本發明屬于食品加工領域，涉及酶解蜂王漿的制備方法，還涉及由該方法制得的產品和應用。
背景技術：
我國上糖尿病發病人群逐年增高，糖尿病發病最重要的因素是人們體內的胰島素分泌不足。雖然西藥目前是治療糖尿病最好的手段，但是也有一些限制性和副作用，如會引發血糖偏低和機體酸中毒的癥狀，而且糖尿病患者會存在一些長期使用藥物治療而無療效的并發癥，在完全治療和防治等方面還缺乏特效的手段和藥品。目前，糖尿病飲食療法是當前糖尿病無法根治階段食療的研究和應用方向。其中用蜂王漿來進行糖尿病的預防和治療，取得了一定的效果。新鮮蜂王漿含有蛋白質12％-15％、脂質3％-6％、糖類10％-16％，其他的維生素、氨基酸及礦物質占2％-3％。其中，蛋白質在蜂王漿的干物質中含量最高，約30％-50％，并含有高生物活性的酶及多肽。然而，極差的蛋白質穩定性及酸澀辛辣的不良口感是制約蜂王漿產業進一步發展的關鍵問題。因此，在新鮮蜂王漿營養保健功能的基礎上，通過酶解技術，改善蜂王漿的理化特性及感官指標，對蜂王漿的深度開發及利用具有重要意義。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種酶解蜂王漿的制備方法，該方法簡單，反應條件溫和；本發明的目的之二在于提供由上述方法制得的酶解蜂王漿；本發明的目的之三在于提供酶解蜂王漿的應用。
為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：
酶解蜂王漿的制備方法，包括如下步驟：
(1)制備蜂王漿水溶液：取新鮮蜂王漿，加水溶解，制得蜂王漿水溶液；
(2)酶解：將步驟(1)制備得的蜂王漿水溶液加入氯化鈣，然后調節蜂王漿溶液ph＝7.5，再加入蛋白酶k，酶解，反應結束滅酶，得酶解蜂王漿。
本發明步驟(1)中，蜂王漿與水的料液比為1：9。
本發明步驟(2)中，所述氯化鈣加入量為加入后氯化鈣終濃度為0.1mol/l。
本發明步驟(2)中，調節蜂王漿溶液ph用1mol/l的naoh調節。
本發明步驟(2)中，蛋白酶k加入量按加入后蛋白酶k終濃度為60ug/ml。
本發明步驟(2)中，所述酶解液在55℃溫度下攪拌反應4h。
本發明步驟(2)中，所述滅酶為100℃下加熱5min。
2.由所述的制備方法制得的酶解蜂王漿。
3.所述酶解蜂王漿在制備降糖的食品或保健品中的應用。
本發明的有益效果在于：本發明公開了酶解蜂王漿的制備方法及其產品和應用，該方法使用蛋白酶k進行酶解，蛋白酶k屬于絲氨酸蛋白酶類，是通過林伯氏白色念球菌(tritirachiumalbumlimber)生產的一類蛋白酶，主要應用于分子生物學及細胞生物學等相關生化試驗，在提取組織dna及rna的過程中具有十分重要的作用。相比于傳統酶解改性技術使用的酶類，蛋白酶k通過白色念球菌進行生產，具有統一的生產規格、穩定的水解活性及成熟的反應條件及反應體系，而氯化鈣作為蛋白酶k的穩定劑也能在蜂王漿產品的開發利用中同時使用，以獲得富含鈣離子的高附加值產品。本發明方法簡單，條件溫和，制得的酶解蜂王漿降糖效果優于未經處理的蜂王漿，對蜂王漿制品開發及其醫療保健開發具有重要意義。
具體實施方式
下面將對本發明的優選實施例進行詳細的描述。
本發明實施例使用的試劑如下：四氧嘧啶(華中海威)；血糖檢驗試紙，尿糖檢驗試紙(三諾生物)；生理鹽水；清潔級小鼠(11-40g)(重慶市畜牧科學院)；蛋白酶k(merck，40u/mg)；氯化鈣；蒸餾水；氫氧化鈉；鹽酸；蜂王漿(重慶佳聯生物技術有限公司)；pbs磷酸緩沖液配置：8.150g/lnacl、0.201g/lkcl、1.420g/lna2hpo4、0.239g/lkh2po4；bradford蛋白質定量試劑盒(tiangen)。
實施例1、酶解蜂王漿的制備方法
(1)制備蜂王漿水溶液：稱取25g蜂王漿，加入225ml蒸餾水溶解，料液比(質量體積比，單位：g/ml)為1:9，攪拌混勻，制得蜂王漿水溶液；
(2)酶解：將步驟(1)制備好的蜂王漿水溶液加入氯化鈣2.775g(終濃度為0.1mol/l)，然后使用1mol/l的naoh調節蜂王漿溶液至ph＝7.5，然后加入蛋白酶k15mg(60μg/ml)，在55℃溫度下攪拌反應4h，反應結束后于100℃下加熱5min滅酶，得酶解蜂王漿。
將步驟(2)制得的酶解蜂王漿分別按10.00、5.00、2.5g/kg3個濃度梯度配制，備用。
實施例2、糖尿病小鼠造模
隨機選取不同體重的健康小鼠150只，于標準小鼠飼養條件下正常飼養3d，第3日起禁食16h，然后測定體重、血糖空腹值和尿糖的陰陽性指標，挑選126只血糖低于9mmol/l，且尿糖陰性的雌雄各半小鼠，分別按照雌性小鼠不同體重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)隨機分成高、中、低劑量組9組，雄性小鼠不同體重(22-26g、18-21.9g、14-17.9g)隨機分成高、中、低劑量組9組并于標準小鼠飼養條件下正常飼養備用。
四氧嘧啶劑量分組：首先設置出高、中、低四氧嘧啶劑量組，然后再分別對不同性別、體重的小鼠按照200mg/kg、120mg/kg和50mg/kg的劑量組來對小鼠進行不同劑量的四氧嘧啶分組，分組后小鼠禁食不禁水16小時，然后按設定劑量給予腹腔注射四氧嘧啶，72h后又采血，使用血糖檢驗試紙和血糖儀測定血糖，同時測定尿糖(鼠尿可采取尿濕墊料加水浸泡離心液代替)。以試紙和血糖儀測得血糖濃度大于15mmol/l、且尿糖為++以上的小鼠指標為造模成功的指標。
結果顯示，造模后3d內，共有37只小鼠死亡。造模后第3天空腹血糖值>15mmol/l的小鼠出現明顯的三多一高癥狀(多飲、多食、多尿、血糖增高)、呆滯、皮毛松散、尿糖陽性、拒食和體重減輕等癥狀。部分小鼠在實驗后不久皮溫降低2-3℃，并在不同時期死亡，其結果見表1、表2、表3和表4。
表1、雄性小鼠分組的造模成功率和死亡率
表2、雌性小鼠分組的造模成功率和死亡率
表3、造模雄性小鼠的空腹血糖值和尿糖穩定性(均值，mmol/l)
表4、造模雌性小鼠的空腹血糖值和尿糖穩定性(均值，mmol/l)
注：成功率＝造模成功小鼠數量÷成活小鼠數量×100％；死亡率＝死亡小鼠數量÷注射小鼠數量×100％
表1、表2、表3和表4結果顯示，雄性18-21.9g體重高、中劑量組小鼠成模率為100％，低劑量組成模率只有42.86％；最高劑量組的死亡率42.86％，中劑量組的死亡率14.29％，低劑量組的死亡率0％。雌性18-21.9g體重高、中劑量組小鼠成模率為100％，低劑量組成模率只有33.33％；高劑量組死亡率為57.14％，中劑量組死亡率為28.57％，低劑量組死亡率為14.29％。腹腔注射四氧嘧啶途徑可以成功造出小鼠糖尿病模型，并且選擇體重18-21.9g的雄性小鼠禁食16h，120mg/kg四氧嘧啶腹腔注射，可獲得低死亡率、高成模率、持續穩定的小鼠糖尿病模型。
將糖尿病小鼠用標準小鼠的飼養條件進行喂養，第一次在一個星期以后按照上述方法進行血糖和尿糖的測定，并記錄變化，第二次則是在兩個星期以后同樣進行此步驟分析糖尿病模型的穩定性，結果顯示在十天內，低劑量組可以保持高水平的尿糖和血糖值，但是在二十天后會逐漸降低，有些直接降低到了最低水平(9mmol/l)而導致最終不能成模。但是，高劑量組和中劑量組在二十天以內的血糖和尿糖值都比較穩定，波動范圍比較小，且一直保持在較高的水平上，相比低劑量組，高、中劑量組的模型穩定性較優。
實施例3、酶解蜂王漿降糖試驗
在成模小鼠中選擇出56只小鼠進行分組，另選8只雄性正常小鼠做陰性對照組，然后按以下方法處理：
a酶解蜂王漿組(高中低組)
造模成功后，分別按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃實施例1制得的蜂王漿酶解液，連續15天；
b蜂王漿組(高中低組)
造模成功后，分別按10.00、5.00、2.5g/kg灌胃蜂王漿，連續15天；
c陽性對照組
只注射四氧嘧啶，測血糖，連續15天；
d陰性對照組
不做任何處理，只測血糖，連續15天；
最后一次給藥前需對小鼠絕食6個小時，并在灌喂酶解蜂王漿后的1、3、5h后分別測定一次血糖水平。尾靜脈采血測定的小鼠血糖值，采用spss19.0軟件，對數據進行單因素方差分析，結果如表5所示。
表5、酶解蜂王漿防治四氧嘧啶引起小鼠高血糖效果(均值，mmol/l)
注：表中數據為平均值±標準差，同列不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)。
結果顯示，蜂王漿和酶解蜂王漿均有不同程度的降糖效果；蜂王漿和酶解蜂王漿的降糖效果隨著劑量的增加而顯著提高；酶解蜂王漿的降糖效果優于未經處理的蜂王漿，尤其是高中劑量的酶解蜂王漿。表明酶解蜂王漿對四氧嘧啶引起小鼠高血糖有一定的治療效果，尤以高劑量組效果較好。
最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。