專利名稱：一種抗海水養殖動物弧菌病的混合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發明屬于細菌抗原制品及其制備，特別是涉及一種抗海水養殖動物弧菌病疫苗制品及其制備方法。
弧菌病是海水養殖動物中常見的流行病，在現有的技術中，僅見有鰻弧菌疫苗的生產和應用。鰻弧菌疫苗在水產養殖生產中具有較專一的抗弧菌特異性，對抗鰻弧菌引起的疾病具有較高的抗性，但正是由于其作用專一，對其它弧菌致病菌引起的疾病的防御作用較差，在生產應用中存在非常明顯的局限性。此外，傳統的細菌疫苗的生產工序上在最后環節加入滅活用藥物，殘留于疫苗中，導致存在副作用。
本發明的目的在于提供一種能免疫于多種水產養殖動物，廣譜地防御多種弧菌侵襲的疫苗及其制備方法，以克服現有抗弧菌病疫苗所存在的問題。
本發明所提供的疫苗是一種混合疫苗，其特征在于由下列各弧菌菌種的單一抗原中的二種或二種以上混合而成，所述的弧菌菌種包括創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、細小弧菌、河弧菌、哈弧菌和鰻弧菌，混合疫苗中各單一抗原每種含細菌量為1×107～2.5×109個/ml。
本發明優選的混合疫苗為創傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌三種弧菌的單一抗原的混合疫苗。
本發明另一優選混合疫苗為創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌四種弧菌的單一抗原的混合疫苗。
本發明所述的混合疫苗中各單一抗原每種菌的最佳控制含量為0.5×109～1.5×109個/ml。
本發明所述的混合疫苗的制備方法按如下步驟進行(1)分別制備每一弧菌菌種的單一抗原(1．1)將弧菌菌種接種于培養基，置于搖床培養24～48小時，培養條件為溫度28～37℃，搖床轉速100～250轉/分；(1．2)向培養物加入1～10％(V/V)的甲醛溶液滅活，并置于50～80℃水浴2～6小時；(1．3)將滅活后的培養物5000～10000轉/分離心后用PBS溶解，再離心，重復若干次(一般為3次)以除去滅活藥物；
(1．4)將最后離心所得的沉淀物用PBS溶解收集，即得單一菌種所生成的抗原；(2)將用上述方法制備所得的各種弧菌單一抗原按每種菌1×107～2.5×109個/ml的濃度(即每毫升含細菌量)相混合即得所述的混合疫苗。
上述步驟(1.4)中一般按沉淀物濕重(W)∶PBS(V)=1∶25的比例用PBS溶解收集沉淀物得單一抗原。
步驟(2)各種弧菌單一抗原最好按每種菌0.5×109～1.5×109個/ml的優選濃度相混合制得所述的混合疫苗。
實際應用時可將按上述方法所制備的混合疫苗加入適當防腐劑以利于保存。
本發明所制備的混合疫苗，對多種水產養殖動物有良好的免疫效果，能廣譜地防御多種弧菌的侵襲。實際試驗表明，應用本混合疫苗，能大大降低水產養殖動物的死亡率，平均提高存活率20％以上，對各種弧菌致病菌引起的疾病防御保護效果顯著。本發明的疫苗制備方法還避免了使疫苗殘留滅活藥物的傳統疫苗生產工藝的弊端。
下面結合實施例對本發明進行詳細說明實施例一制備創傷弧菌單一抗原取經活化的創傷弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在28℃，100轉/分，培養48小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于50℃水浴6小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例二制備溶藻弧菌單一抗原取經活化的溶藻弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃，240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例三制備細小弧菌單一抗原取經活化的細小弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃，240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例四制備河弧菌單一抗原取經活化的河弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃，240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例五制備鰻弧菌單一抗原取經活化的鰻弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃，240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例六制備哈弧菌單一抗原取經活化的哈弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃,240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例七制備副溶血弧菌單一抗原取經活化的副溶血弧菌30ml，接種于3000ml經過濾的液體蛋白胨培養基，置于搖床中，在37℃,240轉/分，培養24小時，終止培養，在培養物中加入甲醛液30ml，置于80℃水浴2小時，然后取出，于冷凍離心機離心30分鐘(10000轉/分)，獲得沉淀物稱重，加入20倍PBS,10000轉/分離心，重復3次，獲細菌濕重約45克，加入PBS 1200ml溶解，得單一抗原。
實施例八本實施例提供一種混合疫苗，是由創傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌3種弧菌的單一抗原混合而成的混合疫苗，3種抗原每種含細菌量均為1×109個/ml。
制備方法1、先制備創傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌3種弧菌的單一抗原，分述如下(1)按實施例一的方法制備創傷弧菌單一抗原(2)按實施例二的方法制備溶藻弧菌單一抗原；(3)按實施例七的方法制備副溶血弧菌單一抗原；2、制備混合疫苗根據上述制備的3種單一抗原，分別測定含量(每毫升含細菌量)，按每種抗原最終濃度為1×109個/ml相混合，即得本混合疫苗。
實施例九本實施例提供一種混合疫苗，是由創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌4種弧菌的單一抗原混合而成的混合疫苗，4種抗原每種含細菌量分別為1×109個/ml、1.5×109個/ml、1×108個/ml、5×107個/ml。
制備方法1、先制備創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌4種弧菌的單一抗原(1)按實施例一的方法制備創傷弧菌單一抗原；(2)按實施例二的方法制備溶藻弧菌單一抗原；(3)按實施例七的方法制備副溶血弧菌單一抗原；(4)按實施例五的方法制備鰻弧菌單一抗原；2、制備混合疫苗根據上述制備的4種單一抗原，分別測定含量(每毫升含細菌量)，按4種菌的含量分別為1×109個/ml(創傷弧菌)、1.5×109個/ml(溶藻弧菌)、1×108個/ml(副溶血弧菌)、5×107個/ml(鰻弧菌)相混合，即得本混合疫苗。
實施例十本實施例提供一種混合疫苗，是由溶藻弧菌、細小弧菌和哈弧菌3種弧菌的單一抗原混合而成的混合疫苗，3種抗原每種含細菌量分別為5×108個/ml、1.5×109個/ml、1×109個/ml。
制備方法
1、先制備溶藻弧菌、細小弧菌和哈弧菌3種弧菌的單一抗原(1)按實施例二的方法制備溶藻弧菌單一抗原；(2)按實施例三的方法制備細小弧菌單一抗原；(3)按實施例六的方法制備哈弧菌單一抗原2、制備混合疫苗根據上述制備的3種單一抗原，分別測定含量(每毫升含細菌量)，按3種菌的含量分別為5×108個/ml(溶藻弧菌)、1.5×109個/ml(細小弧菌)、1×109個/ml(哈弧菌)相混合，即得本混合疫苗。
實施例十一本實施例提供一種混合疫苗，是由創傷弧菌、溶藻弧菌、細小弧菌、河弧菌、鰻弧菌、哈弧菌和副溶血弧菌7種弧菌的單一抗原混合而成的混合疫苗，7種抗原每種含細菌量分別為1×109個/ml、2×107個/ml、1×108個/ml、5×108個/ml、1×109個/ml、1×109個/ml、2×109個/ml。
制備方法1、先制備創傷弧菌、溶藻弧菌、細小弧菌、河弧菌、鰻弧菌、哈弧菌和副溶血弧菌7種弧菌的單一抗原，分述如下(1)按實施例一的方法制備創傷弧菌單一抗原；(2)按實施例二的方法制備溶藻弧菌單一抗原；(3)按實施例三的方法制備細小弧菌單一抗原；(4)按實施例四的方法制備河弧菌單一抗原；(5)按實施例五的方法制備鰻弧菌單一抗原；(6)按實施例六的方法制備哈弧菌單一抗原；(7)按實施例七的方法制備副溶血弧菌單一抗原；2、制備混合疫苗根據上述制備的7種單一抗原，分別測定含量(每毫升含細菌量)，按每種抗原最終濃度為1×109個/ml(創傷弧菌)、2×107個/ml(溶藻弧菌)、1×108個/ml(細小弧菌)、5×108個/ml(河弧菌)、1×109個/ml(鰻弧菌)、1×109個/ml(哈弧菌)、2×109個/ml(副溶血弧菌)相混合，即得本混合疫苗。
權利要求
1．一種抗海水養殖動物弧菌病的混合疫苗，其特征在于由下列各弧菌的單一抗原中的二種或二種以上混合而成，所述的弧菌菌種包括創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、細小弧菌、河弧菌、哈弧菌和鰻弧菌，混合疫苗中各單一抗原每種含細菌量為1×107～2.5×109個/ml。
2．根據權利要求1所述的混合疫苗，其特征在于所述的混合疫苗為創傷弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌三種弧菌的單一抗原的混合疫苗。
3．根據權利要求1所述的混合疫苗，其特征在于所述的混合疫苗為創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌四種弧菌的單一抗原的混合疫苗。
4．根據權利要求1或2或3所述的混合疫苗，其特征在于所述的混合疫苗中各單一抗原每種含細菌量為0.5×109～1.5×109個/ml。
5一種權利要求1所述的混合疫苗的制備方法，其特征在于(1)分別制備每一弧菌菌種的單一抗原(1．1)將弧菌菌種接種于培養基，置于搖床培養24～48小時，培養條件為溫度28～37℃，搖床轉速100～250轉/分；(1．2)向培養物加入1～10％(V/V)的甲醛溶液滅活，并置于50～80℃水浴2～6小時；(1．3)將滅活后的培養物5000～10000轉/分離心后用PBS溶解，再離心，重復若干次以除去滅活藥物；(1．4)將最后離心所得的沉淀物用PBS溶解收集，即得單一菌種所生成的抗原；(2)將用上述方法制備所得的各種弧菌單一抗原按每種菌1×107～2.5×109個/ml的濃度相混合即得所述的混合疫苗。
6．根據權利要求5所述的混合疫苗的制備方法，其特征在于步驟(1.4)中按沉淀物濕重(W)∶PBS(V)=1∶25的比例用PBS溶解收集沉淀物得單一抗原。
7．根據權利要求5所述的混合疫苗的制備方法，其特征在于步驟(2)中，各種弧菌單一抗原按每種菌0.5×109～1.5×109個/ml的濃度相混合制得所述的混合疫苗。
全文摘要
本發明提供一種抗海水養殖動物弧菌病的混合疫苗及其制備方法。該混合疫苗是由創傷弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、細小弧菌、河弧菌、哈弧菌和鰻弧菌等各弧菌菌種的單一抗原中的二種或二種以上混合而成,本發明所制備的混合疫苗,對多種水產養殖動物有良好的免疫效果,能廣譜地防御多種弧菌的侵襲。本發明所提供的該疫苗的制備方法還避免了使疫苗殘留滅活藥物的傳統疫苗生產工藝的弊端。
文檔編號A61P31/04GK1311036SQ0011408
公開日2001年9月5日 申請日期2000年2月29日 優先權日2000年2月29日
發明者吳灶和, 鄒曉理, 吳建平 申請人:中國科學院南海海洋研究所