本發明屬于食品蛋白改性回收技術領域，本發明涉及一種復合酶聚合偶聯超濾提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率同時降低膜污染的方法。該方法同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率。
背景技術：
乳清是干酪生產的副產物，隨著我國干酪產業的迅速發展，干酪乳清產量巨大，干酪乳清中含有牛乳干物質重量的一半，乳清中蛋白質的含量為0.6%~1%。目前工業中乳清蛋白的回收主要采用超濾技術，替代傳統的加熱沉淀、酸堿沉淀、化學試劑(如聚丙烯和三氯乙酸)沉淀等方式，并通過滲濾降低乳糖在乳清蛋白中的截留，同時降低膜污染，然而，上述方法存在乳清蛋白回收率低，蛋白品質性能不突出，并且滲濾工藝會消耗大量的純水，純水的大量消耗給整個后續的水處理工作帶來巨大負擔，同時長時間操作使得膜通量下降，膜被嚴重污染，膜使用壽命縮短，最終帶來的生產成本的增加是目前限制超濾回收乳清蛋白廣泛商業化推廣的瓶頸問題，如何提高乳清蛋白的回收率，減緩膜污染仍然是目前乳清蛋白膜回收利用領域研究的熱點。MPC透析液的蛋白回收也一直是食品領域工作者困擾的問題。
回收利用領域研究的熱點。MPC透析液的蛋白回收也一直是食品領域工作者困擾的問題。
提高超濾回收乳清蛋白效率，降低膜污染正受到全球的廣泛關注，目前大多數都是通過單一的超濾技術實現乳清蛋白的回收，最終獲得乳清粉，關注膜污染問題，但并沒有發現有效的解決辦法。關于酶催化乳清蛋白聚合也有相關研究；CN104672919A公開了一種利用熱穩定性重組漆酶制備乳清蛋白膜的方法，通過添加重組熱穩定性的漆酶作為交聯劑制備性能良好的乳清蛋白膜綠色可食用。CN104782878A公開了一種酶法改性乳清蛋白可溶性聚合物的制備方法，采用轉谷氨酰胺酶聚合乳清，生產具有較高凝膠性的乳清蛋白聚合物；但以上都是采用蛋白聚合酶催化乳清蛋白生產功能性產品，通過復合酶聚合偶聯超濾提高乳清蛋白回收率同時降低膜污染的有針對性的方法專利及專利申請到目前還沒有。經過前期查新，浙江大學孟祥河（申請號200910095653）公開過一種膜分離回收豆腐黃漿水中的蛋白質處理方法，采用轉谷氨酰胺酶聚合后進行超濾獲得乳清蛋白，但原料來源差異大，雖然都屬于蛋白，都具有蛋白的基本結構和性質，但是大豆蛋白與牛奶蛋白在組成及蛋白空間結構上都存在較大差異，另外，單一酶及常規操作得到的蛋白質量及回收率都有待于進一步提高。還有哈爾濱商業大學韓春然也是從大豆乳清蛋白中利用轉谷氨酰胺酶獲得蛋白粉，其目的僅是提高回收率。對于復合酶改性乳清蛋白制備，申請號2016103084510采用胰蛋白酶等和谷氨酰胺轉氨酶聯合制備得到功能特性突出的乳清蛋白質，但該技術并沒針對蛋白回收率、膜污染等角度展開研究，解決相應技術問題。
將多種技術與膜技術的組合應用來解決單一膜技術的局限性同時生產高附加值的產品的研究已經成為膜技術研究領域一個新的方向。如何獲得一種工藝簡單、易于操作、不產生污染物、提高產品性能、并且能夠同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率的方法是本領域急需解決的技術問題。
技術實現要素：
發明目的：提供一種能夠同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率的方法。同時也提供一種高品質乳清蛋白，增加產品附加值，提高企業的經濟效益。
技術問題：本發明同時解決了現有技術中存在的乳清蛋白回收率低、膜污染得不到有效解決、乳糖截留率高、乳清蛋白功能性不突出的技術問題。
技術方案：一種復合酶聚合偶聯超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白的方法，該方法同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率，按照以下步驟進行：
（1）原料準備：
取40ml干酪乳清或MPC透析液，可以于4 °C冷藏備用；其中MPC為牛乳超濾濃縮蛋白，MPC透析液為牛乳超濾透過液。
（2）復合酶聚合：
取40ml干酪乳清或MPC透析液放入絲口瓶中，用氫氧化鈉和/或鹽酸將干酪乳清或MPC透析液的pH值調至4.5-6.0，加入漆酶120 U和5 mol/l的 阿魏酸3-5ml，然后將裝有混合溶液的絲口瓶置于恒溫水浴鍋中，于35-45 °C反應1 -2h，滅酶，之后再次調節溶液pH值調至6.5-8.0，加入轉谷氨酰胺酶160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于35-45 °C反應1 -2h，滅酶，得含有蛋白聚合物的乳清溶液；冷卻至10°C以下；
（3）超濾：使用截留分量10kDa的超濾膜；優選PES聚醚砜超濾膜，采用死端過濾的方式，跨膜壓力0.15MPa;
（4）指標測定：蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率的測定。
其中優選漆酶反應1-2h后，采用不滅酶替換滅酶，直接調節溶液pH值調至4.5-6.0；其中所述漆酶來源于真菌。
進一步優選在執行復合酶聚合前，采用階段式預處理，第一階段：先以5°C/ min的速率上升溫度至60-65°C、保溫20min；第二階段：再以5°C/ min的速率上升溫度至75-80°C、保溫10min。
具體優選步驟（2）復合酶聚合中，取40ml干酪乳清或MPC透析液放入絲口瓶中，用0.2N氫氧化鈉和/或0.2N鹽酸將干酪乳清或MPC透析液的pH值調至5.0，加入漆酶120 U和5 mol/l的 阿魏酸3-5ml，然后將裝有混合溶液的絲口瓶置于恒溫水浴鍋中，于37-40°C反應1-2h，滅酶，之后再次調節溶液pH值調至8.0，加入轉谷氨酰胺酶160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37-40°C反應1 -2h，滅酶，得含有蛋白聚合物的乳清溶液；冷卻至10°C以下。
優選轉谷氨酰胺酶的活性為800U/g，漆酶活性為600U/g。DTT為二硫蘇糖醇。
還提供一種致敏性低、乳化性、起泡性等性能均提高的乳清蛋白。
技術效果：
（1）本發明提供了一種同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類物質回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率的方法，并且該方法同時適用于干酪乳清與MPC透析液，一法雙用為領域做出了貢獻。具體創新地針對干酪乳清蛋白或MPC中蛋白類成分采用特定的復合酶聚合偶聯超濾的技術手段，在一定條件下先采用漆酶催化再采用轉谷氨酰胺酶進行催化（二者順序不可調換），超濾過程中相對膜通量以及蛋白回收率明顯提高，膜總阻力和膜孔阻力增加，膜餅層阻力降低。尤其采用PES膜并通過死端過濾對乳清蛋白或MPC中蛋白類物質進行回收，蛋白粒徑增加，Zeta 電位值增加，膜總阻力Rt降低，膜污染降低，可以延長膜操作時間，降低膜清洗頻次，大大提高超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白成分效率。相對于單一酶以及現有技術中復合酶處理的樣品，乳清蛋白或MPC中蛋白成分的膜回收效率和純度明顯提高，膜通量提高30%~40%，乳清蛋白或MPC中蛋白成分截留率和回收率提高20%左右，乳糖的截留率降低10%左右。現有技術中目前尚未有上述同時解決各問題的方法。
（2）在課題研究過程中意外發現，在執行復合酶聚合前，采用階段式預處理，第一階段：先以5°C/ min的速率上升溫度至60°C、保溫20min；第二階段：再以5°C/ min的速率上升溫度至85°C、保溫15min，取得了未曾預期的技術效果，正是上述的預處理與兩種酶的協同增效作用的有效結合，使得干酪乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、純度及品質大大提高，膜污染問題的有效解決，又明顯邁上了一個新臺階。這可能是由于在溫度不斷變化以及保溫的過程中，緩慢的加熱使蛋白質多肽鏈有足夠的時間展開，又由于乳中內源酶類的作用，第一階段主要呈現乳清蛋白或MPC中蛋白類成分發生輕度水解，第二階段在更高的溫度下呈現“預凝膠化”，蛋白質分子多肽鏈展開，展開的多肽鏈在溶液中發生凝聚，凝聚的程度恰好控制在低于形成凝膠的最小臨界水平，形成可溶性的微凝聚物，更利于后續復合酶聚合以及超濾，為后續打下了良好的基礎，同時上述預處理過程也起到滅菌和防止微生物污染的作用，這是個微觀而復雜的體系。實踐也證明，并不是聚集體尺寸越大效果越好，因為在超濾的過程中較大顆粒的蛋白會在膜表面快速沉積形成餅層，導致膜通量迅速下降，降低生產效率，膜污染增強，因此只有在一定的條件下產生一定大小的聚集體才可以達到理想效果。所以恰是階段式預處理與酶聚合的結合，使得聚合體粒子大小呈現極為理想的狀態。并不是當所有蛋白全部聚合后，膜過濾過程中膜總阻力都會降低，有的膜阻力反而增加，使過濾更加困難，這是聚合不理想會導致餅層阻力(Rc)很快形成，然而，漆酶+TG催化乳清的膜孔阻塞顯著低于其它單一酶或復合酶，餅層阻力阻低于其他樣品組。通過酶法適當的聚合乳清中的蛋白可以提高膜通量，降低膜阻力，但并不意味中全部蛋白聚合后過濾效果提高，只有適當的聚合才能同時提高蛋白回收率和膜通量，降低乳糖截留率，延長膜操作時間。
（3）本發明克服常規中酶解后需滅酶活的技術偏見，獨創性的在漆酶反應1 -2h后，采用不滅酶替換滅酶方式，使得酶聚合產生更好效果。本發明在轉谷氨酰胺酶進行催化的過程中，殘留微弱的漆酶活性有效增強轉谷氨酰胺酶的聚合。漆酶是一種含銅金屬酶類，能夠起到蛋白交聯作用，是由于它能催化蛋白質中的酪氨酸殘基以及與蛋白質通過非肽鍵相連的酚類化合物的氧化來實現。更好效果產生可能是由于漆酶的在聚合的同時，也讓更多的賴氨酸上的氨基和谷氨酸上的羥酰基暴露出來，在谷氨酰胺酶作用下進一步聚合。復合酶催化順序不同，對乳清蛋白或MPC中蛋白類物質的聚合效果不同，主要是由于一種酶催化結束后會對溶液中蛋白的空間結構產生影響，進而影響另一種酶的催化效果，另外溶液中不同酶的活性會相互影響，以及每種酶催化的輔助因子不同，添加的先后順序也會導致不同的催化結果。
（4）本發明經過蛋白聚合酶催化聚合后的乳清蛋白或MPC中蛋白成分可以提高乳清蛋白或MPC中蛋白成分的功能特性，例如乳化性、起泡性、成膠性都明顯改善。更多的過敏原β-乳球蛋白被聚合，大大降低其含量；本發明乳清蛋白或MPC中蛋白成分在過敏原性方面，β-乳球蛋白過敏原性降低了50％，無苦味。這結果表明開發的乳清蛋白或MPC中蛋白類物質可用于嬰幼兒食品，也可用于開發新蛋白食品，如各種人造肉、仿蟹肉、脂肪替代品等，以及可食用薄膜，膠棒。無論是在食品領域還是在化工領域都具有廣泛的應用前景。
（5）本發明所獲得的目標產品是各工序及參數相輔相成、共同協同作用的結果，減少工序，降低了成本，產生了預料不到的技術效果。
本發明制備的乳清蛋白粉的各項指標均符合乳清蛋白國家標準 GB11674-2010中理化標準。
效果試驗：
指標的測定及計算方式
膜通量測定：膜通量是反應膜污染情況的重要指標。
相對膜通量= J/J0。
膜通量變化采用方程：J=V/A*Δt
其中：J：膜通量；V：透過液體積ml；A：有效膜面積(cm2)；Δt：時間變化(min)，J0為水通量。
蛋白回收率= (1-C截留/C原液) ×100%
蛋白截留率 = (1-C透過/C原液) ×100%
C截留，C透過和C原液分別代表截流液，透過液和原液蛋白濃度。
乳糖截流率 = (1-C透過液/C原液) ×100%
C透過液和C原液分別代表透過液和原液乳糖濃度。
濃縮因子 (VCF)
Vi 初始體積，Vp 透過液體積。
在此需要說明的是，上述各指標的測定方法或計算方法也可以采用本領域常用的其它方法或計算方法。
試驗1：
A組：采用本申請實施例1的方案，但步驟（2）替換為單獨采用轉谷氨酰胺酶，即添加160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37 °C反應1-2h，然后滅酶。
B組：使用復合酶，順序采用漆酶和轉谷氨酰胺酶，即具體采用本申請實施例1的方案。
C組：采用本申請實施例2的方案，但步驟（2）替換為單獨采用轉谷氨酰胺酶，即添加160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37 °C反應1 -2h，然后滅酶。
D組：使用復合酶，順序采用漆酶和轉谷氨酰胺酶，具體采用本申請實施例2的方案。
E組：現有技術中復合酶處理，具體采用申請號2016103084510 中的權利要求1的技術方案，其中蛋白酶選用胰蛋白酶。
本發明進行了對比試驗，測定了蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率等指標；結果見表1 （a，b，c，d表示各組的差異性顯著情況（P<0.05），平行3次）。
表1
結果顯示：先采用漆酶催化再采用轉谷氨酰胺酶進行催化，超濾過程中相對膜通量以及蛋白回收率明顯提高，乳糖截留率明顯降低。相對于單一酶以及現有技術中復合酶處理的樣品，乳清蛋白或MPC中蛋白成分的膜回收效率和純度明顯提高，膜通量提高30%~40%或更高。乳清蛋白或MPC中蛋白成分回收率提高20%左右或更高。乳糖的截留率降低10%左右或更高，三個指標同時達到理想效果是很難預料的。同時也進一步表明，在執行復合酶聚合前，采用階段式預處理，第一階段：先以5°C / min的速率上升溫度至60°C、保溫20min；第二階段：再以5°C/ min的速率上升溫度至85°C、保溫15min，取得了更好的效果。后續課題組將進一步對預處理后的容易結構及成分進行研究和分析。
試驗2：漆酶滅酶前后的對比試驗：
第1組：
在漆酶反應1 -2h后進行100°C、5分鐘的滅酶處理，其它均采用實施例1的技術方案；
第2組：
在漆酶反應1-2h后，不進行滅酶，緊接著順序處理，其它均采用實施例1的技術方案。
第3組：
采用實施例2的技術方案；
第4組：
采用實施例3的技術方案。
進行了對比試驗，測定了蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率等指標；
結果見表2（a，b，c，d表示各組的差異性顯著情況（P<0.05），平行3次）。
表2
從結果可以看出，獨創性的在漆酶反應1 -2h后，采用不滅酶替換滅酶方式，使得酶聚合產生更好效果，尤其膜通量有了很大的提升。
試驗:3：
選擇兩種蛋白聚合酶復合使用，分別先進行漆酶，酪氨酸酶，過氧化物酶催化然后再分別加入轉谷氨酰胺酶進行催化，同時考察了先進行轉谷氨酰胺酶催化再進行漆酶，酪氨酸酶和過氧化物酶催化。漆酶聚合蛋白+阿魏酸+TG+DTT，酪氨酸酶聚合蛋白+咖啡酸+TG+DTT，過氧化物酶聚合蛋白+H2O2+TG+DTT，TG酶+DTT+阿魏酸+漆酶 7 TG+DTT+咖啡酸+酪氨酸酶和TG+DTT+過氧化氫+過氧化物酶。SDS-PAGE結果表明漆酶+TG的低分子量條帶明顯降低，并通過凝膠滲透色譜進一步確定該效果最好。
具體實施方式
實施例1：一種復合酶聚合偶聯超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白的方法，該方法同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率，按照以下步驟進行：
（1）原料準備：
取40ml干酪乳清或MPC透析液，可以于4 °C冷藏備用；
（2）復合酶聚合：
取40ml干酪乳清或MPC透析液放入絲口瓶中，用0.2N氫氧化鈉和/或0.2N鹽酸將干酪乳清或MPC透析液的pH值調至5.0，加入漆酶120 U和5 mol/l的 阿魏酸3-5ml，然后將裝有混合溶液的絲口瓶置于恒溫水浴鍋中，于37°C反應1 -2h，滅酶，之后再次調節溶液pH值調至8.0，加入轉谷氨酰胺酶160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37°C反應1 -2h，滅酶，得含有蛋白聚合物的乳清溶液；冷卻至10°C以下。轉谷氨酰胺酶的活性為800U/g，漆酶活性為600U/g。
（3）超濾：使用截留分量10kDa的超濾膜；優選PES聚醚砜超濾膜，采用死端過濾的方式，跨膜壓力0.15MPa;
（4）指標測定：蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率的測定。
實施例2：一種復合酶聚合偶聯超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白的方法，該方法同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率，按照以下步驟進行：
（1）原料準備：
取40ml干酪乳清或MPC透析液，可以于4 °C冷藏備用；
（2）兩段預處理：第一階段：先以5°C/ min的速率上升溫度至60-65°C、保溫20min；第二階段：再以5°C/ min的速率上升溫度至75-80°C、保溫10min；
（3）復合酶聚合：
取40ml干酪乳清或MPC透析液放入絲口瓶中，用0.2N氫氧化鈉和/或0.2N鹽酸將干酪乳清或MPC透析液的pH值調至5.0，加入漆酶120 U和5 mol/l的 阿魏酸3-5ml，然后將裝有混合溶液的絲口瓶置于恒溫水浴鍋中，于37°C反應1-2h，滅酶，之后再次調節溶液pH值調至8.0，加入轉谷氨酰胺酶160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37°C反應1-2h，滅酶，得含有蛋白聚合物的乳清溶液；冷卻至10°C以下。轉谷氨酰胺酶的活性為800U/g，漆酶活性為600U/g。
（4）超濾：使用截留分量10kDa的超濾膜；優選PES聚醚砜超濾膜，采用死端過濾的方式，跨膜壓力0.15MPa;
（5）指標測定：蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率的測定。
實施例3：采用不滅酶的方式。
一種復合酶聚合偶聯超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白的方法，該方法同時提高乳清蛋白或MPC中蛋白類成分回收率、提高膜通量、降低乳糖截留率，按照以下步驟進行：
（1）原料準備：
取40ml干酪乳清或MPC透析液，可以于4 °C冷藏備用；
（2）兩段預處理：第一階段：先以5°C/ min的速率上升溫度至60-65°C、保溫20min；第二階段：再以5°C/ min的速率上升溫度至75-80°C、保溫10min；
（3）復合酶聚合：
取40ml干酪乳清或MPC透析液放入絲口瓶中，用0.2N氫氧化鈉和/或0.2N鹽酸將干酪乳清或MPC透析液的pH值調至5.0，加入漆酶120 U和5 mol/l的 阿魏酸3-5ml，然后將裝有混合溶液的絲口瓶置于恒溫水浴鍋中，于37°C反應1 -2h，不滅酶，直接調節溶液pH值調至8.0，加入轉谷氨酰胺酶160U和20mM DTT 3-5ml，繼續于37°C反應1 -2h，滅酶，得含有蛋白聚合物的乳清溶液；冷卻至10°C以下。轉谷氨酰胺酶的活性為800U/g，漆酶活性為600U/g。
（4）超濾：使用截留分量10kDa的超濾膜；優選PES聚醚砜超濾膜，采用死端過濾的方式，跨膜壓力0.15MPa;
（5）指標測定：蛋白回收率、膜通量、乳糖截留率的測定。
本發明源于課題項目的研究，我們做了大量的試驗，也獲得了大量的效果數據，基于篇幅受限，在此選擇有代表性的數據進行說明。本發明蛋白粒徑增加，Zeta 電位值增加，膜總阻力Rt降低，膜污染降低，延長膜操作時間，降低膜清洗頻次，大大提高超濾回收乳清蛋白或MPC中蛋白類物質效率。蛋白質的乳化性、起泡性、成膠性都明顯改善，也大大可以降低β-乳球蛋白的致敏性。