)和標記追蹤可靠性(標記在基因內部與基因共分離)。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1，功能分子標記所擴增的DNA片段包含水稻抗稻瘟病基因Pi2基因組序列的第1543-1545位核苷酸，某些水稻感稻瘟病品種在該位點存在ACA 3個堿基缺失，由引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻基因組中擴增出抗稻瘟病基因Pi2的DNA片段，經電泳檢測DNA片段大小，從而確定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，進而確定其稻瘟病抗性。

本發明還公開了一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1的引物對，所述引物對的正向引物如SEQ ID NO.1所示，所述引物對的反向引物如SEQ ID NO.2所示。

本發明還公開了一種鑒定水稻抗稻瘟病基因Pi2的方法，包括以下步驟：

1)通過常規PCR法擴增及測序，獲得水稻抗稻瘟病基因Pi2的1個抗病等位基因與1個感病等位基因序列；

2)將步驟1)所獲得的序列進行比對，得到水稻抗稻瘟病基因Pi2的第1543-1545位點處存在ACA 3個堿基缺失，該差異位于該基因的外顯子；

3)對不同水稻的總DNA進行PCR擴增反應，所得擴增產物進行電泳檢測驗證，獲得與水稻抗稻瘟病基因Pi2呈特異性帶型的核苷酸片段；

4)對步驟3)所獲得的分子標記在不同的水稻品種中進行帶型顯色和基因型分型，從而確定水稻抗稻瘟病基因Pi2的完整性，進而確定其稻瘟病抗性。

進一步地，步驟3)中的PCR反應體系如下：

進一步地，電泳檢測中的8％聚丙烯酰胺凝膠的組成如下：

進一步地，顯色中的聚丙烯酰胺凝膠顯色液100ml的組成如下：

本發明還公開了一種上述的水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1在篩選和鑒定水稻稻瘟病抗性品種中的應用。

與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：本發明利用水稻抗稻瘟病基因Pi2開發了新的Pi2功能分子標記。這些功能分子標記的開發將有助于將Pi2導入不同的水稻遺傳背景中進而利用分子標記輔助選擇技術快速高效地篩選到新的抗稻瘟病水稻新品種。

當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發明Pi2-1抗病品種和感病品種基因型分析；其中，1-12，分別為抗病品種：粵農絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號；13-24，分別為感病品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854；

圖2是本發明各抗稻瘟病品種和感稻瘟病品種抗性表型鑒定；其中，1-12，分別為抗病品種：粵農絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號；13-24，分別為感病品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854；

圖3是本發明Pi2-1在R900/華占F₂群體中的基因型分型分析；其中，1華占；2，R900；3-24，R900/華占F₂分離群體中各單株的基因型分型；

圖4是本發明華占，R900以及R900/華占F₂群體中與圖3中各單株基因型相對應的稻瘟病抗病表型，其中，1華占；2，R900；3-24，R900/華占F₂分離群體中各單株的基因型分型。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

實施例1水稻抗稻瘟病基因Pi2在不同水稻品種中的基因序列分析和功能分子標記開發

水稻材料：粵農絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，昌香恢1號，麗江新團黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854。

對上述不同水稻品種中的抗稻瘟病基因Pi2進行測序，進一步對所測的各品種抗稻瘟病基因Pi2的基因組序列進行比對分析(表1)。根據比對分析結果發現某些測序品種中Pi2基因組序列的外顯子區域存在1處有規律的連續3個堿基缺失。進一步根據稻瘟病抗性表型鑒定結果發現在Pi2基因組序列1543-1545位點處存在3個堿基(ACA)缺失的，該品種稻瘟病抗性表現為感病。而在該位點處不存在堿基缺失的，這類品種稻瘟病抗性表現為抗病(表1)。另外根據測序分析發現，與Pi2相鄰的基因LOC-Os06g17920，其基因組序列與Pi2非常相似，尤其在Pi2基因組序列1543-1545位點處附近，這兩個基因的基因組序列幾乎完全一樣。

表1不同水稻品種抗稻瘟病基因Pi2全基因組測序及SNP分型分析

因而根據抗稻瘟病基因Pi2在不同品種中測序比對分析，進一步結合抗性表型鑒定結果，發現在Pi2基因組序列1543-1545處，感稻瘟病品種存在3個堿基(ACA)的缺失，抗病品種則不存在堿基缺失。基于上述結果，我們在此處開發1個In-Del標記，Pi2-1；Pi2-1標記在抗病品種中擴增出1個片段長度為65bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)的單一條帶；在感病品種中擴增出2個片段條帶，一條為擴增LOC-Os06g17920基因組所具條帶，片段長度65bps；另一條為擴增Pi2基因組所具條帶，由于存在3個堿基缺失，因而片段長度為62bps(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。Pi2-1即為水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記。在水稻抗稻瘟病分子標記鑒定時，利用這個功能分子標記進行擴增，再進行標記基因型鑒定，凡是擴增出65bps單一條帶的，表明該品種不存在堿基缺失，Pi2基因功能正常，具有稻瘟病抗性。而擴增出2個片段條帶的(65bps和62bps)，則表明該品種Pi2基因存在3個堿基缺失，基因功能不正常，稻瘟病抗性較差。因此利用Pi2-1可將抗稻瘟病品種和稻瘟病抗性較差品種，快速高效區分。

實施例2新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標記在抗病水稻品種和感病水稻品種中的基因型分型檢測

(1)水稻材料：粵農絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，R227，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，長松粳；桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854。

(2)水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標記在不同水稻品種中基因型鑒定

利用上述針對水稻抗稻瘟病基因Pi2開發的功能分子標記對不同水稻品種進行PCR擴增(反應體系如下)，之后通過體積分數為8％的聚丙烯酰胺凝膠(凝膠配置方法如下)電泳分離，對標記在不同水稻品種中進行帶型顯色和基因型分型(顯色液配置方法如下)；之后結合各水稻品種抗稻瘟病表型鑒定結果，進而確定功能分子標記的實用性。

PCR反應體系：

8％聚丙烯酰胺凝膠配方:

聚丙烯酰胺凝膠顯色液配方(100ml)：

注：甲醛是臨用前現加，其他三個按相應量提前配好。

經上述檢測后結果分析發現，水稻品種：粵農絲苗，華占，嘉58，榮18B，抗豐B，R286，R227，長粒早粳2號，浙粳88，松粳9號，長粳香1號，長松粳表現基因型一致，標記Pi2-1，擴增片段長度均為單一條帶65bps(圖1，1-12)。抗稻瘟病表型鑒定結果顯示這些品種抗性為中抗水平，具有稻瘟病抗性(圖2，1-12)。然而水稻品種：桃1B，文香1號，岳恢9113，9311，玉香油占，9311B，R900，昌香恢1號，麗江新團黑谷，楊粳581，武育236，南粳5854基因型鑒定表明這些品種在標記Pi2-1的擴增片段長度均為兩條帶，一條65bps，另一條62bps(圖1，13-24)。抗稻瘟病表型鑒定結果表明這些品種稻瘟病抗性較差，均有不同程度的感病現象(圖2，13-24)。因而水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1，在不同水稻品種中基因型分型清晰明確，且不同基因型與抗稻瘟病表型能較好對應吻合，表明Pi2-1這個功能分子標記具有實用性。

實施例3、新的水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標記在R900/華占F₂群體中篩選新的水稻抗稻瘟病單株。

利用上述水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標記Pi2-1，在水稻抗稻瘟病品種華占和感稻瘟病品種R900構建的F2群體中，逐株檢測其基因型。同時在水稻孕穗期(幼穗分化3-5期)，采用混合水稻稻瘟病孢子接種，鑒定各單株稻瘟病穗莖瘟抗性表型。

分析結果表明，在檢測到的基因型表現為，標記Pi2-1擴增片段長度表現為單一條帶65bps，表現為抗病基因型的112個單株中，有104個具有抗稻瘟病表型。基因型與表型的吻合率達92.8％(圖3，圖4)；在檢測到的基因型表現為標記Pi2-1，擴增片段長度為兩條帶，一條，65bps，另一條，62bps，表現為感病基因型或雜合基因型的259個單株中，有91個具有感稻瘟病表型(圖3，圖4)。因而利用Pi2-1這個水稻抗稻瘟病基因Pi2功能分子標記，能從各分離群體中快速高效的篩選出基因型純合的具有稻瘟病抗性的單株和株系。

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國水稻研究所

<120> 一種水稻抗稻瘟病基因Pi2的功能分子標記Pi2-1及應用

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ttggattgga gcattattcg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcatgtgcta gactcttggg t 21

<210> 3

<211> 62

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg acagacccaa gagtctagca 60

catgc 65

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 抗稻瘟病基因

<400> 4

ttggattgga gcattattcg atcattagct atttttggtg gacccaagag tctagcacat 65

gc 62