專利名稱：殼囊孢菌素b制法及在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種來源于紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)的殼囊孢菌素B化合物的制備方法及其在制備抗腫瘤和抗真菌藥物中的應用。
(2)背景技術紅樹林是生長在港灣河口地區的淤泥灘涂上的木本植物群落，作為獨特的海陸邊緣生態系統在自然生態平衡中起著特殊的作用。紅樹林植物不僅是重要的經濟植物，也是民間常用的藥用植物，如紅樹植物老鼠簕(Acanthus ilicifolius)的樹皮熬汁可以用于治血尿；角果木(Ceriops tagal)的樹皮搗碎可以止血、通便和治療惡瘡，種子榨油可以止癢和治療癬，還可治療凍瘡等。
紅樹植物中存在著豐富的內生真菌，有報道認為紅樹植物的藥用成分都是由其內生真菌產生的，不多的文獻(1、Brady，S.，Wagenaar，M.W.，Singh，M.，et al.The cytosporonesisolated from an endophytic fungus.Org.Lett.2000，2(25)4043-4046；2、Bandaranayake，W.M..Traditional and medicinal uses of mangroves.Mangroves and Salt Marshes，1998，2133-148；3、Bandaranayake，W.M..Bioactivities，bioactive compounds and chemicalconstituents of mangrove plants.Wetland Ecology and Management，2002，10421-452；4、Lin Y.，Wu X.，Deng z.，et al.The metabolites of the mangrove fungus Verruculina enalia No.2606 from a salt lake in the Bahamas.Phytochemistry，2002，59469-471)報道也已證明紅樹植物的內生真菌確實可以產生具有新結構和強的生理活性的化合物。但目前國內外在這方面的工作才剛剛開始，為此其研究具有較高的理論價值和實際應用價值。
(3)發明內容本發明的目的在于提供一種來源于紅樹植物內生真菌(cytosporone B)的化合物的分離提取方法以及它在制備抗腫瘤藥物和抗真菌藥物中的應用。
本發明所用的紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3)已保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，中國 武漢大學校內)，保藏號為CCTCC NOM203067，保藏日期為2003年8月29日。
本發明所說的殼囊孢菌素B(cytosporone B)化合物的結構式為
(3，5-二羥基-2-辛酮基)-苯乙酸乙酯所說的殼囊孢菌素B化合物的制備方法為1)內生真菌(Dothiorella sp.HTF3)的種子培養培養基以g為單位，馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5～2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，室溫下培養5～15天；2)內生真菌的發酵培養發酵培養基以g為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，室溫下培養5～15天；3)將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；4)菌體烘干，用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
所得該化合物的實驗數據為無色油狀物；EMSm/z(rel.int.)323.3[M+H]+(100)，345.3[M+Na]+(11.4)，361.2[M+K]+(4.2)；1H NMR和13C NMR(400MHz，CDCl3，ppm)見表1。
本發明所說的殼囊孢菌素B化合物可用于制備抗腫瘤藥物，其抗腫瘤活性檢測實驗如下1)腫瘤細胞株人B淋巴瘤Raji細胞、人口腔皮樣癌KB細胞、人成骨肉瘤MG-63細胞、人肺癌A549細胞、人宮頸癌hela細胞等。
表1.殼囊孢菌素B的NMR數據
2)材料a MTT(噻唑藍)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到終濃度5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃避光保存；b SDS裂解液100g十二烷基磺酸鈉(SDS)，1N HCL 10ml，加熱溶解，蒸餾水定容至1000ml。
c 細胞培養基(全培)一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)細胞培養基溶于1L雙蒸水中；加入2gNaHCO3攪勻溶解后封口，置于4℃過夜，以自然沉淀除去雜質；次日加入10％-15％已滅活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混勻后用0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌。
3)化合物cytosporone B的配置取一定量的殼囊孢菌素B，用甲醇溶解并調整濃度為5mg/ml，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，4℃保存備用。
4)腫瘤細胞的培養a 細胞活化
取一干凈燒杯，裝入干凈溫水，水溫調至37～40℃；將凍存管從液氮中取出迅速投入溫水解凍，并將凍存細胞接入預裝有細胞培養基的培養瓶內，在37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養，觀察細胞生長情況，及時更換培養液、分瓶。
b 細胞計數選對數生成期細胞，胰酶消化，移入離心管中，加全培至10ml，取一滴滴入計數板一側凹槽中，倒置顯微鏡下計數。調整細胞數至1×105/ml。
c 活性檢測①96孔板在超凈工作臺內紫外光下照射1h；②在各孔中加入細胞懸液80μl，37℃、5％CO2、100％濕度的條件下培養24h；③加入20μl用全培梯度稀釋成一系列濃度的溶液，繼續培養48h；④每孔加入MTT溶液10μl，輕輕震搖使顆粒溶解，37℃放置3h；⑤取出培養板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解過夜；⑥用酶聯反應儀570nm測定各孔吸光值(參比波長為655nm)，按下列公式計算抑制率抑制率＝(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％⑦以抑制率為縱坐標，受試樣品濃度的對數為橫坐標作圖，求出抑制率為50％時的濃度即為IC50。
d 試驗結果Cytosporone B對人B淋巴瘤Raji細胞、人口腔皮樣癌KB細胞、人成骨肉瘤MG-63細胞、人肺癌A549細胞、人宮頸癌hela細胞的IC50分別是62.5ng/ml、4μg/ml、1μg/ml、4μg/ml和1μg/ml。
本發明所說的殼囊孢菌素B化合物可用于制備抗真菌藥物，其抗真菌活性檢測實驗如下1)真菌指示菌株白色假絲酵母菌、黑曲霉菌、木霉菌、鐮刀菌、交鏈孢霉菌、白色面包霉菌、枝孢霉菌2)化合物cytosporone B的配置取一定量的cytosporone B，用甲醇溶解并調整濃度為1mg/ml，0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，4℃保存備用。
3)活性檢測(最低抑菌濃度MIC的測定)
a 用無菌水將在PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)斜面培養基上生長的各指示菌洗下，制成孢子濃度為107個/ml的菌懸液，4℃保存備用；b cytosporone B的樣品溶液按兩倍稀釋法，用甲醇稀釋成一系列的濃度梯度，取20μl加入到已在超凈工作臺的紫外燈下照射30min的96孔板中。用超凈工作臺的風機鼓風吹干甲醇；c 真菌懸液用PD(馬鈴薯-葡萄糖)培養基稀釋成104個/μl的菌液，取100μl加入到上述96孔板上，25℃培養48h，肉眼觀測，沒有真菌生成的最小稀釋濃度即為MIC。
d 實驗結果cytosporone B對白色假絲酵母菌、黑曲霉菌、木霉菌、鐮刀菌、交鏈孢霉菌、白色面包霉菌、枝孢霉菌的MIC分別是0.156mg/ml、0.125mg/ml、0.0625mg/ml、0.0625mg/ml、0.07mg/ml、0.125mg/ml和1mg/ml。
綜上所述，本發明提供了一類來源于紅樹林內生真菌的化合物的制備方法，產量高，達到9mg/g菌體干重，可以用于工業生產；該化合物對多種人體腫瘤細胞均表現出較好的抑制作用，可用于制備抗這類腫瘤的藥物；該化合物還對人體致病真菌和植物致病真菌有較好的抑制作用，可用于制備這類抗真菌藥物。
(4)具體實施方式
實施例1以下實施例給出所說的殼囊孢菌素B化合物的制備方法。
1)內生真菌的種子培養將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1g，瓊脂1.6g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，25℃下培養10天；2)內生真菌的發酵培養將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，26℃下培養8天；3)將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；4)菌體烘干，用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
實施例2將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1.5g，瓊脂1.8g，50％海水定容至100ml滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，30℃下培養8天；再將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖2.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，20℃下培養15天；將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；菌體烘干后用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
實施例3將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖2.0g，瓊脂1.5g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，28℃下培養15天；再將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖2g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，25℃下培養10天；將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；菌體烘干后用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
實施例4將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖2.5g，瓊脂2.0g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，20℃下培養12天；再將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖1g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，30℃下培養12天將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；菌體烘干后用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
實施例5將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖3.0g，瓊脂1.7g，50％海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，23℃下培養5天；再將20g馬鈴薯去皮、切碎，水煮30min，在過濾后的濾液中加葡萄糖3.0g，50％海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，28℃下培養5天；將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；菌體烘干后用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
權利要求
1.殼囊孢菌素B化合物，所用的紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF3的保藏號為CCTCC NOM203067，其特征在于其結構式為 (3，5-二羥基-2-辛酮基)-苯乙酸乙酯
2.殼囊孢菌素B化合物的制備方法，其特征在于其步驟為1)內生真菌的種子培養培養基以g為單位，馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，瓊脂1.5～2.0，海水定容至100ml，滅菌，制成試管斜面，挑取菌種接入斜面，室溫下培養5～15天；2)內生真菌的發酵培養發酵培養基以g為單位馬鈴薯去皮、切碎20，水煮，在過濾后的濾液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，滅菌，將斜面上培養好的菌株挑入發酵培養基，室溫下培養5～15天；3)將上述發酵培養液過濾除去發酵液后得到菌體；4)菌體烘干，用乙酸乙酯反復浸泡，合并乙酸乙酯，減壓濃縮，所得的膏狀物用硅膠柱層析分離，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100進行梯度洗脫，收集二者比例為1/1時的洗脫液，減壓濃縮即得到該化合物，含量為9mg/g菌體干重。
3.殼囊孢菌素B化合物可用于制備抗腫瘤藥物。
4.殼囊孢菌素B化合物可用于制備抗真菌藥物。
全文摘要
涉及一種來源于紅樹植物內生真菌—小穴殼菌HTF
文檔編號A61K31/21GK1542136SQ200310114048
公開日2004年11月3日 申請日期2003年11月8日 優先權日2003年11月8日
發明者徐慶妍, 鄭忠輝, 宋思揚, 黃耀堅, 蘇文金 申請人:廈門大學