一種抗玉米矮花葉病RNAi載體的構建及應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，發明人在分析我國甘蔗花葉病毒（SCMV）基因組群體變異的基礎上，將CI、NIb和CP3個基因的部分片段克隆到載體pCambia3301,構建了RNAi載體p3301-SCMVCINIb1CPRi。該載體轉化大腸埃希氏菌后在中國普通微生物保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏編號為CGMCC?NO.4356。利用該載體轉化玉米可以培育對高抗矮花葉病的轉基因玉米植株。
【專利說明】一種抗玉米矮花葉病RNAi載體的構建及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，具體地說，本發明涉及一種RNA干擾(RNAi)載體，特別涉及一種抗玉米矮花葉病的RNAi載體。
【背景技術】[0002]玉米矮花葉病(Maize dwarf mosaic, MDM)在我國玉米上發生普遍,是玉米生產中面臨的一個重要問題。引起我國玉米矮花葉病的毒原主要是甘蔗花葉病毒(Sugarcanemosaic virus, SCMV)。SCMV屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus),在自然界中主要通過蟲牙蟲和種子傳播，侵染甘蔗和玉米等禾本科作物。SCMV的基因組由一條正單鏈RNA分子組成，有一個大的開放閱讀框(0RF)，可表達產生一個多聚蛋白，然后經翻譯切割成10個成熟蛋白。我國玉米上發生的SCMV大多屬于MDB株系。但近年在山東、河北等地還出現了一個國內外未見報道的新株系，可以侵染我國大多數主栽玉米品種。
[0003]種植抗病品種是防治玉米矮花葉病最有效的措施。但在培育抗病品種時面臨選育周期長、抗病基因匱乏及病毒變異會導致寄主抗病性喪失等問題。利用RNAi技術，通過基因工程手段可以在較短時間內獲得抗病毒材料。
[0004]RNAi是真核生物體內發生的、基于核酸序列同源性的一種基因表達調控機制。雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)是RNAi起始的關鍵因子。它首先被Dicer酶降解為 3'-端具有 2nt 突出的 21-26nt 的小干擾 RNA (small interfering RNA，siRNA)，后者整合入RNA誘導的沉默復合體(RNA-1nduced silencing complex, RISC),并指導RISC對同源RNA進行識別和切割，最終導致RISC降解靶標mRNA。
[0005]形成dsRNA的有效途徑之一是將體外構建的反向重復結構(inverted repeats,IR)轉入植株。轉入植物的反向重復序列在植物體內轉錄形成dsRNA后，啟動RNAi，可有效控制與轉基因有同源性的入侵病毒。反向重復結構由一段間隔序列(spacer)連接兩段反向互補序列構成，轉錄后會形成發夾狀RNA(hairpin RNA,hpRNA)。hpRNA由莖(stem,是反向互補序列轉錄的RNA配對形成的雙鏈)和環(loop,是由spacer轉錄的RNA單鏈結構)組成。hpRNA中的莖是誘發序列特異性基因沉默的關鍵部份，莖的長短影響RNA沉默的效率和穩定性，植物中50-1000bp的dsRNA同源片段均能高效誘發轉錄后基因沉默。轉化IR獲得的抗病植株比例和抗病程度高于轉正義或反義基因。
[0006]RNAi的效率還取決于IR的莖與入侵病毒核酸一致率的高低。轉基因與入侵病毒基因組核苷酸一致率越高，則抗病效果越好。植物RNA病毒在自然界中是以準種形式存在，同一種病毒的基因組可能有一定程度的變異。在構建RNAi載體時，需要針對不同病毒找到最保守的基因，篩選最有效的片斷作為靶標。
[0007]應用RNAi技術培育抗甘蔗花葉病毒的玉米植株，可為有效控制玉米矮花葉病提供幫助。
【發明內容】
[0008]基于上述原因，發明人在分析引起我國玉米矮花葉病的SCMV基因組群體結構的基礎上，從其Cl、NIb和CP等基因中篩選到誘導RNAi最有效的3個片段，其序列分別如Seq ID N0.2、Seq ID N0.3和Seq ID N0.4所示，其中Cl位于SCMV BD8全序列中的4878-5430bp，NIb位于全序列的7652_7892bp，CP位于全序列的9008_9303bp，具體如下
表:
[0009]
【權利要求】
1.一種保藏編號為CGMCC N0.4356的RNAi載體p3301_SCMVCINIblCPRi，其特征在于基因序列如Seq ID N0.1所不。
2.如權利要求1所述的抗玉米矮花葉病RNAi載體在培育抗矮花葉病玉米植株中的應用 。
【文檔編號】A01H5/00GK103451229SQ201310435201
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月22日 優先權日:2013年9月22日
【發明者】李向東, 賈金磊, 張春慶 申請人:山東農業大學