專利名稱：一種動物用凍干活疫苗的制造方法
技術領域：
本發明是一種動物用凍干活疫苗的制造方法，屬于動物用病毒活疫苗制造領域。
雞新城疫是雞的一種急性傳染病，世界各地均有流行，該病是由副粘病毒科的雞新城疫病毒所引起，本病傳播快，尤其易感雛雞，死亡率高達100％，對養雞業危害極大。
對此種病毒性傳染病無特效藥物治療，用疫苗對雞進行預防接種是最好的方法。這類疫苗有減毒活疫苗和滅活疫苗兩種，活疫苗有雞新城疫I系、II系、F系、LaSota系等弱毒活疫苗。這些活疫苗的基本制造方法是將不同品系的弱毒毒種接種于10日齡發育良好的無特異性病原(specific pathogen free-SPF)的雞胚或無新城疫抗體的健康雞胚尿囊腔內，在37℃繼續孵化至60-120小時后收獲雞胚尿囊液作為抗原，與一定比例量的凍干保護劑混合后、分裝經真空凍干而成。
為成功的冷凍干燥微生物類生物制品，選擇適宜懸浮的凍干保護劑是必不可少的，因為凍干保護劑能夠使生物制品在凍干過程中保持最低限度死亡，減輕冷凍干燥所引起的對微生物的損傷，在保存時耐受較高溫度不損害制品的質量。因而凍干保護劑的種類、濃度和配制方法等對生物制品的保存效果有明顯的影響。Harrison(1963)推薦凍干保護劑應具備以下條件①保護劑應含有能形成骨架的物質；②它應含有限制剩余水分的緩沖物質；③應含有中和羧基活性的物質；④電解質的含量應少。
動物用病毒凍干活疫苗制品的保存，國內一般采用在-15℃保存，可保持制品的質量在1-1.5年內變化不大，而保存在2-8℃下，制品的保存期則減短；國外多在2-8℃保存1.5-2年，制品質量較穩定。國內外所用凍干保護劑大多數是以脫脂奶粉、乳糖、水解乳蛋白、蔗糖等為主要基質原料，約占保護劑總量的10-20％；凍干過程中國內多采用相對較短時間的凍干曲線，而國外則采用相對較長時間的凍干曲線。
本發明的目的是通過多種凍干保護劑基質與動物病毒疫苗制苗病毒毒株所制取的病毒抗原進行了相溶性研究，找出合適的基質，設計一種凍干保護劑的配方，配制成的凍干保護劑，采用與之相適應的凍干曲線。用該保護劑與動物疫苗病毒抗原制成活疫苗按一定凍干曲線凍干后所成的活疫苗在2-8℃條件下長期保存，以取代我國目前雞動物用活疫苗需在-15℃條件下的保存問題。
本發明的技術特征是以雞新城疫弱化病毒種毒稀釋后，接種于10日齡發育良好的無特異性病原(specific pathogen free-SPF)的雞胚或無新城疫抗體的健康雞胚尿囊腔內，在37℃繼續孵化至60-120小時后收獲雞胚尿囊液作為抗原，與本發明所設計的凍干保護劑按一定比例混合后、分裝在按本發明所設計的凍干曲線經真空凍干而制成預防雞新城疫的活疫苗。
凍干保護劑的設計本發明所設計的凍干保護劑有一個十分耐熱的骨架結構，在100℃經過30分鐘該骨架結構不變形；同時具有與該骨架結構相吻合、能保護病毒的小分子物質和緩沖系統。同時在本配方中還添加有防止凍干后產品出現鱗片狀結晶的防晶劑。為防止冷凍干燥狀態下的活病毒與空氣中的氧接觸發生死亡而增加了具有抗氧化作用的物質。
凍干保護劑配方如下(W/V)聚乙烯吡咯烷酮5-15g，羧甲基纖維素鈉2-10g，羅望子膠5-15g，谷氨酸鈉20-40g，海藻糖10-15g，維生素C1-5g，甘草素2-15g，MgCI20.0-0.05g，K2HPO41.3g，KH2PO40.05g，雙蒸餾水1000ml。
凍干曲線的設計在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好雞胚液的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，開始升溫，即要求在16小時內升溫至-20℃，爾后以每小時5℃的速度繼續升溫至20℃并維持6小時加塞出箱(整個凍干過程為32小時)。
下面結合動物用病毒活疫苗中使用最多的一種雞新城疫凍干活疫苗生產實例具體說明本發明的技術特征1生產疫苗用毒種及毒種繼代生產用毒種為雞新城疫弱毒株(如雞新城疫中等毒力毒株I系-Mukteswar，雞新城疫低毒力毒株II系、F系、LaSota及C-30株等)，由中國獸藥監察所鑒定、保管和供應，毒種標準符合中華人民共和國農業部部頒獸用生物制品規程(1992年版)(以下稱《(規程》)中規定的標準。2凍干保護劑的配制本保護劑由A和B兩部分組成。
A聚乙烯吡咯烷酮1％，羧甲基纖維素鈉0.2％，羅望子膠0.2％，谷氨酸鈉2％，K2HPO40.13％，KH2PO40.005％，雙蒸餾水50ml，配制后經121℃ 15分鐘高壓滅菌后備用。
B海藻糖1％，維生素C 0.5％，甘草素1％，MgCl29％，蒸溜水50ml，各種成分溶解后過濾除菌備用。
將A和B按1∶1混合后用于配苗。3疫苗制造及凍干3.1雞蛋的選擇和孵化選用SPF雞或無雞新城疫抗體的健康雞所產雞蛋，按《(規程)》規定孵化至10日齡的雞胚。3.2毒種接種取生產用種毒，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4或10-5，每胚尿囊腔內接種0.1ml。接種后密封針孔，置36-37℃繼續孵育。3.3抗原收獲雞胚接種后每天照蛋1次，將在60小時前死亡的雞胚棄去。60小時后，每4-8小時照蛋1次，死亡雞胚隨時取出，直至96-120小時，不論死活胚全部取出，氣室向上直立，置2-8℃冷卻。經冷卻4-24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無菌手術去除氣室部蛋殼，撕去卵殼膜吸取雞胚液，置于滅菌瓶中，加入青、鏈霉素，放入2-8℃處理。經處理的胚液進行無菌檢驗及病毒含量測定。3.4配苗將檢驗合格的胚液濾過，按11加入本發明所設計和制備的凍干保護劑，同時加入適宜的抗生素(同上)，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥。3.5凍干在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好雞胚液的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，開始升溫，即要求在16小時內升溫至-20℃，爾后以每小時5℃的速度繼續升溫至20℃并維持6小時加塞出箱(整個凍干過程為32小時)。
凍干后疫苗每羽份苗病毒含量應≥106EID50。4成品檢驗4.1物理性狀應為微黃色，海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫落，加稀釋液后迅速溶解。4.2無菌檢驗、支原體檢驗、鑒別檢驗及外源病毒檢驗按《規程》中有關規定進行。4.3安全檢驗 下列方法任擇其一4.3.1用雞胚檢驗將疫苗用滅菌生理鹽水稀釋，尿囊內接種10日齡雞胚10個，每胚0.1ml(含10個使用劑量)，接種后24-72小時，雞胚死亡率不超過20％為合格。如死亡率超過20％，可加倍重檢一次，重檢結果死亡率仍超過20％，該疫苗判為不安全。4.3.2用雞檢驗用確無雞新城疫抗體的2-7日齡雛雞20只，分為兩組，第一組10只，每只滴鼻接種5倍稀釋的含毒胚液0.05ml；第二組10只，不接種作為對照，兩組在同條件下分別飼養管理，觀察10日，應無不正常反應。如有非特異性死亡，免疫組與對照組均不應超過1只。4.4效力檢驗下列方法任擇其一。4.4.1用雞胚檢驗將疫苗用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取3個稀釋度分別尿囊內接種10日齡無雞新城疫抗體的雞胚5個，每胚0.1ml，置37℃繼續孵化，48小時以前死亡的雞胚棄去不計，在48-120小時死亡的雞胚，隨時取出，收獲雞胚液，將同一稀釋度的雞胚液等量混合，分別測定紅細胞凝集價。至120小時，取出所有活胚，逐個收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價；凝集價≥1∶160(微量法1∶128)者判為感染，計算半數感染量，每羽份應≥106EID50，疫苗判為合格。4.4.2用雞檢驗用1-2月齡的健康易感雞(紅細胞凝集抑制價應＜1∶4)10只，每只滴鼻接種1/100使用劑量，10-14日后，連同條件相同的未免疫對照雞3只，各肌肉注射10000 EID50的北京株雞新城疫強毒1ml。觀察10-14日，對照雞應全部發病死亡；免疫雞至少保護9只，疫苗判為合格。5剩余水份測定 采用真空烘干法或費休氏法測定，每瓶制品的含水量不應超過4％。6真空度測定 使用高頻火花真空測定器進行密封后玻璃容器裝凍干制品的真空度測定，如容器內出現白色、粉色和紫色輝光，則真空度均屬合格。
實施例1本實施例選用生產用毒種為雞新城疫弱毒株LaSota及C-30株等)，由中國獸藥監察所鑒定、保管和供應，毒種標準符合中華人民共和國農業部部頒獸用生物制品規程(1992年版)(以下稱《規程》)中規定的標準。
凍干保護劑按以下配方及方法配制后備用A聚乙烯吡咯烷酮1％，羧甲基纖維素鈉0.2％，羅望子膠0.2％，谷氨酸鈉2％，K2HPO40.13％，KH2PO40.005％，雙蒸餾水50ml，配制后經121℃ 15分鐘高壓滅菌后備用。
B海藻糖1％，維生素C 0.5％，甘草素1％，MgCl29％，蒸溜水50ml，各種成分溶解后過濾除菌備用。
將A和B按1∶1混合后用于配苗。
接種取生產用LaSota種毒，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4或10-5，接種50枚10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔內接種0.1ml。接種后密封針孔，置36-37℃繼續孵育。
抗原收獲雞胚接種后每天照蛋1次，將在60小時前死亡的雞胚棄去。60小時后，每4-8小時照蛋1次，死亡雞胚隨時取出，直至96-120小時，不論死活胚全部取出，氣室向上直立，置2-8℃冷卻。經冷卻4-24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無菌手術去除氣室部蛋殼，撕去卵殼膜吸取雞胚液，置于滅菌瓶中，加入青、鏈霉素，放入2-8℃處理。經處理的胚液進行無菌檢驗及病毒含量測定。
配苗將檢驗合格的胚液濾過，按1∶1加入本發明所設計和制備的凍干保護劑，同時加入適宜的抗生素(同上)，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥。
凍干在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好雞胚液的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，開始升溫，即要求在16小時內升溫至-20℃，爾后以每小時5℃的速度繼續升溫至20℃并維持6小時加塞出箱(整個凍干過程為32小時)。實施例2本實施例選用生產用毒種為雞新城疫弱毒株LaSota及C-30株等)，由中國獸藥監察所鑒定、保管和供應，毒種標準符合中華人民共和國農業部部頒獸用生物制品規程(1992年版)(以下稱《規程)》)中規定的標準。
凍于保護劑按以下配方及方法配制后備用A聚乙烯吡咯烷酮1％，羧甲基纖維素鈉0.2％，羅望子膠0.2％，谷氨酸鈉2％，K2HPO40.13％，KH2PO40.005％，雙蒸餾水50ml，配制后經121℃ 15分鐘高壓滅菌后備用。
B海藻糖1％，維生素C 0.5％，甘草素1％，MgCl29％，蒸溜水50ml，各種成分溶解后過濾除菌備用。
將A和B按1∶1混合后用于配苗。
接種取生產用LaSota種毒，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4或10-5，接種50枚10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔內接種0.1ml。接種后密封針孔，置36-37℃繼續孵育。
抗原收獲雞胚接種后每天照蛋1次，將在60小時前死亡的雞胚棄去。60小時后，每4-8小時照蛋1次，死亡雞胚隨時取出，直至96-120小時，不論死活胚全部取出，氣室向上直立，置2-8℃冷卻。經冷卻4-24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無菌手術去除氣室部蛋殼，撕去卵殼膜吸取雞胚液，置于滅菌瓶中，加入青、鏈霉素，放入2-8℃處理。經處理的胚液進行無菌檢驗及病毒含量測定。
配苗將檢驗合格的胚液濾過，按1∶1加入本發明所設計和制備的凍干保護劑，同時加入適宜的抗生素(同上)，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥。
凍干在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好雞胚液的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，開始升溫，即要求在16小時內升溫至-20℃，爾后以每小時5℃的速度繼續升溫至20℃并維持6小時加塞出箱(整個凍干過程為32小時)。實施例3本實施例選用生產用毒種為雞新城疫弱毒株LaSota及C-30株等)，由中國獸藥監察所鑒定、保管和供應，毒種標準符合中華人民共和國農業部部頒獸用生物制品規程(1992年版)(以下稱《規程)》)中規定的標準。
凍干保護劑按以下配方及方法配制后備用A聚乙烯吡咯烷酮1％，羧甲基纖維素鈉0.2％，羅望子膠0.2％，谷氨酸鈉2％，K2HPO40.13％，KH2PO40.005％，雙蒸餾水50ml，配制后經121℃ 15分鐘高壓滅菌后備用。
B海藻糖1％，維生素C 0.5％，甘草素1％，MgCl29％，蒸溜水50ml，各種成分溶解后過濾除菌備用。
將A和B按1∶1混合后用于配苗。
接種取生產用LaSota種毒，用滅菌生理鹽水稀釋至10-4或10-5，接種50枚10日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔內接種0.1ml。接種后密封針孔，置36-37℃繼續孵育。
抗原收獲 雞胚接種后每天照蛋1次，將在60小時前死亡的雞胚棄去。60小時后，每4-8小時照蛋1次，死亡雞胚隨時取出，直至96-120小時，不論死活胚全部取出，氣室向上直立，置2-8℃冷卻。經冷卻4-24小時的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，以無菌手術去除氣室部蛋殼，撕去卵殼膜吸取雞胚液，置于滅菌瓶中，加入青、鏈霉素，放入2-8℃處理。經處理的胚液進行無菌檢驗及病毒含量測定。
配苗將檢驗合格的胚液濾過，按1∶1加入本發明所設計和制備的凍干保護劑，同時加入適宜的抗生素(同上)，充分搖勻，定量分裝后立即進行冷凍干燥。
凍干在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好雞胚液的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，開始升溫，即要求在16小時內升溫至-20℃，爾后以每小時5℃的速度繼續升溫至20℃并維持6小時加塞出箱(整個凍干過程為32小時)。
凍干制品的測試1不同保護劑凍干產品的耐熱試驗將不同保護劑凍干的產品，置于100℃、45℃、37℃、2-8℃條件下保存，不同時間取樣，測定病毒含量及其物理性狀。2凍干制品中病毒含量測定方法按實含雞胚液量用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-7、-8、-93個稀釋度各尿囊內接種10日齡無雞新城疫病毒抗體的雞胚5個，每胚0.1ml，置37-38℃繼續孵化，48小時以前死亡的雞胚棄去不計，在48-120小時死亡的雞胚隨時取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細胞凝集價；至120小時，取出所有活胚，逐個收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價，凝集價≥1∶128者判為感染，計算EID50，每0.1ml應含病毒≥EID503凍干制品中病毒含量測定結果見以下各表所列結果。表1凍干制品置于100℃間接煮沸10分鐘后的物理性狀和EID50測定結果保護劑 干后 物理性狀100℃10分鐘 EID509601 108.9疏松海綿狀 未收縮 104.596017 108.5疏松海綿狀 未收縮 104.796051 108.7疏松海綿狀 未收縮 105.496053 108.7疏松海綿狀 未收縮 105.5國內商品苗108.9疏松海綿狀 收縮成膠狀 100國外商品苗1 108.7疏松海綿狀 未收縮 104.1國外商品苗2 108.7疏松海綿狀 收縮成團塊 100表2 凍干前后疫苗于2-8℃保存不同時間EID50凍干后(天) 1-180天 每下降保護劑 干前平均每天 101030 70 180下降滴度 所需天9601109.1108.9108.9108.7108.5100.0024509602109.1108.9108.9108.9108.7100.0019009603109.1108.9108.9108.9108.7100.001900國內商品苗 109.1108.9108.9108.7108.7100.01281表3 凍干前后疫苗于37℃保存不同時間EID50凍干后(天) 1-10天每下降保護劑 平均每天101010 30 下降 所需天96017108.5107.5106.5100.0671596051108.7107.5107.1100.05318.7596053108.7107.5106.3100.0812.5國內商品苗 108.9103.7100100.890.96**以0-5天的數據計表4 凍干前后疫苗于45℃保存不同時間EID50凍干后(天) 1-5天 每下降保護劑干前 平均每天10105 下降所需天9601 109.1108.9105.3100.721.399601 109.1108.9106.1100.561.799601 109.1108.9106.1100.561.79國內商品苗 109.1108.9100101.78國外商品苗1 109.1108.9105.9100.61.67表5 耐熱凍干保護劑凍干疫苗檢驗結果批號 干后EID50保存期 保存后EID50960418109.196.04.1811個月108.7960430109.196.04.3011個月108.9960507108.796.05.0710個月108.3960725108.996.07.258個月 108.8960802108.896.08.027個月 108.9大1 108.596.11.284個月 108.5大2 108.596.11.304個月 108.5大3 109.196.12.044個月 108.5*以上疫苗的保存溫度為2-8℃表1表明用本發明配方制備的凍干保護劑制備的凍干疫苗經過100℃處理后，其物理性狀及EID50測定經過與國外疫苗相同。
表2，3，4結果表明用本發明配方制備的凍干保護劑制備的凍干疫苗在2-8、37及45℃下保存，其EID50價，每下降101，分別約需450-900、15、1.39天，比國內商品苗長5-10倍，達到國外商品苗的水平。
表5結果表明用本發明配方制備的凍干保護劑制備的凍干疫苗在2-8℃下保存近一年，其EID50價尚未有明顯的下降。
權利要求
1 一種預防雞新城疫用的凍干活疫苗的制造方法，其特征在于制造該疫苗采用了以聚乙烯吡咯烷酮，羧甲基纖維素鈉，羅望子膠，谷氨酸鈉，海藻糖等為主要基質凍干保護劑的配方配制成的凍干保護劑，采用與之相適應的凍干曲線與新城疫疫苗病毒抗原制成雞新城疫凍干活疫苗，該苗在2-8℃條件下可長期保存。
2 根據權利要求1所述的疫苗制造方法，其特征是凍干保護劑配方如下(W/V)聚乙烯吡咯烷酮5-15g，羧甲基纖維素鈉2-10g，羅望子膠5-15g，谷氨酸鈉20-40g，海藻糖10-15g，維生素C1-5g，甘草素2-15g，MgCI20.0-0.05g，K2HPO41.3g，KH2PO40.05g，雙蒸餾水1000ml。
3 根據權利要求1所述的疫苗制造方法，其特征是凍干曲線的設計為在凍干箱預先降溫至-5℃，分裝好液體苗的容器進入凍干箱，再以1℃/min的速度降溫至-35℃，在此溫度下維持2小時后，開始抽真空至10-4托后，進行升溫，即要求在14-18小時內升溫至-20℃，爾后以每小時8-5℃的速度繼續升溫至20℃，并維持4-6小時加塞出箱(整個凍干過程為25-32小時)。
全文摘要
本發明是一種動物用的凍干活疫苗的制造方法,屬動物用生物制品制造領域。本發明的目的是通過多種凍干保護劑基質與雞新城疫活疫苗制苗病毒毒株所制取的病毒抗原進行了相溶性研究,找出合適的基質,設計一種新的凍干保護劑的配方,用此配方配制成的凍干保護劑,采用與之相適應的凍干曲線,與新城疫疫苗病毒抗原制成雞新城疫凍干活疫苗在2—8℃條件下可長期保存。
文檔編號A61K47/30GK1176827SQ97116489
公開日1998年3月25日 申請日期1997年9月24日 優先權日1997年9月24日
發明者王棟, 張仲秋 申請人:中國獸藥監察所