專利名稱：含硫氨基酸生產菌以及含硫氨基酸的制造方法
技術領域：
本發明涉及L-半胱氨酸等含硫氨基酸或其關聯物質的制造方法，具體涉及適于含硫氨基酸或其關聯物質的制造的細菌、以及使用該細菌的含硫氨基酸或其關聯物質的制造方法。含硫氨基酸及其關聯物質可用于醫藥品、化妝品以及食品領域。
背景技術：
L-半胱氨酸通常通過從例如毛發、角和羽毛等含有角蛋白質的物質中提取而獲得，或者使用微生物酶轉化前體DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通過而獲得。此外，還計劃使用新型酶通過固定化酶方法大規模生產L-半胱氨酸。此外，還嘗試通過使用微生物的發酵來生產L-半胱氨酸。作為具有生產L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞內絲氨酸乙酰轉移酶活性增加的棒狀桿菌型細菌(專利文獻I)。還已知一種通過并入削弱了 L-半胱氨酸反饋抑制的突變型絲氨酸乙酰轉移酶增加L-半胱氨酸生產能力的技術(專利文獻2 4)。此外，作為通過抑制起分解L-半胱氨酸作用的系統來提高L-半胱氨酸生產能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(專利文獻2)、色氨酸酶(專利文獻5)或O-乙酰絲氨酸硫化氫解酶B (專利文獻6)的活性的棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬(Escherichia)細菌。此外，已知編碼YdeD蛋白的ydeD基因參與了 L-半胱氨酸途徑代謝產物的分泌(非專利文獻I)。此外，還已知通過增加mar基因座、emr基因座、acr基因座、cmr基因座、mex 基因、bmr 基因或 qacA 基因( 專利文獻 7),或 emrAB、emrKY、yo jIH、acrEF、bcr 或 cusA基因的表達來提高L-半胱氨酸生產能力(專利文獻8)的技術，這些基因座/基因編碼適于從細胞分泌細胞毒性物質的蛋白質。
此外，作為L-半胱氨酸生產菌，還已知cysB基因編碼的半胱氨酸調節子的正向轉錄調控因子的活性增加的大腸桿菌(Escherichia coli)(專利文獻9)。此外，還已知削弱了絲氨酸反饋抑制的編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA，并且提出通過將該突變型serA用于通過大腸桿菌進行的L-半胱氨酸生產(專利文獻10和 11)。此外，甲硫氨酸在工業上主要是通過化學合成以DL體的形式制造。在必需L體的情況下，通過將DL體乙酰基化為N-乙酰基-DL-甲硫氨酸，再采用酶法僅將L體脫乙酰基化來制造。而且，也嘗試了通過使用微生物的發酵方法來進行L-甲硫氨酸的生產。作為L-甲硫氨酸生產菌，已知有:L-甲硫氨酸生物合成系統的阻遏物缺損、細胞內的高絲氨酸轉琥珀酰基酶活性增強、且細胞內的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性弱化、顯示L-蘇氨酸營養缺陷性、細胞內的胱硫醚Y -合酶活性以及天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II活性增強的大腸桿菌(專利文獻12)等。yeeE基因作為編碼推定涉及跨膜的蛋白質(putative transport systempermease protein)的基因在數據庫EcoCyc (非專利文獻2)中登錄。此外，使用膜蛋白質預測程序 SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)進行解析，預測YeeE為9次跨膜型膜蛋白質。因而，推定其為某種轉運子，但其實際功能不明，也未知其與含硫氨基酸生產的關系。此外，有報告稱，yeeE基因在下述條件時上調:鎘(非專利文獻3)、鋅(非專利文獻4)、C0釋放劑C0RM-2 (非專利文獻5)、RpoE依賴性地在穩定期早期(非專利文獻6)、以及人體溫37°C的溫度條件(非專利文獻7)。此外，有報告稱，其因乙酸(非專利文獻8)、熊果酸(非專利文獻9)，或者在IHF(-)株中(非專利文獻10)下調。然而，上述均是僅僅作為在微陣列實驗中表達有變化的眾多基因中的一個而列舉，并未提示與含硫氨基酸生產的關系。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:特開2002-233384號公報專利文獻2:特開平11-155571號公報專利文獻3:美國專利申請公開第20050112731號專利文獻4:美國專利第6218168號專利文獻5:特開2003-169668號公報專利文獻6:特開2005-245311號公報專利文獻7:美國專利第5972663號專利文獻8:特開2005-287333號公報專利文獻9:國際公開小冊子第01/27307號專利文獻10:美國專利第5856148號專利文獻11:美國專利申請公開第20050009162號專利文獻12:美國專利第7611873號非專利文獻非專利文獻I:Dassler et al.，Mol.Microbiol.36，1101-1112 (2000)非專利文獻2:BioCyc Home Page, Escherichia coli K_12substr.MG1655Gene:yeeE[平成 22 年 7 月 13 日檢索]、互聯網〈http://biocyc.0rg/ECOLI/NEff-1MAGE *type=GENE&object=EG11895>非專利文獻3:Kerstin et al.，J.Bacteriol.，Aug2008 ； 190:5439-5454非專利文獻4:Kaneyoshi et al.，J.Bacteriol.，Sep2005 ； 187:6333-6340非專利文獻5:Ligia S.Nobre et al., Microbiology, Mar2009 ; 155:813-824非專利文獻6:Md.Shahinur Kabir et al., Microbiology, Aug2005 ； 151:2721-2735.
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發明所要解決的問題本發明的課題是開發提高細菌的生產含硫氨基酸的能力的新技術，提供含硫氨基酸生產菌、以及使用該細菌的含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物的制造方法。解決問題的方法本發明人為解決上述問題進行了深入研究，結果發現:通過對細菌進行修飾而增強yeeE基因編碼的蛋白質的活性，能夠提高生產含硫氨基酸的能力，從而完成了本發明。即，本發明如下。(I)具有生產含硫氨基酸的能力、且經過修飾而增強了 yeeE基因編碼的蛋白質的活性的屬于腸桿菌科的細菌。(2)所述細菌，其中，通過增大yeeE基因的表達量、或增大yeeE基因的翻譯量，增強所述蛋白質的活性。(3)所述細菌，其中，通過提高yeeE基因的拷貝數、或修飾該基因的表達調控序列，增大yeeE基因的表達量。(4)所述細菌，其中，所述蛋白質是下述㈧或⑶所述的蛋白質。(A)由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列組成的蛋白質。(B)具有在SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列中，包含I個或數個氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且增強在細胞內的活性時生產含硫氨基酸的能力提高的蛋白質。(5)所述細菌，其中，所述yeeE基因是下述(a)或(b)所述的DNA。(a)由SEQ ID NO: 13所示的堿基序列組成的DNA、或(b)能夠在嚴格條件下與SEQ ID NO:13所示的堿基序列的互補堿基序列或能夠由該喊基序列制備的探針雜交，且編碼增強在細胞內的活性時生廣含硫氣基酸的能力提聞的蛋白質的DNA。(6)而且，所述細菌，具有下述性質中的至少任意一個。i)經過修飾而提高了絲氨酸乙酰轉移酶活性。ii)經過修飾而提高了 ydeD基因的表達。iii)經過修飾而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。(7)所述細菌，其中，所述細菌是埃希氏菌屬細菌。(8)所述細菌，其中，所述細菌是大腸桿菌。(9)所述細菌,其中,所述細菌是泛菌屬細菌。(10)所述細菌，其中，所述細菌是Pantoea ananatis。(11)含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物的制造方法，其中，將所述細菌在培養基中進行培養，并從該培養基收集含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物。(12)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸。(13)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸，所述關聯物質是胱氨酸或噻唑烷衍生物。發明效果
根據本發明，能夠提高細菌的生產含硫氨基酸的能力。此外，根據本發明，高效率地制造含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物。
[圖1]顯示野生型nlpD啟動子(Pnlp:SEQ ID NO:15)、以及突變型nlpD啟動子(Pnlp8:SEQ ID NO:16)與yeaS基因的連接位點的序列的圖。發明的
具體實施例方式〈1>本發明的細菌本發明的細菌是具有生產含硫氨基酸的能力，且經過修飾使得增強了 yeeE基因編碼的蛋白質的活性的屬于腸桿菌科的細菌。作為含硫氨基酸，可以列舉出L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸，優選L-半胱氨酸。此夕卜，本發明的細菌可以具有L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸這兩者的生產能力。此外，在本發明中，含硫氨基酸是指:游離體的含硫氨基酸或其鹽、或它們的混合物。作為鹽,可以列舉出例如硫酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、銨鹽、鈉鹽、鉀鹽。這里，生產含硫氨基酸的能力是指:當在培養基中培養本發明的細菌時，在培養基中或者菌體內生成含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物，并且蓄積達到可以從培養基中或者菌體回收的水平的能力。此外，具有生產含硫氨基酸的能力的細菌是指:與野生株或者親本株相比可以生產更多量的含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物并使其在培養基中蓄積的細菌，優選可以生產并在培養基中蓄積0.05g/L以上，更優選為0.lg/L，特別優選為0.2g/L以上的量的含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物的細菌。在含硫氨基酸為L-半胱氨酸的情況下，有時細菌產生的L-半胱氨酸在培養基中通過二硫鍵部分轉化為L-胱氨酸。此外，有時L-半胱氨酸通過和培養基中含有的硫代硫酸反應生成 S-磺酸半胱氨酸(Szczepkowski T.ff.，Nature, vol.182(1958))。進一步,細菌的細胞內生成的L-半胱氨酸有時還和細胞中存在的酮或醛，例如與丙酮酸縮合，以硫代半酮縮醇(hemithioketal)為中間體生成噻唑燒(thiazolidine)衍生物(參考日本專利第2992010號)。這些噻唑烷衍生物以及硫代半酮縮醇有時作為平衡混合物存在。此外，L-半胱氨酸可以用作Y -谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸等的生物合成起始物質。因此，通過使用除了具有L-半胱氨酸生產能力之外、還具有產生這些化合物的能力的細菌，能夠制造這些化合物。在本發明中，L-半胱氨酸生產能力不限于在培養基中或菌體內僅蓄積L-半胱氨酸的能力，包括在培養基中蓄積L-半胱氨酸、L-胱氨酸、如所述的L-半胱氨酸的衍生物 (例如S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、硫代半酮縮醇)、或經由如所述的L-半胱氨酸生產的其他化合物(例如Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸)、或它們的混合物的能力。此外，在本發明中，L-胱氨酸、如所述的L-半胱氨酸的衍生物、以及經由如所述的L-半胱氨酸生產的其他化合物統稱為L-半胱氨酸的關聯物質。L-甲硫氨酸是以L-半胱氨酸作為起始物質之一生物合成的含硫氨基酸。此外，L-甲硫氨酸可用作S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成起始物質。因此，在含硫氨基酸為L-甲硫氨酸的情況下，通過使用除了 L-甲硫氨酸生產能力之外、還具有生產S-腺苷甲硫氨酸等的能力的細菌，能夠制造S-腺苷甲硫氨酸等。在本發明中，L-甲硫氨酸生產能力不限于在培養基中或菌體內僅蓄積L-甲硫氨酸的能力，包括在培養基中蓄積L-甲硫氨酸、或經由L-甲硫氨酸生產的其他化合物(例如S-腺苷甲硫氨酸)、或它們的混合物的能力。在本發明中，如所述的經由L-甲硫氨酸生產的其他化合物稱為L-甲硫氨酸的關聯物質。在本發明中，生產含硫氨基酸的能力是指:在培養基中蓄積L-半胱氨酸、L-半胱氨酸的關聯物質、L-甲硫氨酸、或L-甲硫氨酸的關聯物質、或它們的混合物的能力。此外，在本發明中，L-半胱氨酸的關聯物質與L-甲硫氨酸的關聯物質也統稱為含硫氨基酸的關聯物質。作為具有生產含硫氨基酸的能力的細菌，可以是天然具有生產含硫氨基酸的能力，也可以對諸如下述的細菌采用突變法、重組DNA技術進行修飾而使其具有生產含硫氨基酸的能力。對本發明中使用的細菌沒有特殊限制，只要是屬于如埃希氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、泛菌屬(Pantoea)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)和摩根氏菌屬(Morganella)等的腸桿菌科，并且具有生產L-氨基酸的能力的細菌即可。具體地，可以使用按照NCBI (美國國家生物技術信息中心，National Center for BiotechnologyInformation)數據庫中使用的分類歸入腸桿菌科的細菌(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi id=91347)。作為用于修飾的屬于腸桿菌科的親本株，期望使用埃希氏菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌、腸桿菌屬細菌、或克雷伯氏菌屬細菌。盡管對于埃希氏菌屬細菌沒有特別限制，但是具體而言，可以使用Neidhardt等的著作(Backmann, B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivativesof Escherichia coli K-12, p.2460-2488.Tablel.1n F.D.Neidhardt(ed.), Escherichiacoli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, AmericanSociety for Microbiology Press, Washington, D.C.)中記載的細菌。在這些細菌中，例如可使用大腸桿菌。大腸桿菌的具體實例包括源自原型野生型K12菌株的大腸桿菌W3110(ATCC27325)和大 腸桿菌 MG1655 (ATCC47076)等。這些菌株可從例如美國典型培養物保藏中心(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland20852P.0.Boxl549, Manassas, VA20108,United States of America)獲得。即，對每種菌株都給予了登錄號，并且可以使用這些登錄號訂購菌株(參考http://WWW.atcc.0rg/)。美國典型培養物保藏中心的目錄中列出了各菌株的登錄號。腸桿菌屬細菌的實例可以包括成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)和產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等。作為腸桿菌屬的代表性株,可以列舉出成團腸桿菌ATCC12287株。此外，具體地，可以使用歐洲專利申請公開952221號說明書中示例的菌株。作為泛菌屬細菌，可以列舉出例如Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)、成團泛菌(Pantoea agglomerans)、梓樣泛菌(Pantoea citrea)。Pantoea ananatis 的具體實例包括Pantoea ananatis AJ13355 株、SC17 株。SC17株是以作為低PH下能夠在含L-谷氨酸和碳源的培養基中增殖的菌株從靜網縣磐田市的土壤中分離出來的菌株AJ13355(FERM BP-6614)為起始，作為粘液質低生產突變株選擇出來的菌株(美國專利第6，596，517號)。Pantoea ananatis AJ13355株于平成10年2月19日在通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名稱:產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址:郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)保藏，保藏號FERM P-16644，并于平成11年I月11日轉為基于布達佩斯條約的國際保藏，保藏號FERMBP-6614。此外，Pantoea ananatis SC17株于平成21年2月4日在產業技術綜合研究所專利生物保藏中心(地址郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6)保藏，保藏號FERM BP-11091。而且,Pantoea ananatis AJ13355株在分離時被鑒定為成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans),并當作成團腸桿菌AJ13355進行了保藏。但是,近年來，基于16S rRNA堿基序列分析等,其被重新分類為Pantoea ananatis。作為歐文氏菌屬細菌，可以列舉出解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora),作為克雷伯氏菌屬細菌,可以列舉出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。而且，特別是，泛菌屬細菌、歐文氏菌屬細菌和腸桿菌屬細菌是分類為Y-變形細菌(Y -Proteobacteria)的細菌，它們在分類學上的親緣關系非常近(JGenAppl Microbiol1997Dec ;43(6)355-361, International Journal of SystematicBacteriology, Oct.1997, pl061_1067)。近年來，依據DNA-DNA雜交實驗等，屬于腸桿菌屬的細菌中，有些被重新分類為成團泛菌(Pantoea agglomerans)或分散泛菌(Pantoeadispersa)等(International Journal of Systematic Bacteriology, Julyl989 ；39(3).p.337-345)。此外，屬于歐文氏菌屬的細菌中，有些被重新分類為菠蘿泛菌(Pantoeaananas)、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)(參照 International Journal of SystematicBacteriology, Janl993 ；43 (I), p.162-173)。在本發明中，只要分類為腸桿菌科即可,可以屬于腸桿菌屬、泛菌屬或歐文氏菌屬等。以下，針對賦予屬于腸桿菌科的細菌生產含硫氨基酸的能力的方法、或增強這些細菌的生產含硫氨基酸的能力的方法進行說明。為了向細菌賦予生產含硫氨基酸的能力，可以使用在棒狀桿菌型細菌或埃希氏菌屬細菌等的選育中常規使用的方法，這些方法包括獲取營養缺陷型突變株、類似物抗性菌株或代謝調節突變株，或創建含硫氨基酸生物合成系統酶表達增強的重組菌株等等(參見《7 ^ 7酸発酵》，(株)學會出版中心，1986年5月30日第一版發行，第77-100頁)。這里，在含硫氨基酸生產菌的選育中，可以賦予上述性質例如營養缺陷性、類似物抗性和代謝調節突變中的一種、兩種或者三種以上。此外，表達被增強的含硫氨基酸生產菌生物合成系統酶可以是單獨一種，也可以是兩種或三種以上。另外，可以將例如營養缺陷性、類似物抗性和代謝調節突變等性質的賦予與生物合成系統酶的增強組合進行。具有生產含硫氨基酸的能力的營養缺陷突變體菌株、含硫氨基酸類似物抗性菌株或代謝調節突變株可如下獲得:對親本菌株或野生型菌株施以常規誘變處理，例如暴露于X-射線或紫外線照射或用誘變劑例如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等處理；其后，從所得的突變株中選擇顯示營養缺陷性、類似物抗性或代謝調節突變并且還具有生產含硫氨基酸的能力的菌株。以下，針對賦予屬于腸桿菌科的細菌生產含硫氨基酸的能力的方法、或增強這些細菌的生廣含硫氣基酸的能力的方法、以及具有生廣含硫氣基酸的能力的細菌進行具體不例。L-半胱氨酸生產能力的賦予或增強 、以及L-半胱氨酸生產菌
通過增強L-半胱氨酸生物合成途徑的酶，或，與生成如L-絲氨酸等作為該途徑的底物的化合物相關的酶，例如，3-磷酸甘油酸脫氫酶或絲氨酸乙酰轉移酶等的活性，可以提高細菌的L-半胱氨酸生產能力。3-磷酸甘油酸脫氫酶受到絲氨酸的反饋抑制，通過使細菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的突變型3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變型serA基因，可以增強該酶的酶活性。此外，絲氨酸乙酰轉移酶受到L-半胱氨酸的反饋抑制。因此，通過使細菌攜帶有編碼該反饋抑制被削弱或消除了的絲氨酸乙酰轉移酶的突變型cysE基因，可以增強該酶的酶活性。此外，L-半胱氨酸生產能力還可以通過提高編碼YdeD蛋白的ydeD基因(Dabler等，Mol.Microbiol.，36，1101-1112 (2000))、或者編碼 YfiK 蛋白的 yfiK 基因(特開
2004-49237)、或者編碼YeaS蛋白的yeaS基因(歐洲專利申請公開第1016710號說明書)的表達而增強。L-半胱氨酸生產菌優選具有下述性質中的至少任意一個。i)經過修飾而提高了絲氨酸乙酰轉移酶活性。ii)經過修飾而提·高了 ydeD基因的表達。iii)經過修飾而提高了 3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。此外，通過增強硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統的活性，也可以提高L-半胱氨酸的生產能力。硫酸鹽/硫代硫酸鹽輸送系統的蛋白質群由cysPTWAM基因簇編碼(特開
2005-137369號公報，EP1528108 號說明書)。L-半胱氨酸生產菌的實例可以列舉出但不限于:用編碼反饋抑制抗性的絲氨酸乙酰轉移酶(SAT)的多種cysE等位基因轉化的大腸桿菌JM15菌株(美國專利第6，218，168號)，具有編碼適于分泌細胞毒性物質的蛋白質的過表達基因的大腸桿菌W3110菌株(美國專利第5,972,663號)，半胱氨酸脫巰基酶(cysteine desulfohydrase)活性減少的大腸桿菌菌株(日本特開平11-155571號公報)，和由cysB基因編碼的半胱氨酸調節子的正向轉錄調控因子活性增加的大腸桿菌W3110菌株(W001/27307)等屬于埃希氏菌屬的菌株；以及，具有含ydeD基因、突變型cysE基因和突變型serA5基因的質粒pACYC_DES的大腸桿菌(日本特開 2005-137369 號公報(US20050124049 (Al) ,EP1528108 (Al)))等。pACYC-DES為通過將上述三種基因插入PACYC184所得到的質粒，每個基因的表達通過PompA啟動子調控。作為具有大腸桿菌的半胱氨酸脫巰基酶活性的蛋白質，已知胱硫醚裂合酶(metC產物，日本特開平11-155571號公報，Chandra等，Biochemistry,21 (1982) 3064-3069)、色氨酸酶(tnaA 產物，日本特開 2003-169668 號公報，Austin Newton等，J.Biol.Chem.，240 (1965) 1211-1218))、0_乙酰絲氨酸硫化氫解酶B (cysM基因產物，H本特開2005-245311號公報)和maH基因產物(日本特開2005-245311)。通過降低這些蛋白質的活性提高L-半胱氨酸生產能力。在本發明中，L-半胱氨酸生產菌優選具有對反饋抑制有抗性的突變型SAT。作為衍生自大腸桿菌的且對反饋抑制有抗性的突變型SAT，具體已知用谷氨酸殘基取代第256位的甲硫氨酸的突變型SAT (日本特開平11-155571號公報)、用異亮氨酸殘基取代第256位的甲硫氛酸殘基的突變型 SAT(Denk, D.and Boeck, A.，J.general Microbiol., 133,515-525 (1987))、在第97位氨基酸殘基至第273位氨基酸殘基的區域具有突變或者缺失從第227位的氨基酸殘基開始的C端區域的突變型SAT(國際專利公開W097/15673，美國專利6，218，168)、對應于野生型SAT第89至96位的氨基酸序列含有一個或多個突變并且對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的突變型SAT(美國專利公開申請20050112731 (Al))、SAT第95和96位的Val殘基和Asp殘基分別用Arg殘基和Pro殘基取代的突變型SAT (突變型基因的名稱:cysE5，W02005/007841)、在第167位的蘇氨酸殘基用丙氨酸殘基取代的突變(美國專利公開6，218，168，美國專利公開申請20050112731 (Al))，等等。SAT基因不限于大腸桿菌的基因，而是可以使用編碼具有SAT活性的蛋白質的任何基因。例如，已知對L-半胱氨酸的反饋抑制脫敏的擬南芥(Arabidopsisthaliana)的SAT同工酶，也可以使用編碼該同工酶的基因(FEMS Microbiol.Lett.，179，453-459(1999))。通過在細菌中導入編碼SAT的基因、特別是編碼反饋抑制抗性的突變型SAT的基因并使之表達，能夠賦予或增強L-半胱氨酸生產能力。此外，通過提高編碼SAT等蛋白質的基因的拷貝數，能夠提高這些蛋白質的活性。以L-半胱氨酸作為起始物質生物合成的Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、以及高半胱氨酸等化合物的生產能力，也可以通過增強目的化合物的生物合成途徑的酶活性，或者降低從該生物合成途徑分支出來的途徑的酶或分解目的化合物的酶的活性來賦予或增強。例如，Y-谷氨酰半胱氨酸生產能力可以通過Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的增強和/或谷胱甘肽合成酶活性的降低來增強。此外，谷胱甘肽生產能力可以通過Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性的增強來賦予或增強。此外，通過使用對谷胱甘肽的反饋抑制有抗性的突變型Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶，也可以增強Y-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽的生產能力。關于谷胱甘肽的生產，在Li等的綜述(Yin Li,GongyuanWei, Jian Chen.Appl Microbiol Biotechnol (2004)66:233-242)中有詳細記載。胱硫醚、高半胱 氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途徑的中間體，為了增強這些物質的生產能力，部分利用后述的增強L-甲硫氨酸的生產能力的方法是有效的。作為增強胱硫醚生產能力的具體的方法，已知有使用甲硫氨酸營養缺陷性突變株的方法(特愿2003-010654)、在發酵培養基中添加半胱氨酸(或其生物合成原料)和/或高絲氨酸(或其生物合成原料)的方法(特開2005-168422)。高半胱氨酸以胱硫醚作為前體，因而為了增強高半胱氨酸生產能力，增強胱硫醚生產能力的上述方法也是有效的。L-甲硫氨酸生產能力的賦予或增強、以及L-甲硫氨酸生產菌生產L-甲硫氨酸的能力可以通過賦予L-蘇氨酸營養缺陷性或正亮氨酸抗性而賦予或提高(日本特開2000-139471號)。在大腸桿菌中，L-蘇氨酸的生物合成中涉及的酶的基因作為蘇氨酸操縱子(thrABC)存在，并且喪失了 L-高絲氨酸生物和下述化合物合成能力的L-蘇氨酸營養缺陷型菌株可以通過例如缺失thrBC部分而獲得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了 S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，并且賦予或提高了生產L-甲硫氨酸的能力。在大腸桿菌中，S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因編碼的。生產L-甲硫氨酸的能力還可以通過缺失甲硫氨酸阻抑物或通過提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如高絲氨酸轉琥珀酰基酶、胱硫醚Y-合成酶和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II的活性而賦予或提高(特開2000-139471)。在大腸桿菌中，甲硫氨酸阻抑物是由metj基因編碼的，高絲氨酸轉琥珀酰基酶是由metA基因編碼的，胱硫醚Y -合成酶是由metB基因編碼的，天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II是由metL基因編碼的。此外，通過使用對L-甲硫氨酸的反饋抑制有抗性的突變型高絲氨酸轉琥珀酰基酶，還可以賦予或提高生產L-甲硫氨酸的能力(特開2000-139471號、US20090029424)。由于經由L-半胱氨酸作為中間體生物合成L-甲硫氨酸，生產L-甲硫氨酸的能力還可以通過提高生產L-半胱氨酸的能力得以提高(特開2000-139471號，US20080311632)。因此，對于賦予或提高生產L-甲硫氨酸的能力，賦予或增強生產L-半胱氨酸的能力也是有效的。L-甲硫氨酸生產菌和用于構建它們的親本株的具體實例包括如下的大腸桿菌，如AJ11539(NRRL B-12399),AJl1540(NRRL B-12400),AJl1541(NRRL B-12401),AJl1542(NRRLB-12402)(英國專利2075055)，對作為L-甲硫氨酸類似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄羅斯專利 2209248)，和 73 菌株(VKPM B-8126，俄羅斯專利 2215782)。此外，作為L-甲硫氨酸生產菌或用于構建該菌的親本株，也可以使用源自大腸桿菌W3110的AJ13425(FERM P-16808，特開 2000-139471 號(US7611873))。AJ13425 是一種 L-蘇氨酸營養缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削弱了胞內S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞內高絲氨酸轉琥珀酰基酶活性、胱硫醚Y-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶II活性。AJ13425已 于平成10年5月14日保藏于通產省工業技術院生命工學工業技術研究所(現名:產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，地址:郵政編碼305-8566茨城縣筑波市東I 丁目I番地I中央第6，日本)，并給予保藏號FERM P-16808。此外，以L-甲硫氨酸作為起始物質生物合成的S-腺苷甲硫氨酸等化合物的生產能力，也可以通過增強目的化合物的生物合成途徑的酶活性，或者降低從該生物合成途徑分支出來的途徑的酶或分解目的化合物的酶的活性來賦予或增強。例如，S-腺苷甲硫氨酸生產能力可以通過強化甲硫氨酸腺苷轉移酶(EP0647712、EP1457569)、強化分泌因子MdfA(US7410789)來賦予或增強。yeeE基因編碼的蛋白質的活性的增強本發明的細菌可以通過對諸如上述的具有生產含硫氨基酸的能力的屬于腸桿菌科的細菌進行修飾而增強yeeE基因編碼的蛋白質(以下，也記作“YeeE”或“YeeE蛋白質”)的活性來獲得。而且，也可以在進行修飾而增強YeeE蛋白質的活性后，再賦予或增強生產含硫氨基酸的能力。“yeeE基因編碼的蛋白質的活性增強”是指:yeeE基因編碼的YeeE蛋白質的活性相對于野生株或親本株等非修飾株增強。蛋白質的活性與非修飾株相比增強即可，沒有特殊限制，與非修飾株相比優選增強1.5倍以上、更優選2倍以上、更優選3倍以上。此外，“yeeE基因編碼的蛋白質的活性增強”不僅包括在原本具有YeeE蛋白質的活性的菌株中增強YeeE蛋白質的活性，也包括在原本不存在YeeE蛋白質的活性的菌株中賦予YeeE蛋白質的活性。S卩，例如，Pantoea ananatis不具有yeeE基因，也包括在Pantoea ananatis中賦予YeeE蛋白質的活性。增強YeeE蛋白質的活性這樣的修飾可以通過例如增強yeeE基因的表達來實現。用于增強yeeE基因的表達的修飾可以通過例如，利用基因重組技術，提高細胞中的基因的拷貝數來進行。例如，可以將含yeeE基因的DNA片段與在宿主細菌中發揮功能的載體、優選多拷貝型載體連接，制作重組DNA，并將其導入細菌，進行轉化。作為所述載體，可以列舉出可在宿主細菌的細胞內自主復制的載體。作為可在大腸桿菌細胞內自主復制的載體，可以列舉出 pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184 (pHSG、pACYC 可從TAKARA Bio 公司獲得)、RSFlO 10、pBR322、pMW219 (pMW219 可從 NIPPON GENE 公司獲得)、pSTV29(可從TAKARA Bio公司獲得)等。將重組DNA導入細菌，可以按照已經報告的轉化法來進行。例如也可以應用，用氯化鈣處理受體菌細胞來增加DNA的透過性的方法，該方法已被報道用于大腸桿菌K-12 (MandeI, Eand Higa, A.，J.Mol.Biol.，53，159 (1970))，或者從處于增殖階段的細胞制備感受態細胞并導入DNA的方法，該方法已被報道用于枯草芽孢桿菌(Duncan，C.H.，Wilson, G.A.and Young, F.E.，Gene，1，153 (1977))。或者，還可以應用將 DNA 受體菌的細胞制備成容易導入重組DNA的原生質體或原生質球的狀態，再將重組DNA導入DNA受體菌的方法，該方法已知用于枯草桿菌、放線菌類和酵母(Chang, S.and Choen, S.N.,Molec.Gen.Genet., 168, 111 (1979) ；Bibb, M.J., Ward, J.M.and Hopwood, 0.A., Nature,274, 398 (1978) ；Hinnen, A.，Hicks, J.B.and Fink, G.R.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 75,1929(1978))。另一方面，提高yeeE基因的拷貝數還可以通過使細菌的基因組DNA上存在多個拷貝的yeeE基因來實現。為了將多個拷貝的yeeE基因導入到細菌的基因組DNA上，可以利用基因組DNA上以多·拷貝存在的序列作為靶標，通過同源重組來進行。作為基因組DNA上以多拷貝存在的序列，可以利用重復DNA (repetitive DNA)、存在于轉座元件端部的反向重復序列。此外，可以隨機連接在基因組上存在的yeeE基因的近旁，也可以重復地插入到基因組上的非必要的基因上。這些基因導入可以使用溫度敏感型載體、或者使用整合載體來實現。或者，還可以如特開平2-109985號公報所公開的那樣，將yeeE基因裝載在轉座子中，使其發生轉移，從而將多個拷貝導入基因組DNA中。基因轉移到了基因組上的事實，可以通過以yeeE基因的一部分為探針進行Southren雜交來予以確認。而且，yeeE基因的表達的增強除了上述的基因拷貝數的擴增以外，還可以按照國際公開00/18935號小冊子記載的方法，通過下述方法來實現:將基因組DNA上或質粒上的yeeE基因的各啟動子等表達調控序列更換為強力的；使各基因的-35、-10區域接近共有序列；擴增使得yeeE基因的表達提高的調節子，或缺失或弱化使得yeeE基因的表達降低的調節子。作為強力的啟動子，已知有例如，Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、araBA啟動子、λ噬菌體的PR啟動子、PL啟動子、tet啟動子、Τ7啟動=」φ 啟動子等。此外，也可以使用大腸桿菌的蘇氨酸操縱子的啟動子。此外，還可以在yeeE基因的啟動子區域、SD區域導入堿基取代等，將其修飾成更強力的。例如，也可以將SD區域的序列直接替換成φΙΟ啟動子下游的SD區域的序列。啟動子強度的評價方法和強力啟動子的例子記載于Goldstein 等的論文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等中。而且，已知核糖體結合位點(RBS)與起始密碼子之間的間隔、特別是起始密碼子臨近上游的序列中數個核苷酸的取代對mRNA的翻譯效率有非常大的影響，可以對其進行修飾來提高翻譯效率。yeeE基因的啟動子等的表達調節區域也可以使用啟動子檢索載體、GENETYX等基因解析軟件來確定。通過這些啟動子取代或修飾可以強化yeeE基因的表達。表達調控序列的取代可以采用例如使用溫度敏感型質粒的方法、Red驅動整合法(W02005/010175)。使yeeE基因的表達量增大的修飾也可以通過例如，將yeeE基因的表達正調節調控因子、負調控調控因子模塊化來實現。例如，作為調控因子，可以列舉出屬于LysR家族等的，可以利用數據庫EcoCyc (http://ecocyc.0rg/)等來發現。通過調控因子的模塊化可見yeeE基因的轉錄量的增大、YeeE蛋白質的量的增大即可。yeeE基因的表達增強的事實可以通過確認yeeE基因的轉錄量增大、或確認YeeE蛋白質的量增大來確認。yeeE基因的轉錄量增大的確認可以通過將從該基因轉錄的mRNA的量與野生株、或者非修飾株相比較來進行。作為評價mRNA的量的方法,可以列舉出Northern雜交、RT-PCR 等(Molecular cloning(Cold spring HarborLaboratory Press, Cold springHarbor(USA) ,2001))。mRNA的量優選與非修飾株相比，增大至例如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。YeeE蛋白質的量增大的確認可以使用抗體通過蛋白質印跡“Westernblotting”來進行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold springHarbor (USA)，2001))。蛋白質的量優選與非修飾株相比，增大至例如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。而且，對于上述的編碼SAT等的基因，也可以采用同樣的方法將重組DNA導入細菌，此外，可以提聞基因的拷貝數。 大腸桿菌K12MG1655株的yeeE基因相當于以GenBank登錄號NC_000913 (VERSIONNC_000913.2G1:49175990)登錄NCBI數據庫的基因組序列中的2082491 2083549位的序列的互補序列。大腸桿菌K12MG1655株的yeeE基因與ECK2007、JW1995同義。此外，大腸桿菌 K12MG1655 株的 YeeE 蛋白質以 GenBank 登錄號 NP_416517 (version NP_416517.1GI:16129954、locus_tag= “b2013”)登錄。所述MG1655株的yeeE基因的堿基序列、以及編碼該基因的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:13以及14所示。由于yeeE基因的堿基序列會由于細菌所屬的屬、種或菌株而不同，所以接受使YeeE蛋白質的活性增強的修飾的yeeE基因可以為SEQ ID NO:13的堿基序列的變體。yeeE基因的變體可以通過使用BLAST (http://blast.genome, jp/)等參照SEQ ID NO:13的堿基序列進行檢索。此外，yeeE基因的變體包括該基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如屬于腸桿菌科的細菌、棒狀桿菌型細菌的染色體作為模板，基于例如SEQ ID N0:13的堿基序列制備的合成寡核苷酸通過PCR擴增的基因。作為大腸桿菌以外的細菌的yeeE基因同源物的例子，可以列舉出以下的細菌的yeeE基因(表1)。表1中，同一性(%)是基于BLAST的大腸桿菌K12株的YeeE蛋白質(SEQID NO: 14)與各細菌的同源物之間的同一性。登錄號是NCBI數據庫的登錄號。[表1]表權利要求
1.一種屬于腸桿菌科的細菌，其具有生產含硫氨基酸的能力，且經過修飾而增強了yeeE基因編碼的蛋白質的活性。
2.權利要求1所述的細菌，其中，所述蛋白質的活性是通過增大yeeE基因的表達量或者增大yeeE基因的翻譯量而增強的。
3.權利要求2所述的細菌，其中，yeeE基因的表達量是通過提高yeeE基因的拷貝數或者對yeeE基因的表達調控序列進行修飾而增大的。
4.權利要求1 3中任一項所述的細菌，其中，所述蛋白質是下述㈧或⑶所述的蛋白質: (A)由SEQID NO:14所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (B)由在SEQID NO:14所示的氨基酸序列中包含I個或數個氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列組成、且在細胞內的活性增強時生產含硫氨基酸的能力提高的蛋白質。
5.權利要求1 4中任一項所述的細菌，其中，所述yeeE基因是下述(a)或(b)所述的 DNA: (a)由SEQID NO: 13所不的喊基序列組成的DNA ； (b)能夠在嚴格條件下與SEQID NO:13所示的堿基序列的互補堿基序列或能夠由該堿基序列制備的探針雜交、且編碼在細胞內的活性增強時生產含硫氨基酸的能力提高的蛋白質的DNA。
6.權利要求1 5中任一項所述``的細菌,其還具備下述性質中的至少任意一個: i)經過修飾而提高了絲氨酸乙酰轉移酶活性； ii)經過修飾而提高了ydeD基因的表達； iii)經過修飾而提高了3-磷酸甘油酸脫氫酶活性。
7.權利要求1 6中任一項所述的細菌，其中，所述細菌是埃希氏菌屬細菌。
8.權利要求7所述的細菌，其中，所述細菌是大腸桿菌。
9.權利要求1 6中任一項所述的細菌，其中，所述細菌是泛菌屬細菌。
10.權利要求9所述的細菌,其中，所述細菌是Pantoeaananatis。
11.含硫氨基酸、含硫氨基酸的關聯物質或它們的混合物的制造方法， 其中，在培養基中培養權利要求1 10中任一項所述的細菌，并從該培養基收集含硫氨基酸、含硫氨基酸的關聯物質或它們的混合物。
12.權利要求11所述的方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸。
13.權利要求11所述的方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸，所述關聯物質是胱氨酸或噻唑烷衍生物。
全文摘要
開發提高細菌的生產含硫氨基酸的能力的新技術，提供含硫氨基酸生產菌、以及使用該細菌的含硫氨基酸等化合物的制造方法。通過在培養基中培養具有生產含硫氨基酸的能力，且經過修飾而增強了yeeE基因編碼的蛋白質、例如下述(A)或(B)所述的蛋白質的活性的屬于腸桿菌科的細菌，并從該培養基收集含硫氨基酸或其關聯物質、或它們的混合物，來制造這些化合物。(A)由SEQ ID NO14所示的氨基酸序列組成的蛋白質。(B)在SEQ ID NO14所示的氨基酸序列中，包含1個或數個氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列由組成的、且增強在細胞內的活性時生產含硫氨基酸的能力提高的蛋白質。
文檔編號C12N15/09GK103119154SQ20118004424
公開日2013年5月22日 申請日期2011年9月13日 優先權日2010年9月14日
發明者野中源 申請人:味之素株式會社