專利名稱：：利用膠德克斯氏菌生產富氨基酸、維生素e、b的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物工業發酵技術，特別是利用膠德克斯氏抗氨固氮菌工業發酵生產富氨基酸、維生素E、B2單細胞蛋白，有機鍺營養液的方法。利用微生物進行工業發酵，生產單細胞蛋白營養物質，目前已引起有關科學家的重視，并已取得了一些進展，如DonaldO.Hitzman，BartlesvilleoklaL.U.SPatentDocuments4302542，1981利用嗜熱細菌進行混合發酵，以乙醇等醇類化合物作為碳源和能源來產生單細胞蛋白;楊振華“851”口服液利用人工誘變處理維氏固氮菌(AzotobacterVinelandii)而得到一組命名為851黃的抗氨固氮菌，作為工業發酵的生產用菌株，利用所設計的培養基生產富硒單細胞蛋白、維生素和菌肥(以上內容參見1987年9月30日CN86100490B，發明專利申請審定說明書，《利用抗氨固氮菌生產富硒單細胞蛋白，維生素E和菌肥的方法》一文)，利用該方法已生產出“851超級口服液”產品，作為人們日常生活中的一種很有營養價值的保健飲料。本發明的目的是篩選出一種新的具有抗氨固氮性能的微生物菌種以及設計出適合于該菌生長的培養基，要求這種菌不但具有851黃維氏抗氨固氮菌的性能，而且利用其作為生產用菌，采用所設計出的培養基生產出的產品有效成分更為豐富，營養比例更為合理。本發明的技術方案1.菌株在對某組維氏抗氨固氮菌進行提純復壯過程中，我們發現了一組邊緣無色(或白色)菌落，其細胞型態從顯微鏡上觀察是小桿狀，0.2～0.5×1微米，單生。廣東省微生物所對該菌進行光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察結果，發現細胞以極生鞭毛運動，在含有結合態氮的液體培養基中有大量運動的細胞，但在缺乏氮的培養基中罕有運動的細胞，革蘭氏染色陽性。培養特征菌落小桿狀，平滑，有光澤，透明;在阿氏貝(Ashby)培養基面上可以生長，呈無色;無機鹽氮液培養基上可以生長;甘露醇-酵母培養基斜面上，生長很好，菌落無色;大豆培養基、有機氮豐富液體培養基上生長迅速，呈灰黃色;洋菜培養基上的菌落透明無色，液體培養基上形成菌膜。生理特征在無氮液體培養基中，能固定大氣中分子態氮，接觸酶陽性，無芽孢，孢囊或莢膜，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原陽性，不利用淀粉，葡萄糖發酵不產生酸，不產氣、V.P.陰性，甲基紅陰性，石蕊牛奶胨化還原，在16℃～37℃能生長，最適PH為6～8，依據V.B.D.斯克爾曼《細菌屬的鑒定指導》發現該菌符合Berger氏鑒定手冊所描述的固氮菌科(Azotobacteraceac)德克斯氏屬(Derxia)的膠德克斯氏菌(DerxiagummosaJenson，Petersem，De&Bhattacharya1960)(我們命名其為“健字N型菌”1991年2月7日送交武漢中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC№M91027)。2.培養基健字N型菌對培養基的適應范圍很廣，可采用多種培養基進行培養。(1)大豆培養基大豆粉5～15%氯化鈉0.01～0.02%硫酸鎂0.03～0.05%鉬酸鈉5～10ppm硫酸鋅10～30ppm酵母膏0.05～0.1%磷酸氫二鉀0.04～0.08%磷酸二氫鉀0.03～0.05%亞硒酸鈉1～5ppm二氧化鍺4～20ppm硼酸5～10ppm(2)甘露醇-酵母膏培養基甘露醇1%酵母膏0.05%K2HPO40.06%MgSO40.03%NaCl0.03%CaCO30.05%NaMoO410ppmH3BO310ppm(3)有機氮豐富液體培養基干淀粉1～5%酵母浸出汁0.05～0.10%K2HPO40.05～0.08%KH2PO40.02～0.05%MgSO40.02～0.04%NaCl0.02～0.04%NaMoO410～20ppmH3BO310ppmZnSO45～10ppm3.工藝流程把上述健字N型菌接種到本發明所設計的大豆培養基或本發明所使用的甘露醇-酵母培養基或有機氮豐富液體培養基中，即先把鍵字N型菌接種到由附表一“斜面”一欄的具體培養基配方所配成的培養基斜面上培養93～98小時后，轉入裝有由附表一“三角瓶”一欄的具體培養基配方所配成的培養基的三角瓶中培養22～26小時，在上述過程中培養環境溫度控制在30～33℃之間，然后再轉入裝有由附表一“一級種子罐”一欄的具體培養基配方所配成的培養基的一級種子罐中，培養18～24小時，再轉入裝有由附表一“二級發酵罐”一欄的具體培養基配方所配在的培養基的二級發酵罐培養36～44小時，在這過程中，溫度應保持在30～32℃之間，將經上述處理后的培養液裝入高位槽中，用90℃溫度處理使菌體滅活后過濾，裝入經預先處理好的玻璃瓶，再用120℃的高溫滅菌30分鐘便成。利用上述方法制成的培養液，還可以進一步加工，用濃縮干燥法生產N型851膠囊或沖劑，其具體的工藝流程如附圖二所示。本發明由于采用了健字N型菌作為生產用菌，由于該菌的代謝物含磷(P)較低，其脂質過氧化反應(LPR)產生的自由基和過氧化物可引起多種細胞損傷，因此利用該菌及所能制成的培養基工業發酵生產的產品(下稱N型851口服液)，除了具有楊振華851口服液所具有的營養成分外，而且其大部分有效成分的合量比楊振華851口服液高(見附表2)，而且易被人體所吸收，有利于人體對鈣的吸收，其主要營養成分的含量氨基酸≥60mg/100ml，干物質≥4～12%，維生素B2≥0.2mg/100mg其產品還含較豐富的有機鍺;有較強的過氧化脂質作用，能提高抗過氧化物酶的含量(見附表3)，保護脂質過氧化物對細胞模、小動脈和中樞神經系統的損害;該產品還具有識別癌細胞的功能，尤其對胃癌FGC的試驗，其結果比楊振華851口服液高20%以上。因其營養成分含量豐富，對正常細胞又是一種極好的營養品。圖一是本發明生產N型851口服液的工藝流程圖。圖二是本發明采用濃縮干燥法生產N型851膠囊或沖劑的工藝流程圖。表1是本發明生產N型851口服液工藝流程中不同工序的培養基配方情況表。表2是本發明生產的N型851口服液與原楊振華851口服液各種營養成分對比表。表3是本發明生產的N型851口服液對不同組小白鼠肝脂質過氧化作用的影響情況表下面結合附圖表說明本發明的實施把健字N型菌接種到由附表一“斜面”一欄的具體培養基配方所配成的培養基斜面上，在30～33℃溫度環境下培養93～98小時，然后把培養后的菌移至裝有由附表一“三角瓶”一欄的具體培養基配方所配成的培養基的三角瓶中，在30～33℃溫度環境中培養22～26小時后，再把培養菌轉入一級種子罐中，該罐中裝有由附表一“一級種子罐”一欄的具體培養基配方所配成的培養基，這一流程培養基溫度應控制在30～32℃，培養時間18～24小時，經過這一流程后便可把該培養菌及培養基一起轉入二級發酵罐中，二級發酵罐中裝有由由附表一“二級發酵罐”一欄的具體培養基配方所配成的培養基，在這流程中培養基溫度應控制在30～32℃，培養時間36～44小時，經過上述處理后再把培養液及培養菌轉入高位槽中，在90℃的溫度下進行菌體滅活處理之后，再過濾，裝入經清洗、消毒后的瓶子中，再在120℃溫度下滅菌30分鐘便可貼標、裝箱出售。利用上述方法制成的培養液，可以直接作為一種營養飲料，也可以進一步加工，用濃縮干燥法生產N型851膠囊或沖劑，其具體的工藝流程如附圖二所示。表1廣東N型851口服液工藝流程中不同工序的培養基配方表2廣東N型851口服液與福建851口服液營養成分對比表</tables>權利要求1.本發明涉及一種利用微生物生產富氨基酸、維生素E、B2及有機鍺培養液的方法，其特征在于利用膠德克斯氏抗氨固氮菌(CCTCC№M91027)(我們命名其為健字N型菌)接種到本發明所設計的大豆培養基或本發明所使用的甘露醇--酵母培養基、有機氮豐富液體培養基中發酵培養生產培養液。即先把鍵字N型菌接種到由附表-“斜面”-欄的具體培養基配方所配成的培養基斜面上培養93～98小時后，轉入裝有由附表-“三角瓶”-欄的具體培養基配方所配成的培養基的三角瓶中培養22～26小時，在上述過程中培養環境溫度控制在30～33℃之間，然后再轉入裝有由附表-“一級種子罐”-欄的具體培養基配方所配成的培養基的一級種子罐中，培養18～24小時，再轉入裝有由附表一“二級發酵罐”-欄的具體培養基配方所配在的培養基的二級發酵罐培養36～44小時，在這過程中，溫度應保持在30～32℃之間。2.根據權利要求1所述的大豆培養基，其特征在于含有大豆粉5～15%，氯化鈉0.01～0.02%，硫酸鎂0.03～0.05%，鉬酸鈉5～10ppm，硫酸鋅10～30ppm，酵母膏0.05～0.1%，磷酸氫鉀0.04～0.08%，磷酸二氫鉀0.03～0.05%，亞硒酸鈉1～5ppm，有機鍺4～20ppm，硼酸5～10ppm。3.根據權利要求1所述的培養液其特征在于還可以進一步加工，用濃縮干燥法生產N型851膠囊或沖劑。全文摘要本發明涉及一種利用膠德克斯氏抗氨固氮菌，利用大氣中的氮作為氮源在本發明所設計的大豆培養基及所使用的甘露醇、酵母膏培養基、有機氮豐富液體培養基中發酵生產培養液的技術，采用該技術生產出的產品含有豐富的氨基酸、維生素E、B文檔編號C12P1/04GK1059757SQ9110319公開日1992年3月25日申請日期1991年5月17日優先權日1991年5月17日發明者武傳斌,曾慶坤,羅鑄崇,張志明,林紹其,朱思聰申請人:惠州市嶺南生物工程公司