專利名稱：一種抗血栓疾病的中藥制劑及其制備方法
技術領域：
本發明屬于中藥制藥領域，具體涉及一種抗血栓疾病的中藥制劑及其制備方法。
背景技術：
水蛭，為環節動物水蛭科螞蟥的干燥全體，又名螞蟥。味咸苦、性平、有毒，入肝經。功專破血逐瘀通經，為臨床常用的活血祛瘀藥。藥理研究證實本藥含水蛭素，組織胺樣物質，有抗凝血、擴張血管、降低血液的粘稠度的作用。臨床應用較廣，療效較佳。近幾十年來化學成分研究，國外從鮮活日本醫蛭中提取活性成分，其中最重要的是水蛭素(hirdin)，它是迄今為止，世界上最強的凝血酶特效抑制劑，其藥效學、藥代動力學、臨床實驗及毒副作用方面都進行了廣泛深入的研究。國內水蛭成分研究幾近空白，只有賈元印等初步探討過從活水蛭中提取抗凝血物質的方法，張蒞峽等對干水蛭進行了微量元素和氨基酸的分析，水蛭藥材的成分研究尚無報道。國內近年來實驗研究表明，水蛭藥材至少具有下列藥理作用對血液系統具抗凝、纖溶、抑制血小板聚集、降低比粘度、降血脂、抗血栓等作用。水蛭素是迄今為止發現的最強有力的凝血酶抑制劑，還有很強的抗血栓作用，對多種實驗性血栓模型有阻抑作用。水蛭素對于各種血栓疾病如靜脈血栓、彌散性血管內凝血、腦凝血、血栓靜脈炎及冠狀動脈血栓都有預防和治療效果，尤其是靜脈血栓和彌漫性血管內凝血的治療；也可用于外科手術后預防動脈血栓的形成，預防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善體外血液循環和血液透析過程，在顯微外科手術中常因為吻合處血管栓塞而導致失敗，采用水蛭素可促進傷口愈合。
世界抗血栓藥物的市場有不斷上升的趨勢。據世界衛生組織(WHO)統計，全世界每年大約有1200萬人死于心腦血管病，而隨著人口平均壽命的延長，生活環境和膳食習慣變化，心腦血管病的發病率和死亡率正在逐年增高。Datamonitor的一項新的市場研究報告指出，世界抗血栓藥物市場將從1998年的67億美元增加至2005年的93億美元，增長37％。作為抗凝的特效藥，水蛭素的市場前景可見一斑。
專利申請號為03113566和申請號為95117701的專利公開了水蛭提取純化水蛭素的方法，采用凝膠過濾柱層析和親合色譜法純化水蛭素，這兩種方法能夠得到水蛭素，但在實際應用過程中，步驟麻煩，只適用于實驗室，不能進一步中試發大和生產，因此，采用該工藝方法不能開發成新藥，不適合推廣。
發明內容
基于上述原因，本發明采用乙醇提取、超濾法和離子交換法純化得到水蛭醇提有效部位，該方法適合生產與推廣，適合新藥開發工藝。水蛭醇提有效部位和藥物輔料混合制備成凍干粉針劑，藥理實驗結果表明，該粉針劑具有很好的抗血栓作用，與市售同類品種比較具有更強的藥理作用。
本發明是通過以下方案實現的。
一.工藝制法取水蛭，用70％-90％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度40℃-70℃，提取1-3小時，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.1-0.65um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量1000-3000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/2-1/3，加熱水至原體積，保持溫度為40℃-60℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾3-5次，最后一次濃縮至密度為1.10-1.50，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過緩沖液平衡過的陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮備用。取備用原料，按比例加入凍干粉針劑藥用輔料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為0℃-零下70℃，壓力為1.01*105Pa-04*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在百極操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
二.藥理實施例實施例1體外抗凝實驗方法體外抗凝活性的測定參照Markwardt的凝血酶滴定方法進行。于酶標板小孔中加0.5％牛血纖維蛋白原(50mmol/L Tris HCl緩沖液(pH7.4)配制)200μl，再加入100μl本發明凍干粉針劑，充分混勻。用微量進樣器吸取標準的凝血酶溶液(100NIH單位/ml)進行滴定，每次滴定量為5μl(0.5NIH單位)，時間間隔為1min，若在1min內纖維蛋白原發生凝固，即說明已達到滴定終點。由凝血酶的消耗量可以換算出本發明凍干粉針劑的單位數。由于水蛭素與凝血酶是1∶1結合，故每消耗一個凝血酶單位(NIHU)相當于一個抗凝血酶單位(ATU)，結果純化后測得比活為8000ATU/mg實施例2對抗大鼠血栓形成的作用藥品本發明凍干粉針劑(北京乾露春科技有限公司實驗室提供)水蛭注射液(吉林省藥物研究所提供)動物Wistar大鼠，購自北京中醫中藥研究院動物室。
方法取Wistar雄性大鼠45只，體重230～280g，隨機分為3組，每組15只生理鹽水對照組、本發明凍干粉針劑組、水蛭注射液。各組均腹腔注射給藥，每日1次，連續7d，于未次給藥30min后，以3％戊巴比妥鈉30mg·kg-1麻醉大鼠。采用大鼠體外頸總動脈-頸外靜脈旁路法，將大鼠仰臥固定，分離氣管并插管，并分離右頸總動脈及左頸外靜脈，在三段聚乙烯管的中段放入一根6cm絲線，將肝素生理鹽水(50IU/ml)充滿聚乙烯管，當管的一端插入左頸外靜脈后，由聚乙烯管準確注入肝素(50IU/kg)抗凝，然后將聚乙烯管的另一端插入右頸總動脈。打開動脈夾，血液從右頸總動脈流至聚乙烯管，返回左頸外靜脈。放開血流15min后中斷血流，迅速取出絲線稱重。總重量-絲線重＝血栓濕重，并計算抑制率。抑制率＝(對照組血栓濕重-給藥組血栓濕重)/對照組血栓濕重組*100％，結果計算見表1表1各組制劑抗血栓比較
*P＜0.01，**P＜0.01，**與*比較P＜0.05實施例3對小鼠ADP誘導的血栓性死亡的影響藥品本發明凍干粉針劑(北京乾露春科技有限公司實驗室提供)市售銀杏達莫注射液(南京金陵制藥股份有限公司生產，購自北京白塔寺醫藥批發公司)生理鹽水(北京乾露春科技有限公司實驗室提供)方法取健康小鼠60只，雌雄各半，隨機分成3組生理鹽水組、本發明凍干粉針劑組、市售銀杏達莫注射液組每日灌胃，連續7d，于末次給藥后1h尾靜脈注射ADP480mL/kg，記錄動物死亡情況。見表2表2各組制劑對小鼠ADP誘導的血栓性死亡的影響比較
*P＜0.01，**P＜0.01，**與*比較P＜0.05
結論通過以上藥理實驗表明，本發明的中藥凍干粉針劑具有很好的溶栓作用，對血栓具有較強溶解作用，與市售同類品種比較具有更強的藥理作用。
三.制備實施例實施例1取水蛭1000克，用70％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度40℃，提取1小時，提取2次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.1um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量1000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/3，加熱水至原體積，保持溫度為40℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾3次，最后一次濃縮至密度為1.10，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過Tris-HCl緩沖液平衡過的弱陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮，得到水蛭醇提有效部位6.89克，與藥用輔料甘露醇146.36克混合，取備用原料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為零下40℃，壓力為05*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
實施例2取水蛭500克，用90％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度70℃，提取3小時，提取4次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.65um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量3000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/2，加熱水至原體積，保持溫度為60℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾5次，最后一次濃縮至密度為1.50，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡過的強陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮得到水蛭醇提有效部位3.77克，與藥用輔料甘露醇、蔗糖共36.32克混合，取備用原料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為零下50℃，壓力為0.6*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
實施例3取水蛭800克，用80％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度50℃，提取2小時，提取3次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.22um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量2000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/2，加熱水至原體積，保持溫度為50℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾4次，最后一次濃縮至密度為1.30，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過Tris-HCl緩沖液平衡過的強陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮得到水蛭醇提有效部位6.29克，與藥用輔料甘露醇90.48克混合，取備用原料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為零下55℃，壓力為0.45*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
實施例4取水蛭1500克，用75％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度45℃，提取2小時，提取4次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.45um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量3000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/3，加熱水至原體積，保持溫度為45℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾5次，最后一次濃縮至密度為1.40，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡過的弱陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮得到水蛭醇提有效部位12.50克，與藥用輔料蔗糖、乳糖共154.17克混合，取備用原料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為零下60℃，壓力為0.4*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
實施例5取水蛭2000克，用85％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度65℃，提取2小時，提取2次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；取浸膏，用水溶解完全后，用0.22um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量2000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/3，加熱水至原體積，保持溫度為55℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾4次，最后一次濃縮至密度為1.40，得到濃縮液；取濃縮液上樣到經過磷酸一氫鈉-磷酸二氫鈉緩沖液平衡過的弱陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮得到水蛭醇提有效部位17.36克，與藥用輔料蔗糖298.25克混合，取備用原料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中，將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥，凍干機控制溫度為零下45℃，壓力為0.4*105Pa，冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎，將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
權利要求
1.一種抗血栓疾病的中藥制劑，其特征在于該中藥制劑是由水蛭有效部位4.5重量份-9.5重量份，凍干粉針劑藥用輔料90.5重量份-95.5重量份組成的。
2.一種抗血栓疾病的中藥制劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)取水蛭，用70％-90％乙醇浸泡過夜，放入中藥多功能提取罐中，控制溫度40℃-70℃，提取1-3小時，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至盡，得到浸膏；(2)取浸膏，用水溶解完全后，用0.1-0.65um微孔濾膜進行過濾，濾液先用截取分子量1000-3000的中空纖維柱進行超濾，超濾至原體積的1/2-1/3，加熱水至原體積，保持溫度為40℃-60℃，超濾時透過液棄去，循環液超濾3-5次，最后一次濃縮至密度為1.10-1.50，得到濃縮液；(3)取濃縮液上樣到經過緩沖液平衡的陰離子交換柱，穿透液棄去，用0-1.0mol/l的氯化鈉梯度洗脫，洗脫液濃縮備用即為水蛭的有效部位；(4)取備用原料，按比例加入凍干粉針劑藥用輔料，用注射用水溶解完全，進行無菌過濾，注入無菌處理的托盤中；(5)將托盤放入凍干機中，進行冷凍干燥；(6)冷凍干燥后，將干燥無菌原料放入無菌處理的粉碎機中進行粉碎；(7)將粉碎后的原料在100級操作間，進行分裝，制備成一種抗血栓疾病的中藥制劑。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其中陰離子交換樹脂為弱陰離子或強陰離子交換樹脂。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其中緩沖液為Tris-HCl溶液或磷酸一氫鈉—磷酸二氫鈉溶液中的的一種。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其中凍干機控制溫度0℃--70℃，壓力為1.01×105Pa-0.4×105Pa。
6.根據權利要求1或2所述的中藥制劑，其中凍干粉針劑的藥用輔料為甘露醇、蔗糖或乳糖中的一種或二種的混合物。
全文摘要
本發明公開了一種抗血栓疾病的中藥制劑及其制備方法，其特征在于它是由單味中藥水蛭的有效部位和藥用輔料組成，采用醇提方法提取水蛭，得到水蛭醇提有效部位粗品；采用超濾法和離子交換法純化得到水蛭醇提有效部位精制品。水蛭醇提有效部位精制品加入藥用輔料制備成一種抗血栓疾病的中藥凍干粉針制劑，藥理實驗結果表明，該粉針劑具有很好的抗血栓作用，與市售同類品種比較具有更強的藥理作用。
文檔編號A61P9/00GK1559474SQ200410006490
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月10日 優先權日2004年3月10日
發明者張正生 申請人:張正生