一種發酵蟲草菌絲體粉及其制備方法與流程

文檔序號：11392095閱讀：566來源：國知局

本發明涉及一種發酵蟲草菌絲體粉、其制備方法及其在制備增強免疫功能制劑中的應用。

背景技術：

冬蟲夏草是我國傳統名貴的強壯滋補藥材，由于天然蟲草有其嚴格的寄生性及特殊的生長環境，加之近年來生態環境的嚴重破壞，天然蟲草資源銳減，價格猛漲。隨著人民生活水平的不斷提高，對蟲草的需求量正日益增大，因此，人工培養蟲草菌絲體替代天然蟲草成為當務之急。現代科學研究表明，蟲草菌絲體中富含蟲草酸、蟲草素、sod酶、蟲草多糖等功效成分，其含量基本與天然冬蟲夏草相同，蟲草菌絲體同樣具有提高人體免疫力、抗疲勞、預防心腦血管疾病及抗腫瘤等多種促進人體健康的功能，產品保健功效顯著，是天然冬蟲夏草理想的替代品，有廣闊的發展前景。

鈣元素是人體中含量最多的無機鹽，占人體體重的2％，具有多種重要的生理功能，享有“生命元素”之稱。鎂是人體必需的重要元素之一，體內鎂的總量約為21-28g。鎂元素在調節免疫系統方面起重要作用：參與免疫球蛋白的合成、參與激活補體、調節吞噬細胞的吞噬功能、調節t淋巴細胞的成熟和功能，低鎂可致血免疫球蛋白降低。鐵是人體含量最多的必需微量元素，人體總含量為3-5克。在人體所必需的十多種微量元素中，鐵無論在重要性上還是在數量上都居首位，堪稱“微量元素中的老大”。鋅是人體不可缺少的微量元素之一，人體內含鋅量約為2-3g。鋅元素參與體內多種生理活動，具有重要的生理功能：其能直接作用于脾臟、扁桃體及胸腺等免疫器官，并作用于多種免疫物質與免疫細胞，促進生長，提高機體免疫力；維持機體的正常生長發育；維持正常的味覺功能及食欲；促進正常的性發育等。

蟲草酸、蟲草素、sod酶是蟲草菌絲體本身含有的特征性功效成分。國內外目前關于富含鈣、鎂、鐵、鋅的蟲草菌絲體產品及其制備方法幾乎沒有。本發明在專利申請號為201310124056.3的“一種蟲草菌絲體及制備方法”的基礎上進行了研究、改進，在未增加工藝復雜性、投入成本更低的情況下，得到了鈣、鎂、鐵、鋅、蟲草酸、蟲草素、sod酶含量更高的蟲草菌絲體粉，產品的保健功能更強。

技術實現要素：

本發明的目的之一在于提供一種新的發酵蟲草菌絲體粉及其制備方法，所述產品較現有技術生產出的蟲草菌絲體粉含有更高的鈣、鎂、鐵、鋅等元素，并且蟲草酸、蟲草素、sod酶等特征性功效成分含量更高，且不增加工藝的復雜性，投入成本更低；

本發明的另一目的在于提供一種在制備增強免疫功能制劑中具有更好的增強機體免疫效果的蟲草菌絲體粉。

為達到上述目的，本發明采用下列技術方案實現。

菌種接種恒溫培養的培養基配方組成及重量比為：麥芽糖1％-3％，雞蛋蛋白粉2％-8％，kh2po40.1％-0.5％，硫酸鎂0.1％-3％，水余量。

為進一步實現本發明的目的，其配方組成及重量比為：麥芽糖1.5％-2.5％，雞蛋蛋白粉4％-6％，kh2po40.2％-0.4％，硫酸鎂0.5％-2.5％，水余量；更優選的配方組成及重量比為：麥芽糖2％，雞蛋蛋白粉5％，kh2po40.3％，硫酸鎂0.2％，水余量。

種子罐發酵培養的培養基配方組成及重量比為：馬鈴薯粉15％-30％，葡萄糖1％-4％，乳清濃縮蛋白2％-5％，kh2po40.1％-0.5％，硫酸鎂0.1％-3％，水余量。

為進一步實現本發明的目的，其配方組成及重量比為：馬鈴薯粉20％-25％，葡萄糖2％-3％，乳清濃縮蛋白3％-4％，kh2po40.2％-0.4％，硫酸鎂0.5％-2.5％，水余量；更優選的配方組成及重量比為：馬鈴薯粉20％，葡萄糖3％，乳清濃縮蛋白4％，kh2po40.2％，硫酸鎂0.1％，水余量。

發酵罐培養的培養基配方組成及重量比為：大豆分離蛋白4％-10％，脫脂奶粉4％-10％，酶解骨粉8％-12％，葡萄糖1％-3％，水余量；所述酶解骨粉的制備方法為：①蒸煮：將動物鮮骨經挑選、清洗等工序，裝入蒸煮罐內，蒸煮3次，每次2小時；②研磨：將蒸煮后的凈骨，經粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料與添加的水的重量比為1∶1；③生化酶解：將研磨后的骨漿打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復合蛋白酶，復合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加檸檬酸調ph值至5.5，45℃攪拌1h；酶解液加堿中和，滅活，供下道工序使用，噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時；④干燥噴粉：當進口溫度達到180℃時，打開蓄水罐閥門，當進口溫度達到225℃、出口溫度達到105℃時，穩定10分鐘后關閉水閥門，打開滅菌缸排液閥門，開始噴粉，得酶解骨粉。

為進一步實現本發明的目的，其配方組成及重量比為：大豆分離蛋白5％-8％，脫脂奶粉5％-8％，酶解骨粉9％-11％，葡萄糖2％-3％，水余量；更優選的配方組成及重量比為：大豆分離蛋白5％，脫脂奶粉5％，酶解骨粉10％，葡萄糖3％，水余量。

本發明采用蝙蝠蛾擬青霉為菌種，通過菌種接種恒溫培養、種子罐培養、發酵罐培養、超低溫真空濃縮、冷凍干燥、粉碎等工藝制備而成。

具體步驟為：

步驟一：菌種接種恒溫培養：

配制培養基：其配方組成及重量比為：麥芽糖1％-3％，雞蛋蛋白粉2％-8％，kh2po40.1％-0.5％，硫酸鎂0.1％-3％，水余量。將配制好的培養基分裝入錐形瓶中，封口后在120-130℃條件下滅菌18-30分鐘，取出培養基，自然冷卻至20-30℃，在無菌條件下接入蝙蝠蛾擬青霉菌種，15-30℃恒溫培養5-10天。

步驟二：種子罐培養：

配制培養基：其配方組成及重量比為：馬鈴薯粉15％-30％，葡萄糖1％-4％，乳清濃縮蛋白2％-5％，kh2po40.1％-0.5％，硫酸鎂0.1％-3％，水余量。配制好的培養基進行高溫高壓滅菌，滅菌條件為：滅菌壓力0.1mpa；滅菌溫度121℃；滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟一培養好的菌種，接種量6.5％-8.0％，溫度15-30℃，通氣1∶0.5，攪拌速度200轉/分鐘，培養時間72小時。

步驟三：發酵罐培養：

配制培養基：其配方組成及重量比為：大豆分離蛋白4％-10％，脫脂奶粉4％-10％，酶解骨粉8％-12％，葡萄糖1％-3％，水余量。配制好的培養基進行高溫高壓滅菌，滅菌條件為：滅菌壓力0.1mpa；滅菌溫度121℃；滅菌時間30分鐘。滅菌后接入步驟二培養好的菌種，接種量3.0％-3.5％，溫度15-30℃，通氣1∶0.5，攪拌速度200轉/分鐘，培養至培養基還原糖小于0.1％時，放罐收獲。

步驟四：超低溫真空濃縮

將培養好的蟲草菌絲體放入超低溫真空濃縮設備，設定工作真空度為-0.08mpa，蒸發溫度為30℃，濃縮至產品比重達到1.2-1.3g/cm³,結束濃縮。

步驟五：冷凍干燥

將濃縮后的蟲草菌絲體以-0.6℃/分鐘的降溫速度快速冷凍到-30℃，維持2小時后，放入干燥室進行干燥。加熱板升溫至45℃后，保持9小時，再降溫至35℃，保持5小時，全過程保持最高真空度。所得產物水分≤5％。

冷凍干燥后產品，用萬能粉碎機進行粉碎，得到粉末狀蟲草菌絲體。

本發明所述的菌種接種恒溫培養的培養基，其氮源采用雞蛋蛋白粉，雞蛋蛋白粉屬動物源蛋白質，含有90％以上的優質蛋白質，氨基酸種類齊全且含量豐富，營養價值高。經過篩選對比試驗后發現，以雞蛋蛋白粉做為氮源，可明顯的促進接種恒溫培養階段的蟲草菌絲體的生長，是此階段的最佳氮源。礦物質鉀、磷、鎂對蟲草發酵具有重要影響，因此在培養基中加入適量的kh2po4和硫酸鎂，以促進蟲草菌絲體的生長。

本發明所述的種子罐培養基，其氮源采用乳清濃縮蛋白，乳清濃縮蛋白來源于牛乳，含有80％以上的優質蛋白質，氨基酸種類齊全且含量豐富，營養價值高。經過篩選對比試驗后發現，以乳清濃縮蛋白做為氮源，可明顯的促進種子罐培養階段的蟲草菌絲體的生長，是此階段的最佳氮源。礦物質鉀、磷、鎂對蟲草發酵具有重要影響，因此在培養基中加入適量的kh2po4和硫酸鎂，以促進蟲草菌絲體的生長。

本發明所述的發酵罐培養基，以大豆分離蛋白、脫脂奶粉為氮源，大豆分離蛋白含有90％以上的優質蛋白質，屬于植物性蛋白，脫脂奶粉含有34％的優質蛋白質，屬于動物性蛋白，兩者復配使用，可實現氨基酸的互補，彌補兩種蛋白質中限制性氨基酸的不足，顯著提高營養價值。經過篩選對比試驗后發現，以大豆分離蛋白和脫脂奶粉做為氮源，可明顯的促進發酵罐培養階段的蟲草菌絲體的生長，是此階段的最佳氮源。酶解骨粉來源于天然牛骨，富含鈣、鎂、鐵、鋅等多種礦物元素，是純天然的礦物質集合體，與無機礦物質相比，安全性高，生物利用率高，營養價值高，并可以明顯促進蟲草菌絲體的生長。

蟲草酸是蟲草菌絲體的主要活性成分之一，其屬于弱酸，對溫度敏感，遇熱易揮發；蟲草素是蟲草菌絲體的主要活性成分之一，屬于腺苷類似物，其熱穩定性也較差；sod酶是蟲草菌絲體的主要活性成分之一，屬于生物酶類，遇高溫容易變性從而失去生物活性。本發明所述的超低溫真空濃縮和冷凍干燥工藝，是在較低的加工溫度條件下，實現了蟲草菌絲體的濃縮和干燥過程，與現有技術相比，更好的保留了蟲草菌絲體中的對熱敏感的活性物質。

發明人通過大量的實驗研究，發現蟲草菌絲體對礦物質元素富集能力高。本發明采用特定的培養基及制備方法，生產出富含鈣、鎂、鐵、鋅的蟲草菌絲體，同時明顯提高了蟲草菌絲體中蟲草酸、蟲草素、sod酶等活性成分的含量。藥理實驗和臨床實驗數據表明，蟲草菌絲體具有顯著的免疫調節的功能；鈣、鎂、鋅、鐵元素均是人體必需的礦物元素，與人體免疫系統關系密切，具有提高機體免疫力的功效。兩者相輔相成，協同增效，可以明顯增加產品此方面的保健功效。

發明人在研究蟲草菌絲體粉的制備工藝時，意外發現選擇步驟二種子罐培養過程中接入步驟一培養好的菌種的接種量為6.5％-8.0％，步驟三發酵罐培養過程中選擇本發明特定工藝制備的酶解骨粉配制培養基，而僅接入步驟二培養好的菌種3.0％-3.5％，不改變其他步驟工藝參數的情況下，所制得的蟲草菌絲體粉的產量幾乎沒有變化，但產品中鈣含量、鎂含量、鐵、鋅、蟲草酸、蟲草素、sod酶活力均有不同程度的提升。經檢測，本發明所述的蟲草菌絲體粉，較申請號為201310124056.3生產的蟲草菌絲體粉，產品中鈣含量提高15～20％；鎂含量提高5～8％；鐵含量提高5～7％；鋅含量提高6～9％；蟲草酸含量提高5～8％；蟲草素含量提高6～10％；sod酶活力提高4～7％。

經功能試驗證明，本發明所述的蟲草菌絲體粉，較現有技術生產的蟲草菌絲體粉具有更加顯著的增強機體免疫的效果。

本發明所述的蟲草菌絲體粉可與任何一種或一種以上藥劑學上輔料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇、硬脂酸鎂、微粉硅膠、木糖醇、葡萄糖、甘露醇等混合制成的各種劑型，例如，可制成片劑、緩釋片、粉劑、滴丸、顆粒劑、膠囊劑、微粒劑。優選劑型為膠囊劑或粉劑。

試驗例：

下面通過臨床試驗數據，進一步說明本發明的有益效果：

1材料和方法：參照《保健食品檢驗與評價技術規范》中增強免疫力功能檢驗方法與操作規程進行。

1.1試驗動物與造模

昆明種spf級小鼠，雌性，由重慶市實驗動物中心提供，體質量為16～18g，放入動物房適應3d后，體質量為18～22g開始造模，腹腔內注射100mg/kg環磷酰胺，1次/d，連續3天。

1.2分組與給藥劑量

每個實驗分為四組，即實驗a組、實驗b組、實驗c組、空白對照組，每組10只。實驗a組為服用本發明實施例1制得的蟲草菌絲體粉，實驗b組為服用專利申請號為201310124056.3中的實施例1制得的蟲草菌絲體粉(其步驟三中酶解骨粉采用以下方法制備：①蒸煮：將動物鮮骨經挑選、清洗等工序，裝入蒸煮罐內，蒸煮3次，每次2小時；②研磨：將蒸煮后的凈骨，經粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料與添加的水的重量比為1∶1；③生化酶解：將研磨后的骨漿打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶重量比1︰2的復合蛋白酶，復合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加檸檬酸調ph值至5.5，45℃攪拌1h；酶解液加堿中和，滅活，供下道工序使用，噴粉前骨漿在滅菌缸中停留不得超過1小時；④干燥噴粉：當進口溫度達到180℃時，打開蓄水罐閥門，當進口溫度達到225℃、出口溫度達到105℃時，穩定10分鐘后關閉水閥門，打開滅菌缸排液閥門，開始噴粉，得酶解骨粉)，實驗c組為服用從江西中科生物有限公司購得的蟲草菌絲體粉，按照成人一天推薦量2g/60kg計算，相當于0.03g/日/kg體重，實驗量設人體推薦量的10倍，即每日0.3g/kgbw。受試物以無菌水配制，每日一次經口給予，連續灌胃30天后測各項指標。空白對照組給予同劑量的生理鹽水。

1.3試驗方法

1.3.1體重、臟器/體質量比值各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后稱量，頸椎脫臼處死，解剖動物，取出胸腺和脾臟，用濾紙吸干血跡后稱量，計算臟器和體質量之間的比值。

1.3.2脾淋巴細胞轉化實驗采用同位素摻入法。各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后制作各組小鼠脾細胞，做為反應細胞。刺激細胞的制作：無菌制作c57bl/6小鼠脾細胞懸液，用濃度為25mg/l的絲裂霉素c在37攝氏度下處理30min后，離心去上清，再洗2遍后，用含10％小牛血清的rpmi1640恢復到5*10⁹/l,并加入到96孔板中。細胞培養6d后，每孔加³h-tdr使終濃度為18.5*10⁴bq/孔繼續培養6h。收集細胞于玻璃纖維濾紙上，液閃儀計數每分鐘脈沖數。

1.3.3遲發型變態反應實驗采用耳腫脹法。各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后，于第1、第5天每只小鼠后肢皮內注射7％dnfb丙酮溶液0.02ml進行致敏，于第1次致敏的第8天，用1％dnfb丙酮溶液0.02ml涂布于右耳進行攻擊，左耳涂布生理鹽水作為對照。次日處死動物，用直徑8mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，稱重并計算左右耳重量的差值進行單因素方差分析。

1.3.4抗體生產細胞檢測采用jerne改良玻片法。各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后用srbc致敏，5d后頸椎脫臼處死，取出肝臟制成細胞懸液，在5mlrpmi1640培養液中技術細胞，并將細胞濃度調整為5*10⁶個/ml。將表層培養基加熱溶解后，放50℃水浴保溫，與等量ph7.2-7.4、2倍濃度的hank's液視合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內加50μl10％srbc，20μl脾細胞懸液，迅速混勻，傾倒于己刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上.放入二氧化碳培養箱中孵育1-1.5h然后用sa緩沖液稀釋的補體加入到玻片架凹槽內，繼續溫育1-1.5h后，計數溶血空斑數。

1.3.5血清溶血素測定采用測定半數溶血值法。各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后用srbc致敏，5天后，摘除眼球取血于離心管內，放置約1h使血清充分析出，2000r/min離心10min，收集血清。用sa緩沖液稀釋。將稀釋后的血清1ml置試管內.依次加入10％srbc0.5ml,補體1ml。另設不加血清的對照管(以sa緩沖液代替)。置37℃恒溫水浴中保溫巧20min后.冰浴終止反應，2000r/min離心10min，取上情液1ml加都氏試劑3ml，同時取10％srbc0.25ml加都氏試劑至4ml，充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值，即為血清半數溶血值(血清hc50)。

1.3.6碳廓清實驗各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后后小鼠的尾靜脈按每10g體質量0.1ml注入濃度為25％墨汁，注射墨汁間隔2、10min，分別從小鼠內毗靜脈叢取血20μl，加入到2ml的na2co3(w＝0.1％)溶液中。以na2co3溶液作空白對照，用722可見分光光度計在600nm下測定吸光度。然后將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱量，算出吞噬指數α。

1.3.7巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗各組小鼠按規定給藥劑量給藥，連續灌胃30d后，向每只小鼠腹腔注射20％的雞紅細胞懸液lml，30min后，頸椎脫臼處死動物，解剖小鼠腹腔，注入2ml生理鹽水，吸取腹腔液制作涂片，用吉姆薩工作液染色15～30min，再用蒸餾水漂洗、晾干，顯微鏡下計數，計算吞噬指數和吞噬百分率。

1.3.8nk細胞活性測定用mtt法：取處于對數生長期的yac-1細胞為靶細胞。各組小鼠脾淋巴細胞置培養瓶中貼壁2h去除貼壁的巨噬細胞后為效應細胞，按下式計算殺傷率：

殺傷率(％)＝1-(od(e+t)-ode)/odt

od(e+t)：指nk+靶細胞孔od值。ode：指同一組效應細胞對照孔od值。odt：指相應靶細胞對照孔od值。

2實驗結果

2.1對小鼠體質量，脾臟、胸腺指數影響：與空白對照組比較，各實驗組小鼠體重增加差異不顯著(p＞0.05)；脾臟/體質量與胸腺/體質量中，實驗b組、實驗c組可顯著提高小鼠脾臟或胸腺指數(p＜0.05)，實驗a組即本發明組可極其顯著提高小鼠脾臟或胸腺指數(p＜0.01)。具體實驗數據見表1。

表1對小鼠體質量及脾臟、胸腺質量的影響