一種全自動細胞計數器的制造方法
【專利摘要】本實用新型涉及一種細胞計數器，尤其是涉及一種全自動細胞計數器。包括點光源、設置在點光源下方的凸透鏡、設置在凸透鏡下方用于放置待測細胞懸液的計數片、設置在計數片下方的調焦物鏡、設置在調焦物鏡下方的濾光片、以及設置在濾光片下方用于將感光芯片所獲取的光信號轉換為電信號后用于分析的分析系統。因此，本實用新型具有如下優點：可以自動識別非染色細胞，也可以自動識別染色細胞；本實用新型使用圖像識別的方法，避免了電阻抗計數法準確度低、應用范圍窄、需要經常校正的缺點；經本實用新型計數的細胞可進行再培養（擴增），保證了科研的連續性。
【專利說明】—種全自動細胞計數器
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種細胞計數器，尤其是涉及一種全自動細胞計數器。
【背景技術】
[0002]由于細胞在培養時必須保持一定的密度才能有較好的活性，因此在細胞的復蘇、培養、凍存過程中均需要根據實際情況多次進行細胞計數；細胞治療臨床應用中需要不同的細胞濃度，故需要細胞計數。
[0003]目前常用的方法包括圖像識別法和電阻抗計數法。
[0004](一)圖像識別法原理是:將細胞懸液經胎盤藍染色后，加入玻璃的血細胞計數板，經顯微放大光路將細胞圖像放大，活細胞中心區域透亮周圍有一圈藍色，呈現為一透亮的圓環狀；死細胞的圖像為藍色斑點(能與背景顏色區別開)。人工計數時，需要操作者在顯微鏡下逐個數出活細胞和死細胞的總數，推算出死細胞和活細胞的濃度；自動計數時，儀器應用特制的計算機圖像識別軟件通過圖形抓取，分析圖像的圓度、直徑、顏色灰度等參數，能全自動計算出計數板中活細胞濃度(數量/毫升)、死細胞濃度(數量/毫升)、細胞總數(含死細胞和活細胞)值，活細胞比例等數據，并能存儲到儀器內或通過U盤等轉移到其他計算機存儲介質。
[0005](二)目前圖像識別法的缺點:
[0006]1、此類方法中常用的染料均為核染料，對活細胞有一定的毒性；
[0007]2、只能實現離線計數，細胞必須脫離培養體系方能計數，不能實現實時在線計數(不脫離培養體系);
[0008]3、對于胚胎干細胞等需要后續培養增值的細胞計數后不能再使用的。
[0009]4、無法判斷具有內吞功能細胞的活性及數量，以及處于細胞凋亡過程中后期的細胞(此時細胞已經進入不可逆的死亡程序，但仍拒染臺盼藍)。
[0010]基于以上幾點，傳統的經染色再進行圖像識別的細胞計數法存在較大的局限性。
[0011](三)電阻抗計數法:以檢測電解質溶液中懸浮的細胞在通過計數通道時引起的電阻變化為基礎，進行細胞計數和體積的測定，這種方法稱為電阻抗法，也稱為庫爾特原理。
[0012](四)電阻抗法缺點:
[0013]1、由于電阻抗法中的小孔管的內徑僅有25 μ m，因此目前采用電阻抗的儀器均無法對直徑大于25 μ m的細胞(比如人類的卵細胞直徑達100 μ m)進行計數。
[0014]2、細胞碎片形成的團塊、稀釋液中的雜質團塊以及雙聯體細胞均會影響細胞計數的準確性。
[0015]3、細胞的計數信號和干擾信號在放大過程中同時被放大，極大的影響了結果的可靠性。
[0016]4、為了使儀器能準確甄別細胞，儀器需要進行經常性的質控，重設定閾值。
[0017]5、檢測電場的存在對細胞的活性以及再培養也會產生不良影響。實用新型內容
[0018]本實用新型主要是解決現有技術所存在的技術問題；提供了一種可以自動識別非染色細胞，也可以自動識別染色細胞。克服了傳統圖像識別法需要染色的缺點的一種全自動細胞計數器；
[0019]本實用新型其次是解決現有技術所存在的技術問題；提供了一種使用圖像識別的方法，避免了電阻抗計數法準確度低、應用范圍窄、需要經常校正的缺點；經本實用新型計數的細胞可進行再培養(擴增)，保證了科研的連續性的一種全自動細胞計數器。
[0020]本實用新型的上述技術問題主要是通過下述技術方案得以解決的:
[0021]一種全自動細胞計數器，其特征在于，包括點光源、設置在點光源下方的凸透鏡、設置在凸透鏡下方用于放置待測細胞懸液的的計數片、設置在計數片下方的調焦物鏡、設置在調焦物鏡下方的濾光片、以及設置在濾光片下方用于將濾光片所獲取的光信號轉換為電信號后用于分析的分析系統。最終實現不需要染色(非染色)時準確判斷死細胞或活細胞狀態以及計數功能。
[0022]在上述的一種全自動細胞計數器，所述分析系統包括位于濾光片下方用于接收光信號并將光信號轉換為電信號的感光芯片，一個控制器，一個連接控制器和感光芯片的數據線以及與控制器連接的顯示器。
[0023]在上述的一種全自動細胞計數器，所述感光芯片采用鎂光公司MT9T001芯片；所述控制器為計算機。
[0024]因此，本實用新型具有如下優點:可以自動識別非染色細胞，也可以自動識別染色細胞；本實用新型使用圖像識別的方法，避免了電阻抗計數法準確度低、應用范圍窄、需要經常校正的缺點；經本實用新型計數的細胞可進行再培養(擴增)，保證了科研的連續性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]附圖1是本實用新型的一種結構原理示意圖。
【具體實施方式】
[0026]下面通過實施例，并結合附圖，對本實用新型的技術方案作進一步具體的說明。
[0027]實施例:
[0028]首先，介紹本實用新型的結構本實用新型包括點光源1、設置在點光源I下方的凸透鏡2、設置在凸透鏡2下方用于放置待測細胞懸液的的計數片3、設置在計數片3下方的調焦物鏡4、設置在調焦物鏡4下方的濾光片5、以及設置在濾光片5下方用于將濾光片5所獲取的光信號轉換為電信號后用于分析的分析系統。
[0029]分析系統包括位于濾光片5下方用于接收光信號并將光信號轉換為電信號的感光芯片6，一個控制器8，一個連接控制器8和感光芯片6的數據線7以及與控制器8連接的顯不器10。
[0030]使用時，首先用移液器取待測細胞懸液10ul，不用染色，直接加入3計數片中并插入儀器；
[0031]打開感光芯片(圖1第6)的參數設置；
[0032]先做白平衡，記錄白平衡后的所有參數值:R (紅光增益)、G (綠光增益)、B (藍光增益)、伽馬值、對比度、自動色彩增益、自動曝光值等，將這些參數值作為基本值(以下簡稱基本值);
[0033]降低RG(紅綠)的增益，降為基本值的1/3至2/3之間。即降低了感光芯片(圖1第6)對RG(紅綠)光強的接收能力(儀器已經調至最佳值并設為默認值)；
[0034]增大B (藍)的增益，增大為基本值的I至2倍。即增強了感光芯片(圖1第6)對B (藍)光強的接收能力(儀器已經調至最佳值并設為默認值)；
[0035]此時10顯示器背景為淺藍色:點光源(圖1第I)發出的光經凸透鏡(圖1第2)、計數片(圖1第3)、調焦物鏡(圖1第4)、濾色片(圖1第5)、感光芯片(圖1第6)將光信號轉換成電信號，并經數據線(圖1第7)傳輸到控制器(圖1第8)，最終在顯示器(圖1第10)上顯示的背景為淺藍色(儀器已經調至最佳值并設為默認值)。
[0036]儀器光路中的濾光片(圖1第5)阻止了 RG (紅綠)光的干擾，只允許B (藍)光通過，這時活細胞反射的B(藍)光強大于死細胞反射的B(藍)光強；
[0037]關掉自動曝光功能，手動調節曝光時間和曝光增益，不同種類和廠家生產的感光芯片(圖1第6)需要調節的范圍不同，以能將死細胞圖像與背景明顯區分開為準(儀器已經調至最佳值并設為默認值)。具體調節方法:活細胞反射的B (藍)光因強度大，首先在感光芯片(圖1第6)上成像，顯示器(圖1第10)能逐漸看到圓形藍斑(比背景顏色深)；繼續增加曝光時間，先出現的圓形藍斑(比背景顏色深)變為圓形亮斑(因為曝光時間過長，出現過曝現象)，同時會有新的圓形藍斑(比背景顏色深)出現。此時，顯示器(圖1第10)的背景是淺藍色，圓形亮斑是活細胞的圖像，而圓形藍斑(比背景藍色深)就是死細胞的圖像。通過非染色細胞圖像識別軟件分析(圖1第9)，區分死細胞和活細胞的數量、濃度、直徑、面積、比率等。
[0038]該實用新型儀器經改造可實現非染色在線細胞計數。
[0039]下面是對比試驗。
[0040]使用移液器分別取細胞懸液50ul，加入A管和B管；將B管加入50ul胎盤藍(0.4%)后混勻；
[0041]從A管取1ul加入計數片的“I”位，更換新的移液頭后從B管取1ul加入計數片的“2”位。
[0042]將計數片插入儀器中。
[0043]使用“非染”功能計數“ I”位。
[0044]使用“染色”功能計數“2”位。
[0045]兩種方法計數結果誤差在5%之內，通過進一步優化圖像識別軟件，可同時提高兩種方法的準確性。
[0046]在本實施例中，控制器即計算機為公知技術，在本實用新型中不是重點，被實用新型主要保護光學系統的硬件結構。
[0047]本文中所描述的具體實施例僅僅是對本實用新型精神作舉例說明。本實用新型所屬【技術領域】的技術人員可以對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，但并不會偏離本實用新型的精神或者超越所附權利要求書所定義的范圍。
【權利要求】
1.一種全自動細胞計數器，其特征在于，包括點光源、設置在點光源下方的凸透鏡、設置在凸透鏡下方用于放置待測細胞懸液的的計數片、設置在計數片下方的調焦物鏡、設置在調焦物鏡下方的濾光片、以及設置在濾光片下方用于將感光芯片所獲取的光信號轉換為電信號后用于分析的分析系統； 所述分析系統包括位于濾光片下方用于接收光信號并將光信號轉換為電信號的感光芯片，一個控制器，一個連接控制器和感光芯片的數據線以及與控制器連接的顯示器。
【文檔編號】C12M1/34GK204058472SQ201420129546
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】姬廣聚, 袁增強, 秘曉林, 朱耀輝 申請人:姬廣聚, 袁增強, 秘曉林, 朱耀輝