Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷貝數的絕對定量檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷貝數的絕對定量檢測方法，通過Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的接種培養，再構建Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒標準品質粒，參照所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白區目的基因序列設計下列Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒熒光定量PCR特異性引物，利用所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒標準品質粒分別檢測病毒培養上清樣品或患者血清樣品的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒拷貝數。本發明是針對登革病毒前膜蛋白區域基因構建標準品質粒，建立Ⅱ型及Ⅲ型登革病毒熒光定量PCR絕對定量體系，該檢測體系的建立不僅可以對實驗體系中的病毒拷貝數進行絕對定量，更為重要的是可以對登革熱患者血清中的病毒拷貝數進行絕對定量。
【專利說明】II型、III型登革病毒基因拷貝數的絕對定量檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒診斷【技術領域】，具體涉及II型、III型登革病毒基因拷貝數的絕對 定量檢測方法。
【背景技術】
[0002] 登革病毒（Dengus virus，DENV)是以埃及伊蚊和白紋伊蚊等為傳播媒介的蟲媒病 毒，廣泛流行于全球100多個熱帶和亞熱帶國家及地區，能引起登革熱、登革出血熱，甚至 更為嚴重的登革休克綜合征。登革病毒顆粒大小約50nm，其染色體RNA為單股正鏈核糖核 酸，此病毒RNA共可以導引生成三個結構蛋白：核小蛋白，前膜（PrM)蛋白，外套膜蛋白，同 時也引導生成七個非結構蛋白：NSl，NS2A，NS2B，NS3, NS4A，NS4B，NS5。登革病毒屬于黃病毒 科，根據抗原性不同可將登革病毒分為I、II、III、IV四個血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、 DENV-4)，其中以II型登革病毒傳播最為廣泛。
[0003] 近年來，由于全球氣候變暖、人口流動頻繁等因素，登革熱的爆發和流行范圍有逐 年擴大和愈演愈烈之勢，其在全球的發病率提高了近30倍。在過去兩年中，在東南亞中部 和南部地區、美洲以及西太平洋地區，超過100個國家的25億人受到登革病毒的威脅，每年 約1億人感染登革病毒，約2. 2萬人死亡（主要是兒童）。2014年，僅中國廣東省累計報告 登革熱病例超過3. 87萬例。登革熱是過去50年間世界上最為嚴重的傳染病之一，已成為 嚴重的全球性公共衛生問題，不僅嚴重危害人類的健康，還為國家和個人帶來沉重的經濟 負擔。由于目前尚無可供使用的登革病毒疫苗用于預防，登革病毒的防控形式日趨嚴峻，因 此建立和完善登革熱分子流行病學診斷技術是一項迫在眉睫的任務。
[0004] 目前，對登革病毒的病原學檢測方法主要有血清學檢測（包括免疫層析、ELISA、 IgG/IgM抗體比率、IFA等），NSl抗原檢測以及實時熒光RT-PCR檢測等。其中，通常采用的 實時熒光RT-PCR檢測可以對登革病毒進行分型，且敏感性較好，可以初步進行相對定量。 但是該方法由于沒有設計病毒拷貝數的標準對照參比品以及拷貝數計算體系，因而對于病 毒絕對拷貝數的具體信息卻未能知曉。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種II型、III型登革病毒的熒光定量PCR絕對定量體系， 不僅可以對實驗體系中的病毒拷貝數進行絕對定量，更為重要的是在臨床應用中，不僅可 以快速斷定登革熱患者受到登革病毒感染，還可以對患者血清中的病毒拷貝數進行絕對定 量，從而對登革熱臨床治療效果的評價和患者的預后提供重要的參考依據。
[0006] 本發明通過下列技術方案實現：一種II型、III型登革病毒基因拷貝數的絕對定量 檢測方法，經過下列各步驟：
[0007] (I) II型、III型登革病毒的接種培養：按ImL病毒液/瓶的量，將濃度均為4. OMOI/ mL的II型登革病毒液、III型登革病毒液分別接種到生長致密、透明度好的白紋伊蚊C6/36 細胞上，于溫度為28±2°C、CO2體積濃度為5%的環境中，恒溫吸附1小時，于相同環境中， 補加病毒液9倍體積的下列病毒維持液：RPMI-1640培養基+2% (w/v)小牛血清+0. 12% (w/v)的碳酸氫鈉溶液（NaHCO3),培養至第5天，隨后于相同環境中，補加碳酸氫鈉溶液直 至碳酸氫鈉含量為〇. 12% (w/v)，培養至第8?9天，當白紋伊蚊C6/36細胞病變效應（CPE) 達++++時，收集細胞液，于4°C、3500 X g離心分離5min，收獲上清液，分別得II型、III型病毒 液；
[0008] (2)構建II型、III型登革病毒標準品質粒：
[0009] a?根據NCBI數據庫中II型和III型登革病毒標準株序列（GenBank:M29095. 1 ; NC_001475)，按下述設計特異性引物：
[0010] II型登革病毒前膜蛋白區域的PCR正、反向引物：
[0011] DENV-2For : 5'-AAAAAGGCGAGAAATACGCC-3'
[0012] DENV-2Rev : 5'-CACACAATTCACCAAGGTCCA-3'
[0013] III型登革病毒前膜蛋白區域的PCR正、反向引物：
[0014] DENV-3For :5'-ACAGTTTCGACTCGG-3'
[0015] DENV-3Rev :5'-CTTTCATTCTTCCCC-3' ；
[0016] b.按常規方法分別提取步驟（1)所得II型、III型病毒液中的登革病毒基因組RNA， 再用lU/iil的DNase于42°C下分別處理II型、III型登革病毒基因組RNA3min，以消化殘留 的DNA，收獲的II型、III型登革病毒基因組RNA通過RT-PCR的方法，利用步驟a的特異性引 物分別擴增II型、III型登革病毒前膜蛋白區域，分別得到對應的擴增產物，再將擴增產物分 別連接到PMD-18T simple克隆載體上，轉化DH5 a感受態細胞，挑單克隆進行測序鑒定，分 別獲得II型、III型登革病毒前膜蛋白區目的基因序列鑒定正確的陽性菌株；
[0017] c.將步驟b所得序列鑒定正確的陽性菌株分別進行常規培養，分別獲得II型、III 型登革病毒標準品質粒，并用紫外分光光度計分別測定II型、III型登革病毒標準品質粒的 濃度，再按下列公式計算標準品質粒的拷貝數：
[0018] Number of copies (copies / U I) = (Amount X 6. 022 X IO23)/ (LengthXlXlO9 X 650)
[0019] 其中，Amount為紫外分光光度計測得標準品質粒所測含量（ng/ii I) ,Length代表 模板DNA長度；
[0020] (3)參照步驟（2)b所得II型、III型登革病毒前膜蛋白區目的基因序列設計下列II 型、III型登革病毒熒光定量PCR特異性引物：
[0021] D2F : 5'-GCAGGGATACTGAAGAGATGGG-3'
[0022] D2R :5'-TGGTTCTCCGTTACGTGTGG-3'
[0023] D3F :5'-TGGATCACAGTTGGCGAAGA-3'
[0024] D3R :5'-CCCCCGACTTCTTGAAGGTT-3' ；
[0025] (4)利用步驟（2) c所得II型、III型登革病毒標準品質粒分別檢測病毒培養上清樣 品或患者血清樣品的II型、III型登革病毒拷貝數，具體檢測方法如下：
[0026] a.將步驟（2) c所得II型、III型登革病毒標準品質粒分別用雙蒸水按梯度稀釋至 10_9,按PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測標準品質粒擴增效率和特異性，通過 熒光定量PCR檢測直接獲得II型、III型登革病毒標準品質粒的擴增曲線與溶解曲線，同時 根據熒光定量PCR檢測所得標準品Ct值作為X軸，標準品拷貝數Iogltl作為Y軸分別繪制 II型、III型登革病毒標準品質粒的標準曲線，進而得到II型、III型登革病毒標準品質粒的標 準曲線方程：
[0027] 所述PCR反應體系如下：
[0028] 表1熒光定量PCR反應體系（反應總體積為20 ill)
【權利要求】
1. 一種II型、III型登革病毒基因拷貝數的絕對定量檢測方法，其特征在于經過下列各 步驟： (1) II型、III型登革病毒的接種培養：按ImL病毒液/瓶的量，將濃度均為4.OMOI/mL的 Π型登革病毒液、III型登革病毒液分別接種到生長致密、透明度好的白紋伊蚊C6/36細胞 上，于溫度為28±2°C、C02體積濃度為5%的環境中，恒溫吸附1小時，于相同環境中，補加病 毒液9倍體積的下列病毒維持液：RPMI-1640培養基+ 2%(w/v)小牛血清+ 0. 12%(w/v)的 碳酸氫鈉溶液，培養至第5天，隨后于相同環境中，補加碳酸氫鈉溶液直至碳酸氫鈉含量為 0. 12%(w/v)，培養至第8?9天，當白紋伊蚊C6/36細胞病變效應達++++時，收集細胞液， 于4°C、3500Xg離心分離5min，收獲上清液，分別得II型、III型病毒液； (2) 構建II型、III型登革病毒標準品質粒： a. 根據NCBI數據庫中II型和III型登革病毒標準株序列（GenBank:M29095.1; NC_001475)，按下述設計特異性引物： Π型登革病毒前膜蛋白區域的PCR正、反向引物： DENV-2For:5'-AAAAAGGCGAGAAATACGCC-3' DENV-2Rev:5'-CACACAATTCACCAAGGTCCA-3' III型登革病毒前膜蛋白區域的PCR正、反向引物： DENV-3For:5'-ACAGTTTCGACTCGG-3' DENV-3Rev:5'-CTTTCATTCTTCCCC-3' ； b. 按常規方法分別提取步驟（1)所得II型、III型病毒液中的登革病毒基因組RNA，再 用lU/μ1的DNase于42°C下分別處理II型、III型登革病毒基因組RNA3min，以消化殘留的 DNA，收獲的II型、III型登革病毒基因組RNA通過RT-PCR的方法，利用步驟a的特異性引物 分別擴增II型、III型登革病毒前膜蛋白區域，分別得到對應的擴增產物，再將擴增產物分別 連接到PMD-18Tsimple克隆載體上，轉化DH5a感受態細胞，挑單克隆進行測序鑒定，分別 獲得II型、III型登革病毒前膜蛋白區目的基因序列鑒定正確的陽性菌株； c. 將步驟b所得序列鑒定正確的陽性菌株分別進行常規培養，分別獲得II型、III型登 革病毒標準品質粒，并用紫外分光光度計分別測定II型、III型登革病毒標準品質粒的濃度， 再按下列公式計算標準品質粒的拷貝數： Numberofcopies(copies/μI) =(AmountX6. 022XIO23) /(LengthXIXIO9X650) 其中，Amount為紫外分光光度計測得標準品質粒所測含量（ng/μI)，Length代表模板 DNA長度； (3) 參照步驟（2)b所得II型、III型登革病毒前膜蛋白區目的基因序列設計下列II型、 III型登革病毒熒光定量PCR特異性引物： D2F:5'-GCAGGGATACTGAAGAGATGGG-3， D2R:5'-TGGTTCTCCGTTACGTGTGG-3' D3F:5'-TGGATCACAGTTGGCGAAGA-3' D3R:5'-CCCCCGACTTCTTGAAGGTT-3' ； (4) 利用步驟（2)c所得II型、III型登革病毒標準品質粒分別檢測病毒培養上清樣品或 患者血清樣品的II型、III型登革病毒拷貝數，具體檢測方法如下： a.將步驟（2)c所得II型、III型登革病毒標準品質粒分別用雙蒸水按梯度稀釋至ΚΓ9， 按PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測標準品質粒擴增效率和特異性，通過熒 光定量PCR檢測直接獲得II型、III型登革病毒標準品質粒的擴增曲線與溶解曲線，同時根 據熒光定量PCR檢測所得標準品Ct值作為X軸，標準品拷貝數Iogltl作為Y軸分別繪制II 型、III型登革病毒標準品質粒的標準曲線，進而得到II型、III型登革病毒標準品質粒的標準 曲線方程： 所述PCR反應體系如下： 表1熒光定量PCR反應體系(反應總體積為20μ1)
米用的反應程序如下：
b. 將待測的病毒培養上清樣品或患者血清樣品，根據需要分別用PBS緩沖液按梯度稀 釋至ΚΓ5,得到病毒培養上清樣品或患者血清樣品的梯度稀釋液； c. 按常規方法提取步驟b所得梯度稀釋液中的登革病毒基因組RNA，再用lU/μ1的 DNase于42°C處理病毒基因組RNA3min以消化殘留的DNA，按下列表2中的條件將病毒RNA 逆轉錄成cDNA: 表2逆轉錄反應體系：10μ1
逆轉錄反應程序采用：37°C下35min，隨后4°C下IOmin; d. 按步驟（4)a提供的PCR反應體系以SYBR法實時熒光定量PCR檢測步驟c逆轉錄 反應后的cDNA，分別根據步驟（4)a利用標準品質粒得到標準曲線和標準曲線方程，進而獲 得病毒上清樣品或患者血清樣品中登革病毒的拷貝數。
2. 根據權利要求1所述的絕對定量檢測方法，其特征在于：所述步驟（I)II型登革病毒 液是含有4.OMOI/mLII型登革病毒D0109株的病毒液。
3. 根據權利要求1所述的絕對定量檢測方法，其特征在于：所述步驟（I)III型登革病毒 液是含有4.OMOI/mLIII型登革病毒D9964株的病毒液。
4. 根據權利要求1所述的絕對定量檢測方法，其特征在于：所述步驟（4)a中用雙蒸水 按梯度稀釋至KT9是指將II型、III型登革病毒標準品質粒分別用雙蒸水稀釋成以下梯度： ΚΓ1、ΚΓ2、10' 1(Γ4、ΚΓ5、10' 10' 1(Γ8、10Λ
5. 根據權利要求1所述的絕對定量檢測方法，其特征在于：所述步驟（4)b中用PBS緩 沖液按梯度稀釋至KT5是指將待測的病毒培養上清樣品或患者血清樣品用PBS緩沖液稀釋 成以下梯度do'io'io'io'io'
【文檔編號】C12Q1/70GK104450971SQ201410827117
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】孫強明, 黃新偉, 席玨敏, 趙玉嬌, 潘玥, 陳俊英, 王曉丹, 李多, 邱麗娟, 姜黎明 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所