專利名稱：藥物級別質粒dna的制備方法
技術領域：
本發明涉及高度純化的質粒DNA(pDNA)的制備，具體地涉及用于基于質粒的治療中的藥物級別質粒DNA的生產和分離。
背景技術：
分子生物學方面的發展清楚地表明，基于質粒的治療，具體是在疫苗和人類基因治療領域，是治療疾病的有效的途徑。然而，這種技術的顯著障礙是尋找有效的途徑來將目的基因遞送到細胞中。安全和有效地將正常基因遞送到人類細胞中的一種有前途方法是通過質粒DNA。質粒DNA是封閉的、環形的細菌DNA，目的DNA序列可以被插入其中。一旦被遞送給人類細胞，pDNA開始復制并產生插入的DNA序列的拷貝。因而，研究人員將質粒DNA視為有前途的賦形劑，用于將正常基因遞送到人類細胞內來治療各種疾病狀態。
實現這種新技術的研究開發和人類治療需要大量的質粒DNA。由于用于基因治療和其他臨床應用的質粒DNA通常通過例如大腸桿菌(Escherichiacoli)(E.coli)的細菌產生，需要一些方法來從細菌細胞的基因組DNA(gDNA)，以及細菌細胞中的內毒素和蛋白中有效地分離質粒DNA。因而，對于可用于從細菌細胞分離大量質粒DNA的，簡單、耐用和可擴大規模的(scalable)的純化過程，存在著不斷增長的需求。
在任何質粒純化過程中的一個重要步驟包括裂解細菌細胞以釋放細胞內容物，然后可以從中分離pDNA。實際上，首先必需的是實現細胞重懸浮、細胞裂解、和宿主污染物的中和與沉淀這三個步驟。細胞重懸浮通常利用人工攪動或磁性攪拌器，和勻漿器或葉輪混合器，以將細胞重懸浮在重懸浮緩沖液中。細胞裂解可以通過人工渦旋或磁力攪拌來進行，以將重懸浮的細胞與裂解溶液(由稀釋的堿(alkali)(堿(base))和洗滌劑組成)混和；然后將混合物保持在室溫(20-25攝氏度)或冰上保持一段時間，例如5分鐘，以完全裂解。如上所述，人工渦旋和磁力攪拌不是可擴大規模的。第三個階段是宿主污染物的中和與沉淀。來自第二階段的溶胞產物通常通過溫和的渦旋或磁力攪拌與冷中和溶液混和以酸化溶胞產物，之后置于冰上10-30分鐘以促進高分子量染色體DNA、宿主蛋白和其他宿主分子的變性和沉淀。人工渦旋和磁力攪拌都不是可擴大規模的。
一般地，通過用溶菌酶短時間處理或經由堿或乙酸鉀(KOAc)處理來消化細胞壁。一般還添加RNase來降解細菌懸浮液的RNA。這些化學步驟在小規模地裂解細胞方面可能是有效率的。然而，粘度的增加使得大規模加工非常困難。制備質粒的可選簡單且快速的方法包括細菌的溶菌酶處理，然后在約100℃在合適的緩沖液中煮沸20到40秒，形成不溶的基因組DNA、蛋白和碎片的不溶塊，將質粒留在溶液中，帶有RNA作為主要污染物。然后，添加NaOH和十二烷基磺酸鈉(SDS)的混合溶液，目的是溶解細胞質膜。NaOH部分地使DNA變性和部分地降解RNA，SDS起作用來溶解膜并使蛋白變性。接著，通過添加5N乙酸鉀(pH 4.8)來沉淀SDS-蛋白質復合物和細胞碎片。此時，pH對于中和所述操作中使用的NaOH和使質粒復性都是很重要的。然而，這種技術不適合于擴大到大體積的細菌發酵，僅適用于低于五升的發酵。此后，使用離心來除去沉淀，從而在上清液中獲得目的質粒。并且，這些系列操作需要緩慢和穩定地混合，以避免細菌染色體DNA被切斷成小的片段和聚集物，使得它們污染質粒，并且難以實現大規模的加工。
裂解細胞的一種常見替換性方法，被稱為堿裂解，包括將細菌細胞的懸浮液(溶液1)與堿性裂解性溶液(溶液2)混合。溶液2由洗滌劑和堿組成，用裂解細菌細胞并釋放細胞內物質的洗滌劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)以及用以使細胞的蛋白質和核酸(具體是gDNA和RNA)變性的堿例如氫氧化鈉。由于細胞裂解和DNA變性時，溶液的粘度顯著地升高。在變性之后，添加酸性溶液，例如乙酸鉀(溶液3)以中和氫氧化鈉、誘導核酸的復性。gDNA的長片段隨機地重結合，并形成網絡，作為絮狀物、捕集蛋白(entrappingprotein)、脂質和其他核酸沉淀出來。十二烷基硫酸鹽的鉀鹽也發生沉淀，帶走與之結合的蛋白。pDNA(質粒DNA)的兩條鏈互相纏繞，通常重結合形成初始質粒，保持在溶液中。
現有技術一般按照分批模式描述這種裂解技術，即，通過次序性地將溶液添加到容器或槽中來混合不同的溶液。因為堿性的溶胞產物是非常難以操作的粘彈性流體，這種方法的一個困難在混合不同溶液期間產生。由于剪切應力引起gDNA的段裂，然后它將變得極難從pDNA重分離，需要一些方法來避免對流體施加剪切應力。此外，大的pDNA(即，大于約10千堿基對)在混合過程期間也對剪切破壞敏感。在含有細胞懸液的溶液與裂解溶液混合之后，粘彈性的堿性溶胞產物與中和溶液混合。再一次，由于溶液的粘彈性質，這個混合過程是成問題的。
此外，在擴大分批裂解處理的規模的另一個難處包括在嘗試限制剪切應力以避免片段化gDNA時混合不同液體的效率。如早先說明的，片斷化的基因組DNA的色譜性狀與pDNA的非常相似，使得它實際上不可能通過標準純化過程來去除。因而，使用分批處理來裂解細菌細胞的幾種局限性是明顯的，例如擴大規模，由于片斷化的gDNA的污染回收的pDNA質量低，和獲得的相對低數量的pDNA。
與分批方法相比，也已經提出了使用一系列靜止混合器連續地混合各種細胞-裂解溶液的幾種方法。根據這些方法，細胞懸浮溶液和細胞裂解溶液被同時添加到靜止混合器。離開第一靜止混合器的裂解細胞溶液，和沉淀溶液然后被同時添加到第二靜止混合器。離開這個第二混合器的溶液含有沉淀的溶胞產物和質粒。裂解細胞的其他連續模式包括使用流通換熱器(flow-through heat exchanger)，其中懸浮細胞被加熱到70-100℃。在換熱器中細胞裂解之后，排出流進行連續流動或分批式的離心，離心期間細胞碎屑和基因組DNA被沉淀，在上清液中留下質粒DNA。
從大體積的微生物發酵大規模分離和純化質粒DNA因此需要開發改進的質粒制備過程。
盡管當前使用許多方法來裂解細菌細胞，它們都沒有解決由液體的粘彈性質和混合步驟中涉及的剪切力引起的難題。因而本發明涉及大規模地連續堿裂解細菌細胞懸浮液的新方法，并在限制剪切力方面提供了主要的優點。
在質粒DNA制備中的另一個重要步驟是質粒分離(isolation)或分隔(separation)和純化。從細菌發酵分離和純化質粒DNA的傳統技術適合于小的和實驗室規模的質粒制備。在破壞含質粒的細菌宿主細胞之后，隨后的醋酸鹽中和引起的宿主細胞基因組DNA的沉淀，蛋白一般通過例如離心來除去。含有質粒DNA的液相用醇類沉淀，然后在存在溴化乙錠的情況下使用CsCl進行等密度(isopycnic)離心來分離各種形式的質粒DNA，即，超螺旋的、有缺口的環形的、和線性化的。在用醇類進行DNA沉淀之后需要用丁醇進一步提取來除去殘余的溴化乙錠。隨后進行其他的純化步驟來除去宿主細胞蛋白。
這些用于分離質粒DNA的當前方法有幾個限制。例如，涉及使用大量易燃有機溶劑(例如，乙醇和異丙醇)和有毒化學品，例如，溴化乙錠、苯酚和氯仿的純化方法，對于質粒DNA的大規模分離和純化一般是不合需要的。對氯化銫離心的替換性方法可被用于質粒DNA純化，例如，空間排阻層析、羥磷灰石上的層析、和基于反相或陰離子交換的各種層析法。這些替換對于以實驗室規模生產少量的研究材料可能是足夠的，但是一般不是可容易地擴大規模的，并且不能生產大量的質粒DNA。
經過如上所述的一系列操作，有可能獲得相對高純度的質粒(此后，所述分離和純化核酸的方法稱為化學分離法)。然而，使用化學分離法，分離和純化過程是復雜的，并且必需使用大量的有機溶劑，因此它引起廢棄溶劑的處理及其他許多問題。
除了化學的分離和純化方法之外，存在著通過電泳分離質粒的方法。電泳方法包括紙電泳和凝膠電泳，凝膠電泳是當前常用的。電泳方法在獲得高純度質粒方面具有優點，然而它具有長的分離時間、難以收集、低的樣品載荷等等許多問題。因此，現狀是，僅當希望進一步改善通過所述化學分離和純化方法純化的質粒級分的純度時使用電泳分離。
用于分離兩種形式的質粒DNA的當前可用的方法利用離子交換層析(Duarte et al.，Journal of Chromatography A，606(1998)，31-45)或空間排阻層析(Prazeres，D.M.，Biotechnology Techniques Vol.1，No.6，June 1997，p417-420)，伴隨著使用添加劑，例如聚乙二醇(PEG)、洗滌劑，和其他成分，例如六胺鈷、亞精胺、和聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)。然而，當前已知的方法不能提供有效率和有成本效益的超螺旋且有斷口(或松弛)的DNA的分離。此外，許多已知的方法有使用PEG或其他添加劑的不利問題，在質粒DNA的制造中這可能是不期望的，因為它們需要額外的分離、清除和質量控制方法，這可能是困難的、更費時的和更昂貴的。分離超螺旋和松弛形式的質粒DNA的已知方法的其它形式利用非常昂貴的、專有的樹脂，其在處理期間也利用了溶劑，例如乙腈、乙醇和其他成分，如三乙胺和四丁基胺磷酸鹽。分離超螺旋和松弛DNA的其他方法依靠空間排阻層折，其涉及根據大小上的微小差異分離兩種形式的質粒DNA。這些柱一般是相對長的，存在顯著的難以擴大規模的問題，使得實現大規模生產不可行。此外，空間排阻方法需要濃縮的樣品溶液，由于DNA的高粘性質，獲得有質粒DNA的溶液是不可行的。質粒DNA制品是從細菌制品生產的，常常含有松弛和超螺旋質粒DNA的混合物，根據FDA的要求常常需要內毒素去除，因為已知許多細菌產生的內毒素在接受所述質粒DNA的宿主中引起炎癥反應，例如發熱或膿毒癥(sepsis)。這些內毒素一般是脂多糖或其片段，是革蘭氏陰性細菌的外膜的成分，存在于宿主細胞和的DNA制備物和寄主細胞膜或大分子中。因此在用于治療或預防用途的質粒DNA的純化中內毒素的去除是關鍵和必需的步驟。從質粒DNA溶液中去除內毒素主要使用內毒素的帶負電結構。然而質粒DNA也是帶負電的，因此分離通常用結合這兩種分子的陰離子交換樹脂來實現，在一定條件下，優選洗脫結合內毒素的質粒DNA。這種分離產生僅僅是部分的去除，因為顯著數量的內毒素與質粒DNA一同洗脫，和/或實現非常少的質粒DNA回收。
從大體積的微生物發酵大規模分離和純化質粒DNA因而需要開發改進的質粒制備方法。還需要以更簡單的途徑和在較短的時間分離和純化大量質粒DNA的方法。對于基于質粒的研究和治療也是合乎需要，核酸可以以可再現的方式被分離和純化同時保持著相同結構，來避免混雜物對人體的副作用，核酸需要被分離和純化到足夠高的純度。
然而，使用所述常規方法，存在著不能大量獲得足夠高純度的核酸，具體是質粒DNA的難題。因此，本發明目標是提供利用至少兩個層析步驟的分離方法，其能在較短的時間以最高的純度級別分離大量的質粒DNA。
發明概述本發明基于生產和分離高度純化的質粒DNA的方法的發現。通過本發明的方法生產和分離的質粒DNA含有極低水平的污染性染色體DNA、RNA、蛋白和內毒素。根據本發明生產的質粒DNA具有足以用于基于質粒的治療的純度。
因而，本發明包括生產和分離高度純化的質粒DNA的方法，其包括細胞裂解的步驟，其中有(a)湍流設備(a means for turbulent flow)，以快速地混合細胞懸液與裂解細胞的溶液；和(b)層流設備(a means for laminar flow)，以允許基本沒有攪動地保溫(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的混合物從湍流設備流動到層流設備。
本發明的進一步的實施方式中，該裝置(mechanism)可以另外包括添加用于中和所述裂解溶液的第二溶液的設備，其中在(b)中保溫的混合物從所述層流設備流動到所述用于添加第二溶液的設備。
在另一個實施方式中，該裝置可被用于從細胞分離質粒DNA的方法，包括(a)在所述湍流設備中混合所述細胞與堿性裂解性溶液(lysingsolution)；和(b)通過添加酸性溶液中和所述堿性裂解性溶液。
本發明進一步的包括生產和分離高度純化的質粒DNA的方法，所述質粒DNA基本上沒有污染物并且因而是藥物級別的DNA。
本發明的另一個目的涉及分離和純化核酸和質粒DNA的方法。更詳細地，其涉及分離對于研究和基于質粒的治療有用的、藥物級別的核酸和質粒DNA的方法。根據本發明的方法分離的質粒DNA制品可以進行至少包括三螺旋層析的純化步驟，可以進一步包括陰離子交換層析和疏水性相互作用層析。
因而這些方法包括在此描述的連續堿裂解步驟與隨后的陰離子交換層析和/或三螺旋層析，和/或進一步的疏水性相互作用層析組合。
因而這些方法還包括在此描述的連續堿裂解步驟與隨后的組合形式的陰離子交換層析、三螺旋層析和疏水性相互作用層析步驟的組合。溶胞產物過濾或其他絮凝物去除可以先于第一層析步驟進行。
本發明的一個目的是最大化來自宿主細胞/質粒DNA組合的質粒DNA產量。
本發明的另一個目的是提供基本上沒有細菌宿主RNA的質粒DNA制備物。
本發明的另一個目的是提供基本上沒有細菌宿主蛋白的質粒DNA制備物。
本發明的另一個目的是提供基本上沒有細菌宿主染色體DNA的質粒DNA制品。
本發明的另一個目的是提供基本上沒有細菌宿主內毒素的質粒DNA制品。
本發明的另一個目的是提供制備用于研究和基于質粒的治療的、高純度的、藥物級別質粒DNA的方法，并且其能擴大到大規模生產。
因而本發明包括基本上沒有污染物、高純度和完整的、比現有技術優越的藥物級別質粒DNA，所述DNA包括載體主干、治療基因和相連的調節序列。
本發明還涉及質粒DNA液體制劑，其在室溫長時間是穩定的且保持不降解的，因而對于用于研究和相關人類治療的質粒DNA的保存是有用的。
最后，本發明還涉及連續堿性細胞裂解裝置，包括能以所述細胞懸液的相反方向注射堿性液體的第一混合器或注射器，小直徑的第一管道以在混合物內產生湍流，大直徑的第二管道以在混合物中產生層流，用于在一端注射中和溶液并在另一端收獲混合物的第二混合器或注射器。
本發明的其他目的和益處將在隨后的說明書中部分地闡述，在某種程度上根據說明書將變得更為明顯，或可以從本發明的實踐中習得。通過特別在附隨的權利要求中指出的元素和組合的方式，將實現和達到本發明的目的和益處。
需要理解的是，以上的一般性說明和隨后的詳細說明都僅是示范性的和說明性的，而不是對本發明的限制，如所要求的。
附隨的圖，合并到本說明書中并作為本說明書的一部分，與說明書一同說明了本發明的一個(幾個)實施方式，用來解釋本發明的原理。
附圖的簡要說明
圖1是可用于本發明的連續式細胞裂解的設備的示意圖。
圖2是在連續細胞裂解設備中混合器M1的示意圖。
圖3是使用單步的陰離子交換層析(AEC)、或陰離子交換層析與三螺旋親和層析(THAC)組合的兩步法，和包括組合形式的陰離子交換層析的步驟、三螺旋親和層析的步驟和疏水性相互作用層析(HIC)的步驟的三步法，比較關于gDNA、RNA、蛋白質、內毒素污染物的純化產量的表格，ND意思是未檢出低靈敏度分析方法。
圖4是比較分離和純化質粒DNA的各種方法的表格，例如，單獨的或組合的陰離子交換層析(AEC)、HAC、羥磷灰石層析(HAC)、疏水性相互作用層析(HIC)、反相層析(RPC)、空間排阻層析(SEC)、三螺旋親和層析(THAC)，和根據本發明的方法。提供了關于純化的質粒DNA質量的結果。ND，未檢出(低靈敏度分析方法)。
圖5A和5B是顯示保存在+25℃和+5℃達90天的質粒DNA的脫嘌呤作用和斷口速率(開放環形質粒形式的形成)的圖。
定義酸性意思是涉及或含有酸；具有小于7的pH值。
堿性意思是涉及或含有堿或堿；具有大于7的pH值。
連續的意思是不中斷，沒有中斷。
基因組DNA意思是來源于染色體或存在于染色體中的DNA。
層流意指溶液水的流動方面的流動類型，其中每個粒子(particle)按照與每個粒子平行的方向移動。
溶胞產物意指通過細胞裂解的處理產生的材料。術語裂解是指通過使用含裂解試劑的溶液進行化學處理，使緩沖溶液(即，細胞懸液)中的細胞的細胞壁和/或細胞膜破裂的行為。裂解試劑包括例如，堿、洗滌劑、有機溶劑和酶。在優選的實施方式中，進行細胞的裂解以從宿主細胞釋放完整的質粒。
中和以實現(溶液)中性，或使得(酸或堿/堿)經歷中和作用。通過這個術語，我們意指中和溶液使溶液的pH達到5和7之間的pH，優選的約7，或更優選的比以前更接近7的pH的情況。
牛頓流體是液體，其中剪切應力與速度梯度成正比，并垂直于剪切面。比例的常數被稱為粘度。牛頓流體的實例包括液體和氣體。
非牛頓流體是一種液體，其中剪切應力不與速度梯度完全成正比，并垂直于剪切面。非牛頓流體可能不具有明確的粘度。非牛頓流體包括塑性固體、冪律流體、粘彈性流體(兼備粘性和彈性特性)、和時間依賴性粘滯流體。
質粒DNA意指由不是染色體的DNA環組成的小的細胞內含物，其可能具有將非內源DNA片段插入其中的能力。構建質粒的方法包括在Maniatis et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中描述的那些。
對本發明來說，術語流動是指通常通過泵的作用使液體以具體的流速(例如，升每分鐘)通過混合器。應當注意到，通過混合器的流速被認為影響裂解、沉淀和混合的效率。
“斷口”或“松弛”DNA是指不是超螺旋的DNA。“超螺旋”DNA是本領域公知的術語。
“污染混雜物”是希望從中隔離或分離出DNA的任何物質。污染混雜物包括，但不限于宿主細胞蛋白、內毒素、宿主細胞DNA和/或RNA。應理解，什么東西被認為是污染混雜物可以取決于有關實施本發明的方法的內容。污染混雜物”可以是、或可以不是宿主細胞衍生的，即，它可以是或可以不是宿主細胞混雜物。
“分離”或“純化”第一成分(諸如DNA)是指從其他成分中富集所述第一成分，該第一成分最初與所述的其他成分一同存在。在此提供了期望的和/或可獲得的純化的程度。
術語基本上沒有和高度純化的被定義為約95％和優選的大于98.99％的純度，或沒有污染物，或具有低于5％，和優選低于1-2％的污染物。
藥物級別DNA在此被定義為含有不超過約5％、和優選的不超過約1-2％的細胞成分，諸如細胞膜的DNA制品。
藥物級別質粒DNA在此被定義為含有百萬分率或ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg每100mg質粒DNA)的基因組DNA、RNA和蛋白污染物的DNA制備物。
更確切地說，藥物級別質粒DNA在此是指含有低于約0.01％、或低于0.001％、和優選的低于0.0001％、或優選的低于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg每100mg質粒DNA))的染色體DNA或基因組DNA的DNA制備物。
藥物級別質粒DNA在此是指含有低于約0.01％、或低于0.001％、和優選的低于0.0001％、或優選的低于0.00002％(＜0.00002％，即＜0.00002mg每100mg質粒DNA))的RNA污染物的DNA制備物。
藥物級別質粒DNA在此是指含有低于約0.0001％、和最優選的低于0.00005％(＜0.00005％，即＜0.00005mg每100mg質粒DNA)的蛋白質污染物的DNA制品。
藥物級別DNA在此是指含有低于0.1EU/mg內毒素的DNA制品。
藥物級別DNA在此是指優選的在形式上主要是環形的DNA，和更確切的說含有超過80％、85％、90％、95％，或超過99％的封閉環形質粒DNA。
T形管是指T形結構的管道，其中T形是單片管形材料(tubing)由按所述結構產生的，或組合一或多片管形材料以產生所述結構。T形管具有三個臂，和臂連于在其上的中心區域。T形管可用于混合成分，兩個流體可以各自流入到T的臂之一中，在中性區域匯合，從第三臂流出。混合作為流體合并發生。
湍流意指流體粒子以橫向通過主要流動方向的方向進行不規則隨機運動，在給定點的速度在數值和方向上不定地變化。
粘彈性是指液體兼備粘性和彈性特性。
發明的詳細說明本發明基于生產高產量的藥物級別質粒DNA的規模可擴大的方法的發現。具體地，本發明基于使用宿主細胞的連續堿裂解制備和分離高度純化的質粒DNA的方法的發現。
第一個步驟，接種宿主細胞，即在指數生長期用質粒DNA轉化，并在含抗生素例如四環素LB培養基的平板上劃線。然后將來自平板的單個菌落各自接種到獨立的無菌塑料錐形燒瓶中補充有合適的抗生素四環素的20mlLB培養基中，在搖動保溫器中在37度生長12-16小時。然后這些培養物之一被用于接種添加到2L錐形燒瓶中的200ml的無菌LB培養基。使其在搖動保溫器上在37℃和200rpm生長，用于接種兩個5L錐形燒瓶，在搖動保溫器上在30℃和200rpm生長，5小時后、在2個單位的OD600nm下，當處于指數生長期中期時用于接種發酵容器。
宿主細胞培養和接種是本領域公知的。一般地，使宿主細胞生長直到它們達到高的生物量和細胞處于指數生長期，以具備大量的質粒DNA。可以使用兩種不同的方法，即分批和補料-分批發酵。
分批發酵容許通過對生長溫度和使用的碳源的操作來控制生長速率。如在此使用的，術語“分批發酵”是一種細胞培養過程，通過這種過程，用于細胞生長和制備包含在培養的細胞中的質粒的所需的所有營養物在接種時大量過量地存在于容器中(例如，比現有技術的營養物濃度過量10倍)，從而避免了在滅菌后添加之后向無菌容器中進行添加的需求，以及對復雜的補料模式和策略的需求。
根據本發明有用的另一種發酵類型是補料分批發酵，在其中通過在細胞生長期間向培養物中添加營養物來控制細胞生長速率。如在此使用的，“補料分批發酵”是指一種細胞培養過程，其中通過在發酵期間小心監控向培養物中添加代謝產物來控制生長速率。根據本發明的補料分批發酵允許細胞培養物達到比分批發酵更高的生物量。
以下針對50L制品描述發酵過程的實例和示范性的補料添加速率。然而，其他體積，例如10L、50L、或大于500L，取決于設備的規模，也可以使用如下所述的示范性補料速率來處理。
高度富集的分批培養基和補料分批培養基發酵適合于高細胞密度培養物的產生，以最大化具體質粒的產量和容許在仍處于指數生長中時以高生物量收獲。
飼喂分批發酵使用葡萄糖或甘油作為碳源。所述發酵以分批模式進行直到初始的碳底物(葡萄糖)耗盡。通過DO的突然升高注意到，并通過對該事件后立即采取的樣品的葡萄糖分析來確認這個時點。然后啟動早先準備的補料培養基泵。泵速率通過來自Curless等(Bioeng.381082-1090，1991)的模型來確定，通過引用將所述文獻完整地合并在此。設計該模型以便于控制補料分批過程的補料階段。在初始的分批過程中，非抑制性濃度的底物被以它們最大比生長速率(max)生長的細胞消費，使得在接種后得到生物量水平急速升高。由于有毒代謝產物的積累，培養物不能以這種速率無限地生長。(Fieschio et al.，″Fermentation Technology Using RecombinantMicroorganisms.″In Biotechnology，eds.H.J.Rhem and G.Reed.WeinheimVCH Verlagsgesellschaft mbH 7b117-140，1989)。為了容許持續的對數生長，該模型計算生長限制性碳底物的基于時間的補料速率，而不需要反饋控制，從而給出操作員設定的的補料-分批階段的生長。將它選擇在一定水平，這種水平不引起抑制性代謝產物的積聚，并且足以得出高的生物量。
一般地，分批發酵使用高水平的(例如，是現有技術濃度的4倍)前體，其存在于富集的分批培養基中。具體地，在分批培養基中酵母提取物的數量富集到形成5g/l(如在LB培養基中)到20g/升，從而提供巨大數量的生長因子和核酸前體。培養基還補充有硫酸銨(5g/l)，其作為有機氮的來源。在補料-分批發酵中的補料過程期間，前體(硫酸銨形式的有機氮)的添加是設計為用來防止對質粒質量方面的有害影響。
根據本發明的方法的一個重要的方面是細胞裂解。因而，本發明包括用于制備和分離高度純化的質粒DNA的過程，其包括細胞裂解的步驟，其中有(a)湍流設備，以快速地混合細胞懸液(附圖1中的溶液1)與可裂解細胞的溶液(附圖1中的溶液2)；和(b)層流設備，以允許基本上沒有攪動地保溫(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的混合物從湍流設備流動到層流設備。
根據本發明的一個的實施方式，該裝置可以另外包括添加中和所述裂解溶液的第二溶液(附圖1中的溶液3)的設備，其中在(b)中保溫的混合物從所述層流設備流動到所述添加第二溶液的設備。
在另一個實施方式中，該裝置可被用于從細胞分離質粒DNA的方法，包括(a)在所述湍流設備中混合所述細胞與堿性裂解性溶液；和(b)通過添加酸性溶液中和所述堿性裂解性溶液。
盡管當前使用許多方法來裂解細菌細胞，它們都沒有解決由液體的粘彈性質和混合步驟中涉及的剪切力引起的難題。本發明的一個目的是使用T形管在粘彈性流體出現之前均一地和非常快速地混合細胞懸液(溶液1)和堿性溶液(溶液2)的方法。因而根據本發明的連續裂解提供了限制剪切力方面的主要優點。T形管一般具有小直徑的管形材料，通常直徑小于1cm，優選約2到8mm，更優選約6mm，來提高混合的流體的接觸時間，但是這種方法不利用由穿過管道而誘導的混合。以下的表1顯示了湍流、層流和湍流設備的參數B1a、B1b、B2各自的變化，它們相應的流速S1、S2和S3如附圖1中所展現。
表1
本發明的另一個目的是具有非T管道的混合器或注射器，其允許細胞分散到裂解溶液中。因此，與例如通過槽中的槳來攪拌液體時相比對通過管道的液體的機械應力大大地降低了。混合的初始效率在隨后的幾秒鐘甚至產生了更高的效率，因為這種液體還沒有粘彈性質，通過小直徑管道實現的混合是非常有效的。與此相反，當使用T形管混合時，起始混合僅是適度的，而流體快速地變成粘彈性的，在流入管道時引起相當大的問題。這種部分混合產生僅部分細胞的裂解，因此在中和作用之前只能釋放一部分質粒。
根據本發明，我們鑒定了裂解期間的兩個階段，稱為階段I和階段II。這兩個階段相應于I)細胞的裂解和II)核酸的變性，引起產生粘彈性流體的流變性能方面的主要變化。調整管道的直徑使得滿足這兩個階段的要求成為可能。在小直徑的管道(B1a)內，混合增加。這是用于階段I的結構。在大直徑的管道(B1b)內，混合(并且由此剪切應力)減少。這是階段II采用的結構。
因此，我們使用在附圖2中描述的稱為M1的混合器。也可以使用任何T形裝置來提供根據本發明的細胞懸液的分散物。使用這種混合器，溶液通過一個或多個小直徑的孔口以與液流相反的方向地(counter current)注射到堿性裂解性溶液中，以獲得有效率的分散。這些孔口在所描述的結構中的直徑約0.5mm到2mm，優選的約1mm。
混合物離開混合器M1短時間(約2.5秒)通過小直徑的管道(附圖1)。直徑和流動時間的組合可以容易地計算以維持湍流。這些參數的變化的實例在表1中提供。對管道直徑的所有標注提供的都是管道的內徑，而不是外徑，外徑包括了管道壁自身的厚度。在管道中的這種短暫停留時間允許溶液1和2的非常快速的勻化作用。假定溶液1和溶液2在階段I中仍然是牛頓流體，在勻化作用階段期間流動模式是湍流。在離開這個管道時，溶液1和2是均化的，懸浮中的細胞裂解開始。
然后勻化的混合物通過直徑大得多的第二管道(B1b)(附圖1)，在其中發生細胞的裂解和粘彈性流體的形成。在這個階段期間，可以使混合最小化，盡可能地容許溶液“靜息”來限制湍流，以使將gDNA片段化的任何剪切應力最小化。在本發明的在一個實施方式中，約1到3分鐘、約2分鐘，和優選的1分20秒的接觸時間足以完成細胞裂解和使核酸變性。在變性階段期間，流體的流動模式是層流，推動SDS和氫氧化鈉向細胞組分的緩慢的擴散。
由此獲得溶胞產物，然后用稱為M2的Y混合器來混合中和作用溶液3。在本發明的在一個實施方式中，Y混合器的內徑約4到15min，或約6到10mm，可以是約6mm或約10mm。小直徑管道(例如，約6mm管道)位于Y混合器的出口以容許快速(＜1秒)，有效的混合溶胞產物與溶液3。然后在收獲槽中收集中和的溶液。在中和作用期間，pH的快速降低誘導了絮凝物形成(即，團或塊的形成)。另一方面，部分變性的質粒非常快速地復原并保留在溶液中。絮狀物在收獲槽中逐漸沉下，帶走大部分的污染物。
附圖1中的示意圖顯示了連續裂解(CL)系統的一個實施方式。連續裂解可以自身使用或與其他過程一起使用。
本發明的方法可以被用于裂解任何類型的細胞(即，原核的或真核的)，用于任何與裂解有關的目的，例如，從靶細胞中釋放需要隨后純化的所需質粒DNA。在優選的實施方式中，本發明的方法被用于裂解含有質粒的宿主細胞來釋放質粒。
根據本發明的連續堿性裂解步驟的過程可以對從發酵收獲的細胞來進行，所述發酵已經生長到未達靜止期的細胞生物量，并因而處于指數生長(2-10g干重/升)。所述連續堿性裂解步驟也可以對從發酵收獲的細胞進行，所述發酵已經生長到不再處于指數生長的、但未達靜止期的高細胞生物量，具有約10-200g干重每升的細胞的濃度，優選為12-60g干重每升。
本發明進一步的包括制備和分離高度純化的質粒DNA的方法，所述質粒DNA基本上沒有污染物并且因而是藥物級別的DNA。通過本發明的方法生產和分離的質粒DNA含有極低水平，即，百萬分率(ppm)的污染染色體DNA、RNA、蛋白質和內毒素，并主要含有封閉的環形質粒DNA。根據本發明制備的質粒DNA具有足以用于研究和基于質粒的治療的純度。
本發明的方法包含純化步驟，所述純化步驟包括三螺旋親和層析和進一步的離子交換層析步驟，本發明的方法可進一步包括疏水性相互作用層析或凝膠滲透層析。離子交換層析的步驟可以是流化床離子交換層析和軸向和/或徑向高分辨率陰離子交換層析，因而該方法包括在此描述的連續堿裂解步驟，與隨后的離子交換層析、三螺旋親和層析和疏水性相互作用層析步驟組合，按該順序發生。溶胞產物過濾或其他絮凝物去除可以先于第一層析步驟進行。在此描述的用于純化質粒DNA的本發明的方法是可擴大規模的，因而可擴大到大規模生產。
在本發明的某些實施方式中，連續裂解可以于其他的純化步驟組合來產生含pDNA的高純度產品。例如，它可以與絮凝物去除(例如溶胞產物過濾、沉淀或離心)、離子交換層析(例如陽離子或陰離子交換)、三重親和層析和疏水性相互作用層析中的至少一個組合。在一個實施方式中，連續裂解之后依次是陰離子交換層析、三重親和層析，和疏水性相互作用層析。在另一個實施方式中，連續裂解之后依次是溶胞產物過濾、陰離子交換層析、三重親和層析，和疏水性相互作用層析。這些步驟允許確實可擴大規模的質粒制造過程，其可以生產大量的前所未有的純度的pDNA。宿主DNA& RNA以及蛋白質處在亞-ppm范圍。
本發明的方法也可以使用進一步的SEC、反相層析、羥磷灰石層析等的步驟，與根據本申請在此描述的步驟組合。
可以采用絮凝物去除來為產生的pDNA產品提供更高的純度。可以使用這個步驟來除去大部分沉淀的材料(絮凝物)。進行絮凝物去除的一種機制是通過溶胞產物過濾步驟，例如通過1到5mm，優選的3.5mm的柵格濾器(grid filter)，之后是作為最終(polishing)過濾步驟的深度過濾。進行絮凝物去除的其他方法是通過離心或沉淀。
可以采用離子交換層析來為產生的pDNA產品提供更高的純度。可以根據污染物的性質和溶液的pH值來選擇陰離子交換。
可以采用陰離子交換層析來為產生的pDNA產品提供更高的純度。陰離子交換層析通過結合帶負電的(或酸性)分子來支持帶正電的分子而起作用。則，使用離子交換層析容許根據分子的電荷來分離分子。通過這種技術可以容易地分離分子的家族(酸性、堿性和中性的)。可以使用分步洗脫方案，許多污染物在早期級分洗脫，pDNA在較晚的級分洗脫。對于從pDNA制品除去蛋白質和內毒素，陰離子交換是非常有效的。
對于離子交換層析，填充材料和制備這種材料的方法以及制備過程、聚合和功能化陰離子交換層析，通過它洗脫和分離質粒DNA是本領域公知的。
基礎材料(base material)被用于陰離子交換層析的填充材料，如果展現疏水性的各種官能基團或各種離子交換基團可以通過合成基礎材料之后的后期反應導入，用于合成基礎材料的化合物可以是任何化合物。單官能單體的實例包括苯乙烯、o-鹵代甲基苯乙烯(o-halomethylstyrene)、m-鹵代甲基苯乙烯、p-鹵代甲基苯乙烯、o-鹵代烷基苯乙烯、m-鹵代烷基苯乙烯、p-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-o-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-m-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-p-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-o-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基-m-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基-p-鹵代烷基苯乙烯、o-羥甲基苯乙烯、m-羥甲基苯乙烯、p-羥甲基苯乙烯、o-羥烷基苯乙烯、m-羥烷基苯乙烯、p-羥烷基苯乙烯、α-甲基-o-羥甲基苯乙烯、α-甲基-m-羥甲基苯乙烯、α-甲基-p-羥甲基苯乙烯、α-甲基-o-羥烷基苯乙烯、α-甲基-m-羥烷基苯乙烯、α-甲基-p-羥烷基苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙類酸縮水甘油酯、羥乙基丙烯酸酯、羥甲基丙烯酸酯和乙烯基醋酸酯。最優選的化合物是環烷基基團被芳香環、鹵素例如Cl、Br、I和F，和2到15個碳原子內的直鏈和/或分支的飽和烴類取代。多官能單體的實例包括二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基甲苯、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亞甲基雙甲基丙烯酰胺、和亞甲基雙丙烯酰胺。
可以通過后期反應導入各種離子交換基團。基礎材料的制備包括第一步驟，其中單功能單體和多官能單體按適當的比例稱出，添加用于調整形成的粒子中孔的、精確稱出的稀釋劑或溶劑以及類似地精確稱出的聚合引發劑，隨后充分攪動。然后對混合物進行水包油型懸浮聚合作用，其中混合物被添加到溶解了預先精確稱出的懸浮穩定劑的水溶液中，通過用攪拌器混合形成目標大小的油滴，通過逐漸地加熱混合的溶液進行聚合作用。單功能單體與多功能單體的比例一般約1摩爾單功能單體，和約0.01到0.2摩爾多功能單體，以獲得軟的基礎材料顆粒。聚合作用引發劑也沒有具體的限制，使用通常采用的azobis型和/或過氧化物型。
可以使用懸浮穩定劑例如離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑和有兩親性的聚合物或它們的混合物，來防止油滴自身之間的聚集。
用于離子交換層析以純化質粒DNA的填充材料優選具有相對大的孔直徑，具體是在1500到4000埃的范圍內。表面改性以將離子交換基團導入基礎材料是本領域公知的。
兩種類型的洗脫液可被用于離子交換層析。可以使用含有低濃度的鹽的第一洗脫液和含有高濃度的鹽的第二洗脫液。洗脫方法包括從逐步地從第一洗脫液交換到第二洗脫液，梯度洗脫方法連續地改變從第一洗脫液到第二洗脫液的組成。可以使用通常用于這些離子交換層析洗脫液中的緩沖液和鹽。對于含有低濃度的鹽的第一洗脫液，緩沖液濃度10到50mM、pH值6到9的水溶液是具體優選的。對于含有高濃度的鹽的第二洗脫液，洗脫液C中添加了0.1到2M鈉鹽的水溶液是具體優選的。對于鈉鹽，可以使用氯化鈉和硫酸鈉。
此外，可以使用二價金屬離子的螯合劑，實例例如，乙撐二胺-四乙酸，用于抑制由于大腸桿菌的溶胞產物中DNA降解酶造成的質粒降解。二價金屬離子螯合劑的濃度優選的為0.1到100mM。
各式各樣的商業上可獲得的陰離子交換基質適合于在本發明中使用，包括但不限于可以從POROS Anion Exchange Resins、Qiagen、Toso Haas、Sterogene、Spherodex、Nucleopac和Pharmacia獲得的那些。例如，柱(PorosII PI/M，4.5mm×100)最初用pH 7.5的20mM Bis/TRIS Propane和0.7MNaCl平衡。加載樣品，并用相同的初始緩沖液沖洗。然后應用約25倍柱容積的0.5M到0.85M NaCl洗脫梯度，收集級分。優選的陰離子交換層析包括Fractogel TMAE HiCap。
根據分離和純化質粒DNA的過程的優選的實施方式，本發明涉及通過組合的離子交換層析和三螺旋層析來分離和純化核酸和/或質粒DNA的方法，用于有效地獲得大批量高純度的核酸。
三螺旋親和層析具體地在專利US 6,319,672、6,287,762以及申請人的國際專利申請公開WO02/77274中描述了。
三螺旋親和層析基于寡核苷酸和雙鏈DNA內靶序列的特異性雜交。這些寡核苷酸可以含有以下堿基-胸腺嘧啶核苷(T)，其能與雙鏈DNA的A.T雙聯體(doublet)形成三聯體(triplet)(Rajagopal et al.，Biochem 28(1989)7859)；-腺嘌呤(A)，其能與雙鏈DNA的A.T雙聯體形成三聯體；-鳥嘌呤(G)，其能與雙鏈DNA的G.C雙聯體形成三聯體；-質子化的胞嘧啶(C+)，其能與雙鏈DNA的G.C雙聯體形成三聯體(Rajagopal et al.，loc.cit.)；
-尿嘧啶(U)，其能與A.U或A.T堿基對形成三聯體。
優選的，使用的寡核苷酸包含富胞嘧啶的同型嘧啶(homopyrimidine)序列，和存在于是同型嘌呤-同型嘧啶(homopurine-homopyrimidine)序列的DNA中的特異性序列。胞嘧啶的存在使得三螺旋成為可能，三螺旋在酸性pH是穩定的，其中胞嘧啶是質子化的，在堿性pH是不穩定的，其中胞嘧啶被中和。
寡核苷酸和存在于DNA中的特異性序列優選是互補的以容許形成三螺旋。通過使用完全互補的寡核苷酸和特異性序列，可以獲得最好的產量和最好的選擇性。例如，寡核苷酸聚(CTT)和特異性序列聚(GAA)。優選的寡核苷酸具有序列5′-GAGGCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7(SEQ ID NO1)，其中堿基GAAG不形成三螺旋，但允許寡核苷酸從連接臂隔開；序列(CTT)7。這些寡核苷酸能夠與含有互補單元(GAA)的特異性序列形成三螺旋。所述序列具體為含有7、14或17個GAA單元的區域，如在實施例中描述的。
特別感興趣的另一個序列是序列5′-AAGGGAGGGAGGA GAGGAA-3′(SEQ ID NO2)。這個序列與寡核苷酸5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID NO3)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID NO4)形成三螺旋。在這種情況下，寡核苷酸按反平行方向與多嘌呤鏈結合。這些三螺旋僅在存在Mg2+的情況下是穩定的(Vasquez et al.，Biochemistry，1995，34，7243-7251；Beal and Dervan，Science，1991，251，1360-1363)。
如上所述，所述特異性序列可以是天然存在于雙鏈DNA中的序列，或是人工地導入到后者中的合成序列。特別有益的是使用能與天然存在于雙鏈DNA中的序列形成三螺旋的寡核苷酸，所述序列例如存在于質粒的復制起點中或存在于標記基因中。對此，已知通過序列分析，這些DNA的某些區域，具體是復制起點中，可能具有同型嘌呤-同型嘧啶區域。合成能與這些天然的同型嘌呤-同型嘧啶區域形成三螺旋的寡核苷酸，有利地允許本發明的方法應用于未改進的質粒，具體是商售的質粒pUC、pBR322、pSV等等類型。在天然存在于雙鏈DNA中的同型嘌呤-同型嘧啶序列之中，可以提及包含存在于大腸桿菌質粒ColE1復制起點中的序列5′-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQ ID NO5)的全部或部分的序列。在這種情況下，形成三螺旋的寡核苷酸具有序列5′-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID NO6)，并交替地與雙螺旋的兩條鏈結合，如Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992，114，4976-4982)和Jayasena和Johnston(Nucleic Acids Res.1992，20，5279-5288)所描述的。也可以提及質粒pBR322 β-內酰胺酶基因(Duval-Valentin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，504-508)的序列5′-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID NO7)。
已經在質粒ColE1以及質粒pCOR的復制起點中鑒定了能與具體寡核苷酸形成三螺旋的合適的靶序列。pCOR質粒是具有條件性復制起點的質粒，具體見US 2004/142452和US 2003/161844中的描述。ColE1衍生的質粒含有12mer的同型嘌呤序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO8)，位于(mapped)參與質粒復制的RNA-II轉錄產物的上游(Lacatena et al.，1981，Nature，294，623)。該序列與12-mer互補5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO9)寡核苷酸形成穩定的三螺旋結構。pCOR骨架含有14個非重復堿基的同型嘌呤片段(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO10)，其位于pCOR的γ起始復制子的富A+T片段中(Levchenko et al.，1996，Nucleic Acids Res.，24，1936)。該序列與14-mer互補的寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQID NO11)形成穩定的三螺旋結構。相應的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO8)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)有效地和特異地靶向它們各自的、位于ColE1 ori或者pCOR(oriγ)的復制起點內的互補序列。實際上，單個非經典(non-canonical)的三聯體(T*GC或C*AT)可能引起對三螺旋結構的完全的去穩定。
使用能與存在于復制起點或標記基因中的序列形成三螺旋的寡核苷酸是特別有益的，因為它使得使用相同的寡核苷酸來純化含有所述復制起點或所述標記基因的任何DNA成為可能。因而，修飾質粒或雙鏈DNA以將人工特異性序列摻入其中不是必要的。
盡管完全互補的序列是優選的，然而要理解的是，在寡核苷酸的序列和存在于DNA中的序列之間某些錯配是可忍受的，只要它們不導致太大的親合性損失。可以提及存在于大腸桿菌β-內酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ ID NO12)。在這種情況下，中斷多嘌呤序列的胸腺嘧啶可以由第三鏈的鳥嘌呤識別，從而形成G*TA三聯體，當其與兩個T*AT三聯體側接時是穩定的。(Kiessling et al.，Biochemistry，1992，31，2829-2834)。
根據具體的實施方式，本發明寡核苷酸包含序列(CCT)n、序列(CT)n或序列(CTT)n，其中n是1到15之間的整數，包括1和15。使用(CT)n或(CTT)n型的序列是特別有益的。申請人證明了，實際上，純化產量受到寡核苷酸中C的量的影響。具體地，如在實施例7中所示，當寡核苷酸含有較少的胞嘧啶時純化產量升高。要理解的是，本發明的寡核苷酸也可以組合(CCT)、(CT)或(CTT)單元。
使用的寡核苷酸可以是天然的(由未修飾的天然堿基組成)或化學修飾的。具體地，寡核苷酸有利地可以具有某些化學改變，允許提高它對核酸酶的抗性或保護性、或對具體序列的親合性。還應理解的是寡核苷酸意指任何連接的連續核苷，其經歷了骨架的修飾，目的是使它對核酸酶更有抗性。在可能的修飾之中，可以提及能與DNA形成三螺旋的寡核苷酸硫代磷酯(phosphorothioate)(Xodo et al.，Nucleic Acids Res.，1994，22，3322-3330)，以及具有formacetal或甲基膦酸酯骨架的寡核苷酸(Matteucci et al.，J.Am.Chem.Soc.，1991，113，7767-7768)。還有可能的是使用用核苷酸的α異頭物(anomers)合成的寡核苷酸，其也與DNA形成三螺旋(Le Doan et al.，NucleicAcids Res.1987，15，7749-7760)。對骨架的另一種修飾是氨基磷酸酯連接。例如，可以提及Gryaznov和Chen描述的N3′-P5′核苷酸間氨基磷酸酯連接，其給出了與DNA形成特別穩定的三螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.，1994，116，3143-3144)。在其它骨架的修改之中，也可以提及使用2’-O-甲基核糖、磷酸二酯等的核苷酸(Sun and Hélène，Curr.Opinion Struct.Biol.，116，3143-3144)。最后，基于磷的骨架可以被如PNA(肽核酸)中的聚酰胺骨架替代，其也能形成三螺旋(Nielsen et al.，Science，1991，254，1497-1500；Kim et al.，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，6477-6481)，或被如DNG(脫氧核糖核胍，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，6097-6101)中的基于胍的骨架取代，或被DNA的聚陽離子類似物取代，其也形成三螺旋。
第三鏈的胸腺嘧啶也可以被5-溴尿嘧啶替代，其增加寡核苷酸對DNA的親合性(Povsic and Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1989，111，3059-3061)。所述第三鏈也可以含有非天然堿基，在這些之中可以提及7-deaza-2’-脫氧黃嘌呤核苷(Milligan et al.，Nucleic Acids Res.，1993，21，327-333)、1(2-脫氧-β-D-核糖呋喃糖基(ribofuranosyl))-3-甲基-5-氨基-1H-pyrazolo[4，3-d]嘧啶-7-酮(one)(Koh and Dervan，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1470-1478)，8-氧腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2’-O-甲基偽異胞嘧啶，或本領域技術人員已知的任何其它修飾(對于綜述參見Sun and Hélène，Curr.Opinion Struct.Biol.，1993，3，345-356)。
寡核苷酸的另一種類型的修飾具體地具有改進寡核苷酸和特異性序列之間的相互作用和/或親合性的目的。具體地，根據本發明的最有益的修改在于使寡核苷酸的胞嘧啶甲基化。這樣甲基化的寡核苷酸顯示了在更接近中性的pH(≥5)范圍中與特異性序列形成穩定的三螺旋的值得注意的性質。因而與現有技術的寡核苷酸相比有可能在更高的pH值起作用(work)，也就是說在質粒DNA降解風險小得多的pH值起作用。
用于本發明的方法的寡核苷酸的長度在5到30個堿基之間。有利地使用長度大于10個堿基的寡核苷酸。對于每個獨立的情況，所述長度可以由本領域的技術人員改變，以適合相互作用的所需選擇性和穩定性。
根據本發明的寡核苷酸可以通過任何已知的技術合成。特別地，它們可以由核酸合成儀的方法制備。非常明顯地可以使用本領域的技術人員已知的任何其它方法。
為了允許與支持物的共價偶聯，寡核苷酸通常被功能化。因而，它可以在5’或3’位置被硫醇、胺或羧基末端基團修改。具體地，添加硫醇、胺或羧基使得，例如，將寡核苷酸偶聯到帶有二硫化物、馬來酰亞胺、胺、羧基、酯、環氧化物、溴化氰或醛功能(function)的支持物成為可能。這些偶聯通過在寡核苷酸和支持物之間建立二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺連接來形成。可以使用本領域技術人員已知的任何其他方法，諸如雙功能偶聯試劑。
此外，為了改進與偶聯的寡核苷酸的雜交，寡核苷酸含有堿基的“臂”和“間隔區”序列可能是有益的。臂的使用使得以與支持物的選定距離結合寡核苷酸在實際上成為可能，容許改進其與DNA的相互作用的狀況。所述臂有利地由線性碳鏈和胺組成，所述線性碳鏈包含1到18個，和優選的6或12個(CH2)基團，所述胺允許與柱結合。所述臂被連接到寡核苷酸、或“間隔區”的磷酸酯，所述“間隔區”包含不干擾雜交的堿基。因而，所述“間隔區”可以包含嘌呤堿基。舉例來說，所述“間隔區”可以包含序列GAGG。所述臂有利地包括包含6或12個碳原子的線性碳鏈。
三聯體親和層析對于除去RNA和基因組DNA是非常有效的。這些可以是功能化的層析支持物，散裝的或預先裝入在柱中，功能化的塑性表面或功能化的乳膠珠、磁性的或具有其它性質。優選使用層析支持物。舉例來說，能使用的層析支持物是瓊脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖以及它們的衍生物(例如，Sephadex、Sepharose、Superose等等)，聚合物例如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或移植或未移植的硅。層析柱可以以擴散或灌注模式操作。
為了獲得更好的純化產量，具體有益的是在質粒上使用含有與寡核苷酸雜交的幾個位置的序列。幾個雜交位置的存在實際上促進所述序列和寡核苷酸之間的相互作用，引起在純化產量方面的改善。因而，對于含有(CCT)、(CT)或(CTT)基序的n個重復的寡核苷酸，優選使用含有至少n個互補基序、優選的n+1個互補基序的DNA序列。帶有n+1個互補基序的序列因而提供了與寡核苷酸雜交的兩個位置。有利地，DNA序列含有多達11個雜交位置，也就是說n+10個互補基序。
根據本發明的方法可被用于純化任何類型的雙鏈DNA。后者的實例是環狀DNA，例如質粒，其通常帶有一個或多個由治療重要性的基因。這個質粒也可以帶有復制起點、標記基因，等等。本發明的方法可以直接應用于細胞溶胞產物。在這個實施方式中，通過轉化和隨后的細胞培養擴增的質粒，在細胞的裂解之后直接被純化。本發明的方法也可以應用于澄清的溶胞產物，也就是說應用于細胞溶胞產物的中和作用和離心之后獲得的上清液。它很明顯也可以應用于通過已知方法預純化的溶液。這種方法還容許從包含不同序列的DNA的混合物中純化帶有重要序列的線性或環狀DNA。根據本發明的方法也可以用純化雙鏈DNA。
細胞溶胞產物可以是原核或真核細胞的溶胞產物。
對于原核細胞，細菌大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、S.typhimurium或鏈霉菌(Strepomyces)可以作為實例提及。對于真核細胞，可以提及動物細胞、酵母、真菌等等，更具體的，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或酵母屬(Saccharomyces)酵母菌或COS、CHO、C127、NIH3T3等細胞。
可以采用至少包括三聯體親和層析步驟的本發明的方法來為產生的pDNA產品提供更高的純度。在三聯體親和層析中，寡核苷酸與支持物例如層析樹脂或其他基質結合。然后使要純化的樣品與結合的寡核苷酸混合，例如，通過將樣品施加到含有結合于層析樹脂的寡核苷酸的層析柱。樣品中所需的質粒將與寡核苷酸結合，形成三聯體。在寡核苷酸和質粒之間的鍵可以是Hoogsteen鍵。這個步驟可以在pH≤5、高鹽濃度、20分鐘或更多的接觸時間的條件下發生。可以采用洗滌步驟。最后，在中性緩沖液中出現胞嘧啶去質子化作用，從結合了寡核苷酸的樹脂洗脫所述質粒。
根據最優選的實施方式，分離和純化核酸和/或質粒DNA的方法包括組合的離子交換層析、三螺旋親和層析和疏水性相互作用層析的步驟。
疏水性相互作用層析使用基質上的疏水部分來吸引用于純化的樣品中分子中的疏水區域。應當注意到，這些HIC支持物通過“群集”效應來工作，當這些分子結合時沒有形成或共用共價鍵或離子鍵。由于非常有效地除去開放環形質粒形式和其他污染物，例如gDNA、RNA和內毒素，疏水性相互作用層析是有益的。
疏水性相互作用層析的基礎材料的合成、以及制備方法、聚合和功能化疏水性相互作用層析、和通過它洗脫和分離質粒DNA是本領域公知的，具體地在美國專利No6,441,160中描述，通過引用將它合并在此。
基礎材料(base material)被用于疏水性相互作用層析的填充材料，如果展現疏水性的各種功能基團或各種離子交換基團可以通過合成基礎材料之后的后期反應導入，用于合成基礎材料的化合物可以是任何化合物。單功能單體的實例包括苯乙烯、o-鹵代甲基苯乙烯、m-鹵代甲基苯乙烯、p-鹵代甲基苯乙烯、o-鹵代烷基苯乙烯、m-鹵代烷基苯乙烯、p-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、α-甲基-o-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-m-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-p-鹵代甲基苯乙烯、α-甲基-o-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基-m-鹵代烷基苯乙烯、α-甲基-p-鹵代烷基苯乙烯、o-羥甲基苯乙烯、m-羥甲基苯乙烯、p-羥甲基苯乙烯、o-羥烷基苯乙烯、m-羥烷基苯乙烯、p-羥烷基苯乙烯、α-甲基-o-羥甲基苯乙烯、α-甲基-m-羥甲基苯乙烯、α-甲基-p-羥甲基苯乙烯、α-甲基-o-羥烷基苯乙烯、α-甲基-m-羥烷基苯乙烯、α-甲基-p-羥烷基苯乙烯、甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacrylate)、丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl acrylate)、羥乙基丙烯酸酯(hydroxyethyl acrylate)、羥甲基丙烯酸酯(hydroxymethacrylate)和乙烯基醋酸酯(vinyl acetate)。最優選的化合物是在以下部分發生取代的環烷基基團芳香環、鹵素例如Cl、Br、I和F，和2到15個碳原子的直鏈和/或分支的飽和烴類取代。
多功能單體的實例包括二乙烯基苯、三乙烯基苯、二乙烯基甲苯、三乙烯基甲苯、二乙烯基萘、三乙烯基萘、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸二甘醇酯、二丙烯酸二甘醇酯、亞甲基雙甲基丙烯酸酯(methylenebismethacrylamide)、和亞甲基雙丙烯酸酯(methylenebisacrylamide)。
可以通過后期反應將各種疏水的功能基團或各種離子交換基團導入。為了最小化由于基礎材料本身展現的疏水性、或由于鹽濃度的變化和pH值的變化導致基礎材料本身的膨脹或縮小對所需的分離的目標產品的影響，優選使用相對親水的單體制備基礎材料，諸如甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯酸縮水甘油酯、羥乙基丙烯酸酯、羥甲基丙烯酸酯和乙烯基醋酸酯。基礎材料的制備包括第一步驟，其中單功能單體和多功能單體按適當的比例稱出，添加用于調整形成的粒子中的孔的、精確稱出的稀釋劑或溶劑，和類似地精密稱出的聚合引發劑，隨后充分攪動。然后使混合物經受水包油型懸浮聚合作用，其中混合物被添加到溶解了預先精確稱出的懸浮穩定劑的水溶液中，通過用攪拌器混合形成目標大小的油滴，通過逐漸地加熱混合的溶液進行聚合作用。
單功能單體與多功能單體的比例一般約1摩爾單功能單體，和約0.01到0.2摩爾多官能單體，以獲得軟的基礎材料顆粒。多功能單體的比例可以增加到約0.2到0.5摩爾，以獲得硬的基礎材料顆粒。單獨的多官能單體可用于獲得更加硬的顆粒。
聚合引發劑也沒有特別的限制，使用通常采用的azobis型和/或過氧化物型。
可以使用懸浮穩定劑例如離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑和有兩親性的聚合物或它們的混合物，來防止油滴自身之間的聚集。
形成的粒子的直徑通常約2到500μm。優選的粒子直徑包括2到30μm，更優選的約2到10μm。當目的是大規模高純度地純化核酸時，所述粒子的直徑是約10到100μm，當從粗制貯存溶液分離目標產品時，所述粒子的直徑可以是100到500μm，更優選約200到400μm。為調整粒子直徑，可以在聚合作用期間調整攪拌器的轉速。當需要小直徑的粒子時，轉數的數值可以升高，當期望大的粒子時，轉數的數值可以降低。在此，由于使用的稀釋劑被用于調整形成的粒子中的孔洞，稀釋劑的選擇是特別重要的。作為基本的概念，對于將用于聚合作用的溶劑，通過用不同方式組合對于單體而言是不良溶劑的溶劑和對于單體而言是良好溶劑的溶劑，來進行調整。取決于需要分離的核酸的分子大小適當地選擇孔洞直徑的大小，但是優選的，對于用于疏水性相互作用層析的填充材料所述孔洞的直徑在500到4000埃的范圍內，對于用于離子交換層析的填充材料所述孔洞的直徑在1500到4000埃的范圍內。
在疏水性相互作用層析中，對于分離不同疏水性的核酸優選的通過分別利用不同疏水性的填充材料，基礎材料的表面改性是重要的。
疏水基團可以從長鏈或分支的基團中選擇，包括具有2到20個碳原子的飽和烴基團或不飽和烴基團。芳香環也可被包括在烴基團內。
疏水基團也可以在具有下式的化合物中選擇 其中n＝0到約20，亞甲基基團可以是直鏈或分支的，m＝0到約3，烴基團可以是直鏈或分支的，A是C＝O基團或醚基團，但是亞甲基基團可以在沒有A的情況下直接與基礎材料結合。
疏水基團可以進一步包括具有2到20個碳原子的烷撐二醇(alkyleneglycol)的醚基團，其由0到10個重復單元組成，其中與基礎材料反應的功能基團的對端可以是按照原樣留下的OH基團，或可以用1到4個碳原子的烴基團帽化。
以上描述的疏水基團可以單獨地使用，或在混合物中使用以修飾表面。
對于象質粒一樣的低疏水性，6到20個碳原子的烴基的鏈是優選的。具有2到15個碳原子的烴基長鏈用于分離高疏水性的化合物，例如來源于大腸桿菌的RNA和人類和動物細胞中的RNA。具有4到18個碳原子的烴基用于分離相對低疏水性的化合物，例如來源于大腸桿菌的DNA和人類及動物細胞中的DNA。
在分離這些化合物時，不限于所述的例子，可以適當地選擇化合物來修飾表面。實際上，填充材料的疏水性程度取決于培養基中的鹽濃度或用于吸附的洗脫液中的鹽濃度而變化。此外，填充材料的疏水性程度根據導入基礎材料的基團數量的不同而不同。
疏水性相互作用層析的基礎材料的孔的直徑具體優選500到4000埃，但取決于希望分離的核酸的分子大小可以從所述范圍中適當地選擇。一般地，因為核酸在填充材料上的保存以及吸附能力(樣品引導(leading))由于孔的直徑不同而不同，優選的對大的分子核酸使用大孔隙直徑的基礎材料，對小的分子核酸使用小孔隙直徑的基礎材料。
例如，使用含鹵素化合物和/或羰基鹵化物和催化劑例如FeCl3、SnCl2或AlCl3，并利用Friedel-Craft反應，苯乙烯基礎材料可以與包含烴基長鏈的疏水基團反應，有可能作為去鹵素化合物和/或酰化的化合物直接在基礎材料中添加芳香環。在基礎材料是含有鹵素基團的粒子的情況下，例如，使用在待添加的功能基團中含有OH的化合物，如丁醇，和利用Williamson反應和堿性催化劑例如NaOH或KOH，有可能通過醚鍵導入功能基團。在期望添加的功能基團是含氨基的化合物如己胺的情況下，有可能使用堿性催化劑例如NaOH或KOH并利用去鹵素酸性反應來添加。相反地，對于含有OH基團的基礎材料，如果預先將環氧基、鹵素基團或羰基鹵化物基團導入到期望添加的功能基團中，有可能通過醚或酯鍵導入功能基團。對于含有環氧基的基礎材料，如果與帶有包含在功能基團中的OH基團或氨基的化合物反應，有可能通過醚或氨基鍵導入功能基團。此外，在期望添加的功能基團含有鹵素基團的情況下，有可能通過使用酸催化劑通過醚鍵添加功能基團。由于導入到基礎材料中的功能基團的比例受到期望分離的目標產品的疏水性的影響，它不能被限制，但是一般地，每1g干燥基礎材料添加具有約0.05到4.0mmol功能基團的填充材料是適合的。
對于表面改性，描述了在形成基礎材料或粒子之后通過后期反應添加功能基團的方法。根據相同的方法進行表面改性，其中基礎材料在使用聚合之前添加的單體和所述功能基團的聚合作用之后形成。
基礎材料也可以是多孔的硅膠。制造硅膠的方法包括，使用例如烷基三甲氧基硅烷的化合物直接將硅烷偶聯到根據″Latest High-Speed LiquidChromatography″，289頁以后(Toshio Nambara和Nobuo Ikegawa撰寫，TokyoHirokawa Bookstore 1988年出版)中描述的方法制造的粒子。在使用含有環氧基的硅烷偶聯劑連接硅烷之前或之后，可以根據上述方法添加功能基團。導入的功能基團的比例為每1g干燥基礎材料添加約0.05到4.0mmol的功能基團是適合的。
將洗脫液用于疏水性相互作用層析分離或純化步驟。通常，使用兩種類型的洗脫液。一種洗脫液含有高濃度的鹽，而第二洗脫液含有低濃度的鹽。可以使用包括逐步地從高鹽濃度的洗脫液置換為低鹽濃度的洗脫液的洗脫方法、和連續地將組成從一種洗脫液變為另一種的梯度洗脫方法。可以使用通常用于疏水性相互作用層析的緩沖液和鹽。對于含有高濃度的鹽的洗脫液，1.0到4.5M的鹽濃度和pH值6到8的水溶液是具體優選的。對于含有低濃度的鹽的洗脫液，0.01到0.5M的鹽濃度和pH值6到8的水溶液是具體優選的。通常，硫酸胺和硫酸鈉可被用作鹽。
可以通過依次組合導入了弱疏水性功能基團的填充材料和導入了強疏水性功能基團的填充材料進行疏水性相互作用層析質粒DNA純化步驟。實際上，培養基培養的大腸桿菌含有大量疏水性不同的各種成分，例如多聚糖、大腸桿菌基因組DNA、RNA質粒和蛋白質。還已知的是，甚至在核酸自身之間液存在疏水性差異。與質粒相比，成為混雜物的蛋白質具有更高的疏水性。
許多疏水性相互作用層析樹脂時商業上可獲得的，例如Fractogelpropyl、Toyopearl Source isopropyl、或任何其他具有疏水基團的樹脂。最優選的樹脂是Toyopearl散裝聚合介質。Toyopearl是綜合了高的機械和化學穩定性的甲基丙酸烯聚合物。樹脂可以作為非功能化的“HW”系列樹脂獲得，可以用表面化學作用衍化用于離子交換層析或疏水性相互作用。可以使用具有不同的表面化學特性和疏水性水平的四種類型的Toyopearl HIC樹脂。Toyopearl HIC樹脂的疏水性根據以下系列而增加Ether、Phenyl、Butyl和Hexyl。具有1000埃孔隙直徑的、優選的Toyopearl HIC樹脂(即，ToyopearlHW-65)的結構顯示如下
以上描述的Toyopearl樹脂可以具有各種粒子大小級別。Toyopearl 650C具有約50到150μm的粒子大小，優選的約100μm，而Toyopearl 650M具有約40到90μm的粒子大小，優選的約65μm，Toyopearl 650S具有約20到50μm的粒子大小，優選的約35μm。公知的是粒子大小影響分辨率，即，從C到M到S粒子大小級別分辨率提高，因而具有越來越小的粒子大小。用于根據本發明分離和純化質粒DNA的方法中HIC層析步驟最優選的Toyopearl樹脂是丁基Toyopearl(Toyopearl butyl)-650S，其是由TosohBioscience提供的商品。
根據優選的實施方式，進行進一步的滲濾步驟。根據本領域已知的標準技術，在這個過程中適合使用標準的、商業上可獲得的滲濾材料。優選的滲濾方法是取決于質粒的大小使用具有30,000到500,000范圍內的分子量截留值的超濾膜。這個滲濾步驟容許進行緩沖液交換，隨后進行濃縮。通過切向流動過濾(膜截留值，30kDa)將洗出液濃縮3到4倍達到約2.5到3.0mg/mL的目標濃度，濃縮物通過以恒定體積用10倍體積的鹽水滲濾進行緩沖液交換，用鹽水調節到目標質粒濃度。根據濃縮物樣品在260nm的吸光率計算NV1FGF濃度。通過0.2μm空艙(capsule)過濾器過濾NV1FGF溶液，并分成幾個等分量，在2-8℃保存于冷藏室中的容器中直到進一步的處理。這產生了純化的濃縮物，超螺旋質粒的質粒DNA濃度為約70％、75％、80％、85％、90％、95％和優選的99％。使用這個方法總的質粒回收為至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率60％。
依據這個實施方式，根據以下條件進行滲濾步驟對步驟a)和步驟b)使用的緩沖液為i)第一次滲濾(步驟a)，利用12.5到13.0倍體積的50mM Tris/HCl、150mM NaCl，pH 7.4(稱為緩沖液I)，和ii)對以上步驟a)的保留物進行第二次滲濾(步驟b)，利用3.0到3.5倍體積的鹽水賦形劑(150mM NaCl)。根據本發明的這個優選的滲濾步驟有效地和廣泛地除去硫酸銨和EDTA。并且，在這個滲濾步驟之后，獲得了合適的生理學NaCl濃度(約150mM)，最終Tris濃度低于1mM(200μM到1mM之間)。
通過使用所述滲濾步驟獲得的質粒DNA制劑包括NaCl作為鹽水賦形劑和適當濃度的Tris緩沖液以維持或控制pH值在7和7.5之間。根據本申請的質粒DNA制劑是特別有用的，因為它們的質粒DNA可以令人驚訝地以穩定的不降解的形式、在這些條件下、在5℃到達25℃即在室溫，保存延長的時間。
如所述，根據本發明的分離高純度質粒DNA的方法可以通過用常規方法簡單操作大批量獲得。
如上所述的裂解方法，或本領域公知的任何其它裂解方法之后，可以使用純化質粒的方法。例如，可以使用含有質粒的微生物細胞的流通熱裂解。這個過程特別地在國際公開WO 96/02658中描述了。這個具體的換熱器由形成螺管的10ft.x 0.25英寸O.D.不銹鋼管組成。該螺管被完全地浸沒到恒定高溫水浴中。該螺管的滯留(hold-up)體積約50mL。熱電偶和溫度計分別被用于測量進口和出口溫度以及水浴溫度。使用帶有硅樹脂管的Masterflex螺形壓縮泵(peristaltic pump)將產品流泵入加熱螺管中。細胞溶胞產物流出螺管，然后在Beckman J-21分批式離心機中離心用于澄清。在離心之后，可以使用根據本發明的純化方法純化質粒DNA。
選擇性的細胞裂解可以利用串聯的靜態混合器。實際上，如WO97/23601所描述的(通過引用合并在此)，第一靜態混合器用于裂解通過第一靜態混合器的細胞，和用于沉淀通過第二靜態混合器的細胞溶胞產物，可被用作在根據本發明的純化質粒DNA方法之前裂解細胞的可選方法。使用靜態混合器，大量細胞可以被輕柔地和連續地以流線方式(in-line)裂解，將其他靜態混合器置于流線上來完成其他功能，例如稀釋和沉淀。在本發明的方法中有用的適合的靜態混合器包括本領域稱為靜態或不動混合器的任何流通(flow through devise)裝置，具有足夠的長度以允許本發明的方法。例如，為了裂解細胞，靜態混合器將需要具有一定長度，其將提供裂解溶液和細胞之間的足夠的接觸時間，以使得在通過混合器期間目標細胞得以裂解。在優選的實施方式中，適合的靜態混合器含有含有內部螺旋結構，其使得兩種液體以相反的旋流相互接觸，使得液體在湍流中混合在一起。
根據本發明分離和純化質粒DNA的方法可被用于分離和純化任何大小任何類型的載體。可通過根據本發明的方法分離的質粒DNA的大小范圍從約5kb到約50kb，優選的15kb到50kb，該DNA包括約3kb的載體骨架(backbone)、治療基因和相連的調節序列。因而，在本發明中有用的載體主干能夠攜帶約10-50kb或更大的插入物。插入物可以包括來自任何有機體的DNA，但優選的是哺乳動物來源的，除編碼治療蛋白的基因之外可以包括調節序列，例如啟動子，聚腺苷酰化序列、增強子、基因座控制區，等等。編碼治療蛋白的基因可以是基因組來源的，因而含有外顯子和內含子，如其基因組結構所示的那樣，或它可以來源于互補DNA。這種載體可以包括例如，可以以高拷貝數復制的載體骨架，具有用于插入治療基因的多聚接頭、編碼選擇性標記的基因，例如，SupPhe tRNA，四環素卡那霉素抗性基因，并且其在物理上是小和穩定的。質粒的載體骨架有利地允許插入哺乳動物、其他真核、原核或病毒DNA的片段，產生的質粒可以被純化并用于體內或體外的基于質粒的治療。具有相對高拷貝數的載體，即，在20-40拷貝/細胞到1000-2000拷貝/細胞的范圍內，可以通過根據本發明的方法分離和純化。例如，根據本發明的方法，包括pUC復制起點的載體是優選的。pUC復制起點允許更有效的質粒DNA復制和產生比例如pBR322起點的情況增加十倍的質粒拷貝數/細胞。優選的，具有條件復制起點的質粒DNA或如US 2003/1618445中描述的pCOR，可以通過根據本發明的過程分離。產生的高拷貝數大大提高了質粒DNA與染色體DNA、RNA、細胞蛋白和輔因子的比例，改進了質粒產量，便于更容易的下游純化。因此，根據本發明可以使用任何載體(質粒DNA)。代表性的載體包括但不限于NV1FGF質粒。NV1FGF是編碼酸性成纖維細胞生長因子或1型成纖維細胞生長因子(FGF-1)的質粒，對于治療患有末期外周動脈阻塞性疾病(PAOD)或外周動脈疾病(PAD)的患者是有用的。Camerota等(J Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)描述了，患有不可重建的末期PAD的、具有靜息疼痛或組織壞死的51名患者，向大腿和小腿中注射了提高的單個或重復劑量的NV1FGF。隨后評定了各種參數，例如經皮氧壓力，踝和腳趾肱指數，疼痛評估和潰瘍愈合。在NV1FGF施用后觀察到顯著的升高的肱指數、疼痛的減輕、潰瘍大小的消退、改善的灌注。
根據本發明有用的宿主細胞可以是任何細菌菌株，即，革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株，例如大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhimurium)或芽孢桿菌(Bacillus)，能維持如上所述的質粒高拷貝數；例如20-200個拷貝。可以根據本發明使用大腸桿菌宿主菌株，包括HB101、DH1和DH5αF、XAC-1和XAC-1pir 116、TEX2和TEX2pir42(WO04/033664)。含有F質粒或F質粒衍生物的菌株(例如JM109)通常不是優選的，因為F質粒可能與治療性質粒產品共純化。
根據另一個方面，本發明還涉及包含高度純化的質粒DNA的組合物，其基本上沒有污染物或污染物在亞-ppm的范圍內，因而是藥物級別的DNA。根據本發明的藥物級別質粒DNA組合物因而含有亞-ppm(＜0.0001％，即＜0.0001mg每100mg質粒DNA)gDNA、RNA和蛋白質污染物。
藥物級別質粒DNA組合物因而含有低于約0.01％、或低于0.001％、和優選的低于0.0001％、或優選的低于0.00008％(＜0.00008％，即＜0.00008mg每100mg質粒DNA)的染色體DNA或基因組DNA。
藥物級別質粒DNA組合物因而含有低于約0.01％、或低于0.001％、和優選的低于0.0001％、或優選的低于0.00002％(＜0.0002％，即＜0.0002mg每100mg質粒DNA)的RNA污染物。
藥物級別質粒DNA組合物因而含有低于約0.0001％、最優選低于0.00005％蛋白質污染物。
藥物級別質粒DNA組合物因而含有低于0.1EU/mg的內毒素。
藥物級別質粒DNA組合物因而含有在形式上主要是環形，和更確切的說含有超過80％、85％、90％、95％，或99％的封閉環形質粒DNA。
本發明還涉及質粒DNA液體制劑，其在室溫長時間穩定并保持不降解，因而對于用于研究和相關人類治療的質粒DNA的保存是有用的。
因而本發明涉及穩定的質粒DNA制劑，其包含質粒DNA、非常稀的緩沖溶液和鹽水賦形劑，其中所述緩沖溶液以一定濃度存在以維持所述制劑或組合物的pH值在7和7.5之間。
能維持組合物的pH值在7和7.5之間的緩沖溶液由包含Tris[三(羥甲基)-氨基甲烷]、或賴氨酸和選自強酸(例如鹽酸)或弱酸(例如順丁烯二酸、蘋果酸或乙酸)的酸的酸/堿系統，或包含Hepes[2-(4-(2-羥基乙基哌嗪)-1-基)乙磺酸]和強堿(例如氫氧化鈉)的酸/堿系統組成。緩沖溶液也可以包含Tris/HCl、賴氨酸/HCl、Tris/順丁烯二酸、Tris/蘋果酸、Tris/乙酸、或Hepes/氫氧化鈉。
優選的，pH值維持在7和7.5之間，更具體約7.2。
可用于本發明的制劑中的鹽水賦形劑優選的是濃度在100和200mM之間，優選的濃度約150mM的NaCl。其他鹽水賦形劑可以包含陰離子和陽離子，選自由醋酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、SO42-、Cl-、Br-、NO3-、Mg2+、Li+、Na+、K+和NH4+構成的組。
確定緩沖溶液的摩爾濃度以便在一定限制和一定體積內發揮緩沖效應，其中pH值穩定在7和7.5之間。根據本發明的穩定的質粒DNA保存組合物因而包含質粒DNA、鹽水賦形劑和緩沖溶液，其中所述緩沖溶液以達1mM的濃度存在，優選在250μM和1mM之間，或優選在400μM和1mM之間，以維持所述制劑或組合物的pH值在7和7.5之間。在根據本發明的緩沖系統之中，濃度400μM的Tris緩沖液溶液給出了特別令人滿意的結果，因而在本發明的質粒制劑中是優選的。
如在以下的實施例中所示，根據本發明的質粒DNA制劑展現出在4℃和在室溫(RT)，例如20或25℃的極好的穩定性。具體地，質粒DNA制劑在25℃例如RT，可使用1個月、2個月、3個月、到6個月和達12個月的持續時間。
本發明因而涉及包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑的組合物，其中所述緩沖溶液以一定濃度存在，足以在4℃到25℃將質粒DNA保持在穩定形式。
本發明還涉及包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑的組合物，其中所述緩沖溶液以一定濃度存在，其足以在4℃到25℃將質粒DNA以穩定形式保存1個月、2個月、3個月、到6個月和達12月的延長的時間。
實際上，保存在5℃或在室溫的質粒DNA在長時間期間展現出非常低的脫嘌呤作用和開環化速率，低于20％、15％、10％、5％或≤1％每月。
根據本發明組合物可以進一步包含佐劑，例如選自聚乙二醇、pluronic、或聚山梨酸酯糖、或醇的聚合物。
根據另一個方面，本發明涉及在組合物中保存質粒DNA的方法，包括a)從質粒DNA制備純化的樣品和b)將所述質粒DNA的純化的樣品與鹽水賦形劑和緩沖溶液組合，所述緩沖溶液維持產生的組合物的pH值在7和7.5之間。
本發明還涉及在達到約20℃的溫度在組合物中保存質粒DNA的方法，包括a)制備質粒DNA的純化的樣品，b)將所述質粒DNA的純化的樣品與鹽水賦形劑和緩沖溶液組合，其中所述緩沖溶液以低于1mM、或250μM到1mM、優選400μM的濃度存在；和c)在約4℃到達約20℃的溫度保存所述質粒DNA組合物。
實施例克隆和分子生物學的普通技術在文獻中(Maniatis et al.，T.，E.F.Fritsch，and J.Sambrook，1989.Molecular cloninga laboratory manual，second edition.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York；Ausubel F.M.，R.Brent，R.E.Kinston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G Seidman and K.Struhl.1987.Current protocols in molecular biology 1987-1988.John Willey and Sons，NewYork.)描述了分子生物學的傳統方法，例如用限制性內切酶消化、凝膠電泳、轉化大腸桿菌、核酸的沉淀等等。通過根據已經公開的方案(Ausubel et al.，1987)的鏈終止法確定核苷酸序列。
限制性內切酶由New England Biolabs，Beverly，MA(Biolabs)提供。
為了進行連接，DNA片段在包含50mM Tris/HCl pH 7.4、10mMMgCl2、10mM DTT、2mM ATP的緩沖液中，在存在噬菌體T4DNA連接酶(Biolabs)的情況下保溫。
用Biosearch 8600自動DNA合成儀，根據廠家的推薦，用在β位置被cyanoethyl基團保護的亞磷酰胺(phosphoramidite)(Sinha，N.D.，J.Biernat，J.McManus and H.K？ster，1984.Polymer support oligonucleotide synthesis，XVIIIUse of β-cyanoethyl-N，N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragmentssimplifying deprotection and isolation oo the final product.Nucl.Acids Res.，12，4539-4557Giles，J.W.1985.Advances in automated DNA synthesis.Am.Biotechnol.，Nov./Dec.)，使用亞磷酰胺化學作用合成寡核苷酸。
需要檢測其轉化效力的連接的DNA被用于轉化以下感受態菌株大腸桿菌DH5α[F/endAl，hsdR17，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，Δ(lacZYA-arqF)U169，deoR，Φ80dlac(lacZΔM15)](對于任何Col E1質粒)；或E.coli XAC-pir(對于任何pCor衍生的質粒)。
根據Klein et al.，1980的方案制造質粒DNA的迷你制品(minipreparations)。
LB培養基用于大腸桿菌菌株的生長(Maniatis et al.，1982)。菌株在37℃保溫。細菌在補充有適合的抗生素的LB培養基的平皿上涂布。
實施例1在連續裂解系統的螺管中使用的直徑到流速的調整根據雷諾數(Reynolds numbers)的計算。因為以下的分析假定流體的性狀是牛頓性的(Newtonian)，以下報告的數字僅是在B1a中完全有效和在B2中在一定程度上有效。
雷諾數的數值容許本領域的技術人員確定遇到的性狀(behavior)的類型。在此，我們將僅關注管道中的流體流動(水力工程)。
1)非牛頓流體在工業中最常遇到的兩種非牛頓流體是Bingham和Ostwald de Waele。
在這種情況下，雷諾數(Re)如下計算ReN是廣義雷諾數ReN＝(1/(2n-3))×(n/3n+1)n×((ρ×Dn×w2-n)/m) (1)D橫截面的內徑(m)ρ流體的體積質量(volum nass)(kg/m3)w流體的空間速度(m/s)n流動性狀(behavior)指數(無量綱的)m流體稠度系數(dyn.sn/cm2)n和m是經驗性確定的(流變性狀的研究)。
2)牛頓流體對于第一節，在式(1)中我們有Re＝f(內徑、μ、ρ和u)因為n和m是μ的函數。
Re＝(u×D×ρ)/μ (2)ρ流體的體積質量(kg/m3)μ流體的粘度(Pa.s，1mPa.s＝1cP)D橫截面的內徑(m)u流體的平均空間速度(m/s)式(1)，對于n＝1，換算成式(2)。
Q＝流速(m3/h)和S＝橫截面的表面面積(m2)和如果μ是cP中給出的，則Re＝(4×(Q/3600)×ρ)/((μ/1000)×∏×D) (3)在圓形的導管中，低于2500的雷諾數流動是層流，2000和500,000之間的雷諾數流動是水力學平滑的湍流。在2000和2500之間的界限被故意地含糊，兩種性狀類型都被用于確定將會發生什么，根據經驗進行選擇。
3)計算因為n和m通常是未知的，以下的近似值被用于估計趨勢牛頓流體(在所有橫截面中)ρ＝1000kg/m3(所有流體)μ＝B1a中為5cP和B1b中為40cP(我們的數據)B2中為2.5cP(我們的數據)對于稱為結構1和結構2(沒有B1b管道)的兩種標準管道結構使用式(3)進行以下的計算表2
在這兩種結構中，在所有的階段流動是層流，溶液不能充分地互相混合。
對于其他管道結構(非B1b管道)，我們有
表3
對于同時存在B1a和B1b管道的各種管道結構使用式(3)進行類似的計算表4
明顯地，可以通過調整管道直徑和流速獲得預定的雷諾數值。
對于B2或對于兩節的B1(B1a和B1b)，本領域的技術人員可以預想許多直徑和長度的組合。例如，B1的第一部分可以從6mm減少到3mm來降低長度和提高攪動。另外，n和m可以通過對流體的流變特性的研究來確定，并用來確定管道的正確特征。
除了攪動效率之外，還要考慮攪動的持續時間，在本發明的某些實施方式中這可以通過調整螺管的長度來獲得。
管道的直徑或流體速度看起來在式(1)中不支配非牛頓流體(數據未顯示)。換句話說，如果式(1)被用來計算B1b和B2內的情況，與改變流速相比，改變直徑看起來不會更有效。當需要高流速時，直徑可以隨流速一同改變。
這些原則可被用作盡可能地在B1b和B2中限制攪動的基礎，以避免gDNA斷裂。
在裂解期間，只要gDNA不變性，攪動可以是相當有力的。在B1的開始處降低直徑使得提高攪動(提高的Re)以充分混合溶液2和細胞成為可能。另一方面，當細胞被裂解時，可以降低攪動和對管壁的摩擦力以避免核酸斷裂。增加直徑使得降低攪動(降低的Re)和摩擦(降低的速度)成為可能。
M1混合流體。
B1a在裂解開始時對混合進行微調對流現象(大混合macromixing)。
B1b使得變性發生加上擴散現象(微量混合)。
假定廣義雷諾數對非牛頓流體具有與標準雷諾數對牛頓流體一樣的意義。具體地，假定在圓形截面的導管中層流法的界限是ReN＜2300。
中和作用在B2內進行。由于引起太有力的的攪動和與管壁的摩擦力(機械應力)，高流速傾向于提高基因組DNA的斷裂。使用大直徑的管道使得降低攪動(Re)和摩擦力(速度)成為可能。我們在此放置了小直徑管道(6mm)來避免不充分的攪動。我們的觀察結果顯示，為了避免“強力和快速”攪動中和的溶胞產物，B2僅有小直徑管道是最佳的。
實施例2我們可以將CL系統分解成5個步驟在特定的實施方式中，結構如下1)混合細胞(溶液1中)+溶液2(M1+3m的6mm管道)。開始通過SDS的細胞裂解，只要DNA不變性就沒有斷裂的風險。
2)裂解結束和gDNA變性(13m、16mm的管道)。
3)混合溶胞產物+溶液3(M2+3m、6mm的管道)。
4)在4℃收獲中和的溶胞產物5)在4℃過夜沉降絮狀物和gDNA大片段以下條件可用于進行連續裂解-溶液1EDTA 10mM、葡萄糖(Glc)9g/l和Tris HCl 25mM，pH 7.2。
-溶液2SDS 1％和NaOH 0.2N。
-溶液3乙酸2M和乙酸鉀3M。
-流速60l/h溶液1和溶液2-流速90l/h溶液3。
-細胞用溶液1調整到38.5g/l。
溶液1中的細胞通過將它們分散到溶液2中的3個管口，溶液2從反方向到達。
-混合器M1具有幾何結構，使得優化雙流體的的混合成為可能(參見附圖2，混合器的示意圖)。
-混合器M1后的管道的第一個部分是B1a，接下來的部分是B1b。
B1a3m長、6mm直徑，2.5秒停留時間B1b13m長、16mm直徑、77秒停留時間本發明的過程提高了有關效率的優點，概述為分散、短暫的劇烈混合，和通過擴散的溫和混合。
使用本發明的過程，裂解的細胞的數目提高了，因而回收的pDNA的數量提高了。
擴散的想法是特別重要的，因為由于流體的性質，特別是粘彈性難以混合這些流體。
本發明的過程使得限制剪切應力因而限制gDNA的斷裂成為可能，便于在隨后的層析純化中除去gDNA。
然后的問題是與溶液3混合，其可以被冷卻到4℃。在一個實施方式中，本發明的過程使用-混合器M2，其是內徑約10mm的Y形裝置-管道B2的部分放置在混合器M2之后。
B22m的6mm管道；停留時間1秒以下的表5給出了比較測試中獲得的結果，顯示了我們的連續裂解法與分批裂解相比的優點。
表5
實施例3
使用的柱是1ml HiTrap柱，用NHS(N-羥基琥珀酰亞胺，Pharmacia)活化，連接到螺形壓縮泵(輸出＜1ml/min。使用的特異性寡核苷酸在5’末端具有NH2基團，其序列如下5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)用于這個實施例的緩沖液如下偶聯緩沖液0.2M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3。
緩沖液A0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH 8.3。
緩沖液B0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH 4。
所述柱用6ml的1mM HCl洗滌，然后將稀釋在偶聯緩沖液(1ml中50nmol)中的寡核苷酸施加到柱上，在室溫保持30分鐘。所述柱按6ml緩沖液A然后6ml緩沖液B的順序洗滌三次。因而寡核苷酸通過CONH連接共價地結合到柱上。將柱保存在4℃，PBS、0.1％NaN3中，可使用至少4次。
合成以下兩種寡核苷酸寡核苷酸48175’-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAGAGAGAAGAA GAAGAAGG-3’(SEQ ID NO13)和寡核苷酸48185’-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTTTCTCG-3’(SEQ ID NO14)這些寡核苷酸，當雜交并克隆到質粒中時，向相應的質粒中導入同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO15)，如上所述。
相應于這兩個雜交寡核苷酸的序列被克隆在質粒pBKS+(StratageneCloning System，La Jolla CA)的多克隆位點，該質粒攜帶氨芐青霉素抗性基因。為此，按以下方式雜交寡核苷酸1μg的所述兩種寡核苷酸被一同放置在40ml最終緩沖液中，所述緩沖液包含50mM Tris-HCl pH 7.4、10mMMgCl2。將這個混合物加熱到95℃，然后置于室溫，使得溫度緩慢降低。在30μl最終緩沖液中，10ng的雜交的寡核苷酸的混合物與用BamHI和EcoRI消化的200ng質粒pBKS+(Cloning System，La Jolla CA)連接。連接之后，將等分量轉化到DH5a中。將轉化的混合物涂布到補充有氨芐青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的L培養基上。在這個培養基中重組克隆應當顯示沒有藍色著色，與允許大腸桿菌β-半乳糖苷酶的片段ω的α-互補的親本質粒(pBKS+)相反。在迷你制備(minipreparation)來自6個克隆的質粒DNA之后，它們全部顯示了位于pBKS+的EcoRI和BamHI位點之間的PstI位點的消失，和含有多克隆位點的448-bp PvuII條帶的分子量增加。選擇一個克隆，相應的質粒被命名pXL2563。通過使用質粒pBKS+(Stratagene Cloning System，LaJolla CA)的引物-20(5’-GACCGGCAGCAAAATG-3’SEQ ID NO16))(Viera J.and J.Messing.1982.The pUC plasmids，an M13mp7-derived system forinsertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene，19，259-268)測序證實克隆的序列。根據供應商的推薦根據Wizard Megaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化質粒pXL2563。這個質粒DNA制備物此后用于以下描述的實施例中。
在如1.1.描述的與寡核苷酸偶聯的HiTrap柱上，從還含有質粒pBKS+的溶液中純化質粒pXL2563。
用于這個純化的緩沖液如下緩沖液F2M NaCl、0.2M醋酸鹽，pH 4.5到5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml緩沖液F洗滌，將質粒(400μl緩沖液F中的20μgpXL2563和20μg pBKS+)施加到柱上，在室溫下保溫2小時。用10ml緩沖液F洗滌柱，然后用緩沖液E進行洗脫。在1％瓊脂糖凝膠上電泳和溴化乙錠著色后檢測質粒。溶液中質粒的比例通過測量它們對大腸桿菌的轉化活性來估計。
從含有30％pXL2563和70％pBKS+的混合物開始，在柱出口收獲了含100％pXL2563的溶液。通過260和280nm的OD比值估計的純度，從1.9提高到2.5，這顯示了通過這種方法除去了污染蛋白質。
實施例4將寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1))偶聯到柱上通過如實施例3描述的進行。為了偶聯，寡核苷酸在5’末端用胺基修飾，所述胺基通過含有6個碳原子的臂與間隔區的磷酸酯連接(Modified oligonucleotide Eurogentec SA，Belgium)。根據供應商的推薦使用Wizard Megaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化質粒pXL2563。用于這個實施例的緩沖液如下緩沖液F0-2M NaCl、0.2M醋酸鹽，pH 4.5到5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml緩沖液F洗滌，然后將在400μl緩沖液F中稀釋的100μg pXL2563施加到柱上，在室溫保溫2小時。用10ml緩沖液F洗滌柱，然后用緩沖液E進行洗脫。通過在260nm測量光密度給質粒定量。
在這個實施例中，結合在緩沖液中進行，緩沖液的NaCl的摩爾濃度為從0到2M(緩沖液F)。當NaCl的摩爾濃度下降時，純化產量減少。結合緩沖液的pH值可以從4.5到5，純化產量在4.5更好。也有可能使用堿性pH值的另一種洗脫緩沖液因而洗脫用包含50mM硼酸鹽，pH 9，0.5mMEDTA的緩沖液進行。
將寡核苷酸(5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(SEQ ID NO1)偶聯到柱上如實施例3描述的進行。根據供應商的推薦使用WizardMegaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化質粒pXL2563。用于這個緩沖液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
所述柱用6ml緩沖液F洗滌，然后將在400μl緩沖液F中稀釋的100μg pXL2563施加到柱上，在室溫保溫一個小時。用10ml緩沖液F洗滌柱，然后用緩沖液E進行洗脫。測量通過寡核苷酸柱之前和之后存在于質粒樣品中的基因組或染色體大腸桿菌DNA的含量。使用大腸桿菌galK基因中的引物通過PCR給這個基因組DNA定量。根據以下方案這些引物的序列由Debouck et al.(Nucleic Acids Res.1985，13，1841-1853)描述5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(SEQ ID NO17)和5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(SEQ ID NO18)。
反應培養基包括，在25μl CR緩沖液(Promega France，Charbonnières)中1.5mM MgCl2；0.2mM XTP(Pharmacia，Orsay)；0.5μM引物；20U/mlTaq聚合酶(Promega)。根據以下順序進行反應-95℃ 5分鐘-95℃ 10秒 30個循環60℃ 30秒78℃ 1分鐘
-78℃ 10分鐘。
擴增的DNA片段長度124個堿基對，在存在SybrGreen I(MolecularProbes，Eugene，USA)的情況下通過在3％瓊脂糖凝膠上電泳分離，然后參考來自大腸桿菌菌株B(Sigma，ref D4889)的Ultrapur基因組DNA系列進行定量。
實施例5這個實施例描述了以所謂“迷你制備”規模從細菌培養物的澄清溶胞產物純化質粒DNA離心1.5ml含有質粒pXL2563的DH5α菌株過夜培養物，將沉淀重懸浮在100μl 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，pH8，10mMEDTA中。添加200μl 0.2M NaOH，1％SDS，翻轉試管進行混合，然后添加150μl、3M乙酸鉀，pH 5，翻轉試管混合。在離心之后，收回上清液，加載到如實施例1所述獲得的寡核苷酸柱上。結合、洗滌和洗脫與實施例3中描述的相同。從1.5ml培養物中回收了大約1μg質粒。獲得的質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠著色分析，呈“超螺旋”環狀DNA的單個條帶的形式。在通過這個方法純化的質粒中沒有檢測到高分子量(染色體)DNA，或RNA的痕跡。
實施例6這個實施例描述了在與實施例5相同的條件下進行的質粒DNA純化實驗，從20ml含有質粒pXL2563的DH5α菌株細菌培養物開始。用2ml 0.2M NaOH，1％SDS進行裂解，用1.5ml 3M乙酸鉀，pH 5進行中和。然后用3ml 2-丙醇(propanol)沉淀DNA，沉淀加入0.5ml 0.2M醋酸鈉，pH 5，0.1M NaCl中，加載到如以上實施例描述獲得的寡核苷酸柱上。柱的結合、洗滌和洗脫如以上實施例描述的進行，不同的是洗滌緩沖液的NaCl摩爾濃度是0.1M。獲得的質粒，通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠著色分析，呈“超螺旋”環狀DNA的單個條帶的形式。純化的質粒中沒有檢測到高分子量(染色體)DNA，或RNA的痕跡。用限制性內切酶消化質粒得出3千堿基的預期分子量的單個條帶。使用的質粒含有盒，所述盒含有巨細胞病毒啟動子、螢光素酶編碼基因和來源于質粒pXL2563的同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO15)。含有這個質粒的菌株DH1(Maniatis et al.，1989)在7升發酵罐中培養。從200克細胞制備澄清的溶胞產物細胞沉淀置入2升25mM Tris，pH 6.8，50mM葡萄糖，10mM EDTA中，向其中添加2升0.2M NaOH，1％SDS。通過添加一升3M乙酸鉀中和溶胞產物。滲濾之后，將4ml這種溶胞產物施加到5ml HiTrap-NHS柱上，所述柱根據實施例3中描述的方法與序列(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO1)的寡核苷酸偶聯。如以上實施例描述的進行洗滌和洗脫。
實施例7這個實施例描述了帶有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸的使用。使用的寡核苷酸的序列如下5′-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3′(SEQ ID NO19)這個寡核苷酸具有5’末端的NH2基團。MeC＝5-甲基胞嘧啶。這個寡核苷酸允許質粒pXL2563在實施例1的條件下用pH 5的結合緩沖液純化(從而降低了質粒降解的風險)。
實施例8在以上實施例中，使用的寡核苷酸是在5’末端用胺基修飾的，所述胺基通過含有6個碳原子的臂NH2-(CH2)6與磷酸酯連接。在這個實施例中，胺基與5’末端的磷酸酯通過含有12個碳原子的臂NH2(CH2)12連接。寡核苷酸的偶聯和過柱用緩沖液F2M NaCl，0.2M醋酸鹽，pH 4.5，如實施例3中描述的進行。這個寡核苷酸使得具有更好的純化產量成為可能獲得了53％的產量，而使用含有6個碳原子的寡核苷酸，這個產量是相同條件下的產量的45％。
實施例9在實施例3描述的克隆策略之后，構建另外兩個攜帶同型嘌呤-同型嘧啶序列的質粒含有序列(GGA)16，(SEQ ID NO20)的質粒pXL2725，和含有序列(GA)25(SEQ ID NO21)的質粒pXL2726。
質粒pXL2725和pXL2726，類似于質粒pXL2563，根據實施例3中描述的克隆策略構建，使用以下寡核苷酸對
59865′-GATCC(GA)25GGG-3′(SEQ ID NO22)59875′-AATTCCC(TC)25G-3′(SEQ ID NO23)59815′-GATCC(GGA)17GG-3′(SEQ ID NO24)59825′-AATT(CCT)17CCG-3′(SEQ ID NO25)寡核苷酸對5986和5987被用于通過將寡核苷酸克隆到pBKS+(Stratagene Cloning System，La Jolla CA)的BamHI和EcoRI位點來構建質粒pXL2726，而寡核苷酸5981和5982被用于質粒pXL2725的構建。使用與構建質粒pXL2563相同的實驗條件，僅僅改變寡核苷酸對。類似地，克隆序列通過在質粒上測序證實。這允許看出，質粒pXL2725具有相對于預期序列的修改不是序列GGA重復17次，而是存在GGAGA(GGA)15(SEQID NO26)。
實施例10與這些同型嘌呤序列形成三螺旋的寡核苷酸根據實施例1.1中描述的技術偶聯到HiTrap柱，序列5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3′(SEQID NO27)的寡核苷酸被用于純化質粒pXL2725，序列5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQ ID NO28)的寡核苷酸被用于純化質粒pXL2726。
這樣獲得的兩個柱允許根據實施例2中描述的技術純化相應的質粒，使用以下緩沖液緩沖液F2M NaCl、0.2M醋酸鹽，pH 4.5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
對于pXL2725和pXL2726獲得的產量分別是23％和31％。
實施例11這個實施例說明了存在于質粒中的特異性序列的長度對純化產量的影響。
用于這些實驗以表明本發明的組合物的活性的報告基因是編碼螢光素酶(Luc)的基因。
質粒pXL2621含有含661-bp巨細胞病毒(CMV)啟動子的盒，所述巨細胞病毒啟動子是通過用限制性內切酶MluI和HindIII從pcDNA3(InvitrogenCorp.，San Diego，CA)中切出，在編碼螢光素酶的基因的上游、在MluI和HindIII位點，克隆到載體pGL basic Vector(Promega Corp.Madison，WI)中。使用分子生物學的標準技術構建這個質粒。
按以下方式構建質粒pXL2727-1和pXL2727-2兩微克質粒pXL2621用BamHI線性化；通過在65℃處理10分鐘鈍化酶；這時，如對于質粒pXL2563的構建所描述的那樣雜交寡核苷酸6006和6008。
60065′-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3′(SEQ ID NO29)60085′-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3′(SEQ ID NO30)。
將這個雜交混合物克隆到質粒pXL2621的BamHI末端，在轉化到DH5α中之后，重組的克隆通過PstI酶限制性分析鑒別，因為寡核苷酸導入了PstI位點。選擇兩個克隆，克隆的片段的核苷酸序列使用引物(6282，5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(SEQ ID NO31))作為測序反應引物來證實(Viera J.and J.Messing，1982.The pUC plasmids an M13mp7-derivedsystem for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universalprimers.Gene 19259-268)。
第一個克隆(pXL2727-1)含有重復10次的序列GGA。第二個(pXL2727-2)含有序列5′-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO32)。
使用如在實施例3中描述的一個柱，其與寡核苷酸5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO1)偶聯。
質粒pXL2727-1攜帶序列GAA的14個重復。如上所述寡核苷酸僅含有相應雜交序列CTT的7個重復，因而可以在8個不同位置與質粒雜交。質粒pXL2727-2與此相反，具有與結合到柱上的寡核苷酸相同長度的雜交型序列(GAA)7(SEQ ID NO36)。這個寡核苷酸因而可以在pXL2727-2的僅一個位置上雜交。
實驗與實施例4中描述的相同，使用以下緩沖液緩沖液F2M NaCl、0.2M醋酸鹽，pH 4.5。
緩沖液E1M Tris-HCl，pH 9，0.5mM EDTA。
純化產量對于質粒pXL2727-1為29％，對于pXL2727-2為19％。
使用的細胞是NIH 3T3細胞，在實驗前的當天以50,000細胞/孔接種到24孔培養平板中。質粒在150mM NaCl中稀釋，并與lipofectantRPR115335混合。使用等于6的lipofectant正電荷/DNA負電荷比例。渦旋混合物，在室溫放置10分鐘，在無胎兒牛血清的培養基中稀釋，然后以每培養孔1μg DNA的比例添加給細胞。在37℃2小時后，添加10％體積/體積的胎兒牛血清，在存在5％CO2的情況下、37℃保溫細胞48小時。細胞用PBS洗滌兩次，根據所描述的方案(Promega kit，Promega Corp.Madison，WI)在Lumat LB9501光度計(EG and G Berthold，Evry)上測定螢光素酶活性。如實施例8.2中所描述進行純化的質粒pXL2727-1得到的轉染產量兩倍于使用Wizard Megaprep試劑盒(Promega Corp.Madison，WI)純化的相同質粒所獲得的產量。
實施例12以下實施例表現了使用三螺旋親和層析純化pCOR衍生的質粒。這種技術已經被證明去除核酸污染物(具有是宿主基因組DNA和RNA)至常規的層析方法未曾達到的低水平。
三聯體親合凝膠用Sephacryl S-1000 SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作為層析基質來合成。首先用0.2M醋酸鈉(pH 4.7)中的m-高碘酸鈉(3mM，室溫，1h)活化Sephacryl S-1000。如早先描述的用于偶聯蛋白質的情況一樣(Hornsey et al.，J.I mmunol.Methods，1986，93，83-88)，在存在抗壞血酸(5mM)的情況下通過還原胺化作用、通過寡核苷酸的5’-NH2末端部分將寡核苷酸偶聯到所述活化的基質的醛基上。用于這些實驗的同型嘧啶寡核苷酸(來自Eurogentec，HPLC純化)具有與存在于pCOR質粒的復制起點(oriγ)中的短14-mer同型嘌呤序列(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO10)互補的序列(Soubrier et al.，Gene Therapy，1999，6，1482-1488)。如以上討論的，同型吡啶寡核苷酸的序列是5’-TTCTTTTTTTTCTT-3’(SEQ ID NO11)。
對以下質粒進行層析pXL3296(無轉基因的pCOR，2.0kpb)、pXL3179(pCOR-FGF，2.4kpb)、pXL3579(pCOR-VEGFB，2.5kbp)、pXL3678(pCOR-AFP，3.7kbp)、pXL3227(pCOR-lacZ 5.4kbp)和pXL3397(pCOR-B缺失的FVIII，6.6kbp)。所有這些質粒通過兩個陰離子交換層析步驟從如實施例4中所描述獲得的澄清溶胞產物中純化。還研究了通過在CsCl中超速離心純化的質粒pBKS+(pBluescript II KS+來自Stratagene)，所述質粒為一種ColE1衍生的質粒。使用的所有質粒都處于它們的超螺旋(＞95％)拓撲狀態。
在每個質粒DNA純化實驗中，將在6ml 2M NaCl、0.2M乙酸鉀(pH 5.0)中的300μg質粒DNA以30cm/h的流速加載到含有上述寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)的親和柱上。在用5倍體積的相同緩沖液洗滌柱之后，用1M Tris/HCl、0.5mM EDTA(pH 9.0)洗脫結合的質粒，并通過UV(260nm)定量，用Millipore Gen-Pak柱進行離子交換層析(Marquetet al.，BioPharm，1995，8，26-37)。在收集的級分中回收的質粒pXL3296是207μg、pXL3179是196μg、pXL3579是192μg、pXL3678是139μg、pXL3227是97μg，pXL3397是79μg。
當pBKS在這個柱上層析時，未能檢測到質粒結合(＜3μg)。這表明寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO11)與存在于pCOR(oriγ)中的互補14-mer序列5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(SEQ ID NO10)形成穩定的三聯體結構，但不與存在于pBKS中的近相關(closely related)序列5′-AGAAAAAAAGGA-3′(SEQ ID NO8)形成所述三聯體結構。這表明，單個非常見三聯體(在這種情況下T*GC)的引入引起了三聯體結構的完全的去穩定化。
作為對照，當pXL3179在嚴格相似的條件下合成但沒有寡核苷酸的空白柱上進行層析時沒有觀察到質粒結合(＜1μg)。
通過在在此報告的條件下操作這種親合純化柱，對于pXL3296的制備物，宿主基因組DNA的污染水平從2.6％降低到0.07％。類似地，對于pXL3179的制備物，當通過相同的親和柱層析樣品時，宿主DNA的污染水平從0.5％降低到0.008％。
實施例13以下實施例表現了使用三螺旋親和層析純化ColE1衍生的質粒。這種技術已經被證明除去核酸污染物(具體是宿主基因組DNA和RNA)至常規的層析方法未曾達到的低水平。
通過如上述實施例所描述的將具有序列5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO9)的寡核苷酸偶聯到高碘酸鹽氧化的Sephacryl S-1000SF上，來合成三聯體親合凝膠。
質粒pXL3296(沒有轉基因的pCOR)和ColE1衍生的質粒pBKS，在如實施例9描述的條件下，在含有寡核苷酸5’-TCTTTTTTTCCT-3’(SEQ IDNO9)的1-ml柱上進行層析。在收集的級分中回收的質粒pBKS是175μg，pXL3296＜1μg。這表明寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO9)與存在于pBKS中的互補12-mer序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO8)形成穩定的三聯體結構，而不與存在于pCOR中的非常近相關的12-mer序列(5’-AGAAAAAAAAGA-3’)(SEQ ID NO34)形成所述三聯體結構。這表明，單個非常見三聯體(在這種情況下C*AT)的引入可能引起了三聯體結構的完全去穩定化。
實施例14通過以下方法在無擋板的錐形燒瓶中生產種子培養物。將工作細胞庫接種到含有M9modG5培養基的錐形燒瓶中，播種率0.2％v/v。菌株以220rpm在旋轉震搖器中在37℃±1℃下培養約18±2小時直到葡萄糖耗盡。這產生200ml種子培養物。培養物的光密度預期是A600約2-3。
然后在第一發酵罐中產生預培養物。種子培養物無菌地轉移到含有M9modG5培養基的預發酵罐中以確保0.2％(v/v)的播種率，在通風和攪動下培養。pO2維持在40％的飽和度以上。當在16小時后葡萄糖被消耗時，收獲培養物。這產生約30升預培養物。培養物的光密度預期是A600約2-3。
然后在第二發酵罐中產生主要的培養物。將30升預培養物無菌地轉移到裝有270升滅菌的FmodG2培養基的發酵罐中以確保約10％(v/v)的播種率。以分批模式開始培養以建立某些生物量。在約4小時后一旦最初的糖耗盡就開始添加葡萄糖補料。控制通風、攪動、pO2(40％)、pH(6.9±0.1)、溫度(37±1℃)、葡萄糖補料以維持比生長速率接近0.09h-1。在約35小時的補料后結束培養。這產生約400升培養物。培養物的光密度預期是的A600約100。
進行第一分離步驟，稱為細胞收獲。用圓盤層疊離心(disk stackcentrifuge)收獲生物量。濃縮肉湯3至4倍以抵消消耗的培養基，連續地重懸浮在400升無菌的S1緩沖液中。這產生約500升的預調節的生物量。DCW＝25±5g/L。
進行第二分離步驟，稱為濃縮步驟。在S1緩沖液中重懸浮/均化之后，再次用分離器處理細胞以產生濃縮的漿液。這產生約60-80升的洗滌的和濃縮的漿液。DCW＝150±30g/L；pDNA＝300±60mg/L。
然后進行冷凍步驟。將漿液無菌地分配到20-L FlexboyTM袋中(填充到容量的50％)，隨后在進一步的下游處理之前在-20±5℃冷凍。這產生冷凍的生物量。pDNA＝300±60mg/L；超螺旋形式＞95％。
然后進行細胞解凍步驟。將冷凍袋加熱到20℃，細胞漿液用100mMTris氫氯化物、10mM EDTA、20mM葡萄糖稀釋到40g/L，pH 8.0，在細胞裂解前、在攪動下將懸浮液置于20±2℃1h。產生解凍的生物量漿液。pH＝8.0±0.2。
在這個步驟可以使用約20℃的溫度。
然后進行堿裂解步驟。細胞裂解步驟包括將稀釋的細胞懸液用0.2NNaOH-35mM SDS(溶液S2)通過管路混合器泵入，隨后是在螺管中的連續接觸步驟。連續接觸步驟是為了確保完全的細胞裂解和基因組DNA以及蛋白質的變性。在收集到冷卻的攪動容器中之前，裂解的細胞的溶液在管路中與冷卻的3M乙酸鉀-2N乙酸的溶液3(S3)混合。添加溶液S3引起基因組DNA、RNA、蛋白質和KDS的沉淀。
接下來進行溶胞產物過濾。中和的溶胞產物然后在不攪動的條件下、在5±3℃保溫2到24h，通過3.5mm篩網(grid)過濾器過濾除去大部分沉淀的物質(絮狀物階段)，之后是深度過濾(depth filtration)作為拋光(polishing)過濾步驟。這產生澄清的溶胞產物，超螺旋質粒的濃度超過90％。
然后進行陰離子交換層析。澄清溶胞產物溶液用凈化水稀釋到目標傳導率值50mS/cm，通過雙層過濾器(3μm-0.8μm)過濾，加載到陰離子交換層析柱上。使用充滿了11.0L FractogelTMAE HiCap(M)樹脂(Merck；#1.10316.5000)的300-mm柱。將澄清溶胞產物加載到柱上，使用NaCl的分步梯度進行洗脫。結合到柱上的大部分污染物用NaCl溶液以約61mS/cm洗脫，DNA質粒用NaCl溶液以約72mS/cm洗脫。這產生具有高濃度質粒DNA的離子交換層析洗出物。
在這之后是三聯體親和層析。來自陰離子交換層析柱的洗出物用約0.5倍體積的含有4.8M NaCl的500mM醋酸鈉溶液(pH 4.2)稀釋，泵過用含有2M NaCl的50mM醋酸鈉(pH 4.5)平衡的三聯體親和層析柱。柱的直徑300mm，含有10.0L THAC SephacrylTMS-1000凝膠(Amersham Biosciences；Piscataway，NJ)。柱用含有1M NaCl的50mM醋酸鈉溶液(pH 4.5)洗滌，NV1FGF用含有0.5mM EDTA的100mM Tris(pH 9.0)洗脫。這產生具有高濃度質粒DNA的三聯體親和層析洗出物。
之后進行疏水性相互作用層析步驟。親和層析柱的洗出物用3.6倍體積的Tris中的3.8M硫酸銨溶液(pH 8.0)稀釋。通過0.45μm過濾器過濾之后，濾出物以60cm/h加載到填滿9.0L ToyopearlButyl-650S樹脂(TosoH corp.，Grove City，OH)的疏水性相互作用柱(直徑300mm)。柱用硫酸銨溶液以約240mS/cm洗滌，NV1FGF用硫酸銨以220mS/cm洗脫。這產生無松弛形式的HIC洗出物。
根據優選的實施方式，進行進一步的滲濾步驟。根據本領域已知的標準技術，在這個過程中適合使用標準的、商業上可獲得的滲濾材料。優選的滲濾方法是根據質粒的大小使用具有30,000到500,000范圍內的分子量截留值的超濾膜。這個滲濾步驟容許進行緩沖液交換和濃縮。步驟12的洗出物通過切向流動過濾(膜截留值，30kDa)濃縮3到4倍達到約2.5到3.0mg/mL的目標濃度，濃縮物通過以恒定體積利用10倍體積的鹽水進行滲濾來進行緩沖液交換，用鹽水調節到目標質粒濃度。根據濃縮物樣品在260nm的吸光率計算NV1FGF濃度。通過0.2μm capsule過濾器過濾NV1FGF溶液，保存在2-8℃的冷藏室中的容器中直到進一步的處理。這產生了純化的濃縮物，其中超螺旋質粒的質粒DNA濃度約70％、75％、80％、85％、90％、95％，優選99％。使用這個過程總的質粒回收為至少35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％和80％，平均回收率為60％。
實施例15包括離子交換層析步驟、三螺旋親和層析步驟和疏水層析步驟的以上實施例的方法，產生比早先已知的方法更為純的質粒DNA制備物。已經將這種新方法與早先已知的方法比較，這種新方法產生的pDNA制備物具有數量低得多的基因組DNA、RNA、蛋白質和內毒素。這在附圖6中顯示了。這些實驗顯示了與一些有效去除所有污染物的2步組合相比，AEC、THAC和HIC提供了令人驚訝的更高純度的產量。就從其他生物材料和污染物，例如蛋白質和內毒素、RNA和基因組DNA，以及開放環形質粒中分離質粒DNA的效力而言，這些步驟的組合提供了明顯的協同作用。此外，根據本發明的協同的步驟組合即AEC/THAC/HIC使得不僅獲得了高度純化的藥學級別的質粒DNA，而且獲得了高度純化和完全超螺旋的，超過80％、85％、90％、95％和超過99％質粒DNA的組合物。
實施例16用于高度純化的質粒DNA制備物的制備的上述實施例的方法包括離子交換層析步驟、三螺旋親和層析步驟和疏水層析步驟，其與早先已知的方法進行比較。如附圖4所示，根據本發明的方法令人驚訝地產生這樣的pDNA制備物，其中有亞-ppm范圍內的數量少得多的基因組DNA、RNA、蛋白質和內毒素。并且，如附圖4所示，本發明的方法顯示了獲得的產品量(product quality)達到10g。
實施例17根據以下條件如實施例14描述的進行滲濾步驟使用用于步驟a和步驟b的緩沖液來確定最好的條件iii)第一次滲濾(步驟a)，相對于12.5到13.0倍體積的50mM Tris/HCl、150mM NaCl，pH 7.4(稱為緩沖液I)，和iv)對以上步驟a)的滯留物進行第二次滲濾(步驟b)，相對于3.0到3.5倍體積的鹽水賦形劑(150mM NaCl)。
根據本發明的這個選擇性滲濾步驟有效地和廣泛地除去硫酸銨和EDTA。并且，在這個滲濾步驟之后，獲得了約150mM的適宜目標NaCl濃度和400μM和1mM之間的最終Tris濃度。在以下的表6中提供了質粒DNA制劑組合物的實例表6
實施例18根據實施例13，用實施例17中描述的滲濾處理步驟制備了質粒DNANV1FGF API(活性藥物成分)的技術批次，稱為LS06。首先在約2mgAPI/mL利用13倍體積的緩沖液I對洗出物進行滲濾，產生的滯留物用約3倍體積鹽水賦形劑進行滲濾。然后用0.2μm過濾器對最終的滯留物進行過濾，調節到1mg/mL。最終的API(pH 7.24)保存在5℃、Duran玻璃瓶中直到生產DP時。
對保存在Duran玻璃瓶(API)以及8-mL小瓶中用于藥物產品生產的樣品進行穩定性研究。在+5℃90天后，所有樣品的脫嘌呤作用和開-環化作用是幾乎不可檢測的(≤0.3％)。在+25℃、90天后，LS06樣品的脫嘌呤作用和開-環化作用速率也是相當低的。從這項研究計算的脫嘌呤作用和開-環化作用速率是≤1％每月(附圖8)。
這項研究表明，在本發明的制劑中質粒DNANV1FGF的穩定性分布型是非常穩定的，其中pH值維持在約7到7.5。雖然脫嘌呤作用速率和質粒斷口速率通常在+25℃強烈加速，本申請人已經證明質粒DNA甚至在RT也長時間以非降解形式保持穩定。
本說明書應當被理解為考慮了說明書內引用的參考文獻的教導。說明書中的實施方式提供了本發明實施方式的舉例，而不應視為限制本發明的范圍。技術人員可以容易地認識到，本發明包括許多其他的實施方式。在本文中引述的全部出版物和專利通過引用將它們完全地合并。如果通過引用合并的材料抵觸本說明書或與本說明書不一致，本說明書將優先于任何這樣的材料。在此對任何參考文獻的引述不是認為這樣的參考文獻是相對于本發明的現有技術。
除非另有陳述，在說明書、包括權利要求書中使用的所有表示成分數量、反應條件等的數字，都被認為是在所有情況下用用語“約”所修飾的。因此，除非另有相反的陳述，數字參數是近似值，可以依據試圖通過本發明獲得的期望的性質而改變。不限制將等效物的原則應用到權利要求的范圍，每個數字參數應被認為考慮了有義數字的數目和常見其它方法。
除非另有陳述，在一系列元素之前的用語“至少”被理解為涉及系列中的每個元素。本領域是技術人員將使用不超過常規實驗而認識到、或能夠確定對在此描述的本發明的具體實施方式
的許多同等物。這種同等物意圖被以下的權利要求包括。
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<223>合成的寡核苷酸<400>34agaaaaaaaa ga1權利要求
1.一種用于裂解細胞的裝置(mechanism)，包括a)湍流設備，用以快速地混合細胞懸液與可裂解細胞的溶液；和b)層流設備，用以允許在基本上沒有攪動的情況下保溫(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物從湍流設備流動到層流設備中。
2.權利要求1的裝置，另外包括用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的設備，其中在(b)中保溫的混合物從所述層流設備流動到所述用于添加第二溶液的設備中。
3.利用根據權利要求2的裝置從細胞分離質粒DNA的方法，包括a)在所述湍流設備中混合細胞與堿性裂解性溶液；和b)通過添加酸性溶液中和所述堿性裂解性溶液。3.連續堿性細胞裂解裝置(device)，包括-第一混合器或注射器，能夠按與所述細胞懸液相反的方向注射堿性流體；-小直徑的第一管道，用以在混合物內產生湍流；-大直徑的第二管道，用以在混合物內產生層流；-第二混合器或注射器，用于在一端注射中和溶液并在另一端收獲混合物。
4.權利要求3的裝置，其中選擇所述管道和注射器的直徑以控制湍流和層流中的所述混合物的流速。
5.權利要求3或4的連續堿性細胞裂解裝置，進一步包括泵，用于注射或泵送所述細胞懸液從而以相反方向接觸所述第一混合器。
6.權利要求3到5的任何一項的裝置，其中所述第一混合器或注射器是管路(in-line)混合器或注射器。
7.權利要求3到6的任何一項的裝置，其中所述第一混合器是T形管。
8.權利要求3到7的任何一項的裝置，其中所述細胞懸液和堿性溶液的混合物以湍流的形式短時間流過所述第一管道。
9.權利要求3到8的任何一項的裝置，其中所述第一管道具有低于1cm、優選在2和8mm之間、更優選約6mm的直徑，以及1到10m、優選2到6m的長度。
10.權利要求3到9的任何一項的裝置，其中所述混合物在1到10秒、優選2到5秒、更優選2.5秒的期間經歷湍流。
11.權利要求3到10的任何一項的裝置，其中所述第二管道是螺管(coiled tubing)，能夠產生層流以容許所述堿性溶液和細胞懸液的連續接觸，并確保完全的細胞裂解。
12.權利要求3到11的任何一項的裝置，其中連續接觸的持續時間為30秒到2分鐘，優選1分鐘到1分30秒，優選1分20秒。
13.權利要求3到12的任何一項的裝置，其中所述第二管道具有低于1cm、優選為10到20mm、或12.5到19mm、更優選等于16mm的直徑，以及5到30m、優選13到23m的長度。
14.權利要求3到13的任何一項的裝置，其中所述第三管道具有低于1cm、優選2到10mm、更優選5到8mm的直徑，以及1到10m且更優選2到4m的長度。
15.權利要求3到14的任何一項的裝置，其中所述第二混合器或注射器是Y形的，并與所述裂解的細胞成直線以注射溶液，從而導致基因組DNA、RNA和蛋白質的沉淀。
16.權利要求3到15的任何一項的裝置，其可操作地連接到用于發酵的槽。
17.裂解細胞的方法，包括使所述細胞流經(a)湍流設備，以快速地混合細胞懸液與可裂解細胞的溶液；和(b)層流設備，以允許在基本上沒有攪動的條件下保溫(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的混合物從湍流設備流動到層流設備中。
18.權利要求17的方法，進一步包括(c)添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的設備，其中在(b)中保溫的混合物從所述層流設備流動到所述用于添加第二溶液的設備中。
19.從含有質粒的細胞釋放質粒的方法，包括a)使細胞流經湍流設備以快速地混合細胞懸液與可裂解細胞的溶液；(b)然后使所述細胞流經層流設備以允許在基本上沒有攪動的條件下保溫(a)中形成的混合物，其中在(a)中形成的細胞混合物從所述湍流設備流動到所述層流設備中，和(c)經由用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的設備接觸細胞，其中在(b)中保溫的細胞混合物從所述層流設備流動到所述用于添加第二溶液的設備中，質粒從細胞中釋放。
20.權利要求17到19的任何一項的方法，其中所述裂解溶液是含有裂解試劑的溶液，所述裂解試劑選自堿、洗滌劑、有機溶劑、和酶或它們的混合物構成的組。
21.權利要求17到20的任何一項的方法，進一步包括a)陰離子交換層析，b)三聯體親和層析，和c)疏水性相互作用層析。
22.權利要求21的方法，其中所述陰離子交換層析、三聯體親和層析和疏水性相互作用層析按所述順序進行。
23.權利要求21的方法，其中在溶胞產物過濾之前進行第一次層析。
24.權利要求21的方法，其中在絮凝物去除之前進行第一次層析。
25.制備高純的質粒DNA的方法，包括組合的陰離子交換層析和三螺旋層析的步驟。
26.權利要求25的分離方法，其進一步包括組合的疏水性相互作用層析步驟。
27.權利要求17到26的任何一項的分離方法，其能夠擴大到大規模生產。
28.制備高純的質粒DNA的大規模方法，其中使含有質粒的宿主細胞流經湍流設備以快速地混合細胞懸液與可裂解細胞的溶液；(b)然后所述細胞流經層流設備以允許在基本上沒有攪動的條件下保溫在(a)中形成的混合物，其中所述在(a)中形成的細胞混合物隨后從所述湍流設備流動到所述層流設備中，和(c)經由用于添加中和所述裂解性溶液的第二溶液的設備進行接觸，其中在(b)中保溫的所述細胞混合物從所述層流設備流動到所述用于添加第二溶液的設備中，從所述細胞釋放的質粒通過依次進行的陰離子交換層析、三聯體親和層析和疏水性相互作用層析而得以分離。
29.制備和純化藥學級別質粒DNA的方法，包括步驟a)制備含有質粒DNA的細胞，b)通過用連續堿性裂解的方法破壞細胞來制備含有質粒DNA的溶胞產物，c)通過用合適的試劑進行沉淀的濃縮步驟，d)陰離子交換層析步驟，e)三螺旋層析步驟，f)疏水性相互作用層析，和g)最終的滲濾和/或緩沖液交換步驟。
30.權利要求17到29的任何一項的方法，進一步包括在先的通過使所述溶液通過篩網過濾器以及通過深度過濾的絮凝物去除步驟。
31.權利要求17到30的任何一項的方法，進一步包括在最后的層析步驟之后的滲濾步驟。
32.權利要求31的分離方法，其中所述滲濾步驟用于達到合適的鹽、緩沖液和目標pH值。
33.權利要求31或32的分離方法，其中所述滲濾步驟包括以下步驟從最后的層析步驟收獲溶液；相對于Tris/NaCl緩沖液進行第一滲濾步驟；在適合于控制最終緩沖液濃度和適合于穩定最終質粒DNA制劑的pH值的條件下進行相對于鹽水的第二滲濾步驟。
34.通過如權利要求17到33的任何一項所定義的方法獲得的藥物級別質粒DNA。
35.藥物級別質粒DNA組合物，其包括亞-ppm(＜0.00001％)的gDNA、RNA和蛋白質污染物。
36.藥物級別質粒DNA組合物，其基本上沒有gDNA、RNA和蛋白質污染物。
37.藥物級別質粒DNA組合物，其基本上沒有細菌宿主染色體DNA。
38.藥物級別質粒DNA組合物，其包含低于約0.01％、或低于約0.001％、低于約0.0001％、或優選的低于0.00008％的染色體DNA或基因組DNA。
39.藥物級別質粒DNA組合物，其基本上沒有RNA。
40.藥物級別質粒DNA組合物，其包含低于約0.01％、或低于0.001％、優選低于0.0001％、或優選低于0.00002％的RNA污染物。
41.藥物級別質粒DNA組合物，其基本上沒有蛋白質污染物。
42.藥物級別質粒DNA組合物，其含有低于約0.0001％，最優選低于0.00005％的蛋白質污染物。
43.基本上沒有內毒素污染物的藥物級別質粒DNA組合物。
44.包含低于0.1EU/mg內毒素的藥物級別質粒DNA組合物。
45.包含優勢型(predominant)超螺旋形式的藥物級別質粒DNA組合物。
46.包含大約或超過99％的封閉環形質粒DNA的藥物級別質粒DNA組合物。
47.穩定的質粒DNA制劑，包括質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑，其中所述緩沖溶液以一定濃度存在以維持所述制劑或組合物的pH值在7和7.5之間。
48.根據權利要求47的穩定的質粒DNA制劑，其中所述緩沖溶液包含(a)Tris或賴氨酸和選自強酸或弱酸的酸；(b)Hepes和強堿；或(c)磷酸鹽緩沖液。
49.根據權利要求48的穩定的質粒DNA制劑，其中所述緩沖溶液包含Tris/HCl、賴氨酸/HCl、Tris/)順丁烯二酸、Tris/蘋果酸、Tris/乙酸、或Hepes/氫氧化鈉。
50.穩定的質粒DNA制劑，其中所述緩沖液是Tris。
51.權利要求50的穩定的質粒DNA制劑，其中所述Tris緩沖液以低于1mM的濃度、優選250μM和1mM的濃度存在。
52.權利要求51的穩定的質粒DNA制劑，包含400μM Tris緩沖液。
53.穩定的質粒DNA制劑，包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑，其中所述緩沖溶液以低于1mM的濃度、優選250μM和1μM的濃度存在。
54.穩定的質粒DNA制劑，包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑，其中所述緩沖溶液以400μM的濃度存在。
55.包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑的組合物，其中所述緩沖溶液以足以在4℃到25℃使質粒DNA以穩定形式保存的濃度存在。
56.包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑的組合物，其中所述緩沖溶液以足以在4℃到25℃使質粒DNA以穩定形式保存延長的時期的濃度存在。
57.包含質粒DNA、緩沖溶液和鹽水賦形劑的組合物，其中所述緩沖溶液以一定濃度存在，所述濃度足以在4℃到25℃使質粒DNA以穩定形式保存1個月、2個月、3個月、到6個月和達12月的期間。
58.根據權利要求57的質粒DNA組合物，其中所述鹽水賦形劑是NaCl。
59.根據權利要求58的質粒DNA組合物，其中NaCl以100到200mM、優選約150mM的濃度存在。
60.根據權利要求59的質粒DNA組合物，其中保存在5℃或保存在室溫的質粒DNA的脫嘌呤作用和開環作用的速率低于20％、15％、10％、5％或≤1％每月。
61.在組合物中保存質粒DNA的方法，包括制備純化的質粒DNA的樣品；和使所述純化的質粒DNA的樣品與鹽水賦形劑和緩沖溶液組合，所述緩沖溶液維持產生的組合物的pH在7到7.5。
62.在達約20℃的溫度在組合物中保存質粒DNA的方法，包括制備純化的質粒DNA的樣品；使所述純化的質粒DNA的樣品與鹽水賦形劑和緩沖溶液組合，其中所述緩沖溶液以低于1mM的濃度、或250μM到1mM、優選400μM的濃度存在；和將所述質粒DNA組合物保存在達約20℃的溫度。
63.根據權利要求62的方法，其中所述質粒DNA組合物保存在約4℃的溫度。
64.根據權利要求62的方法，其中所述鹽水賦形劑是NaCl。
65.根據權利要求64的方法，其中NaCl以100到200mM、和優選約150mM的濃度存在。
66.穩定的質粒DNA保存制劑，其通過在權利要求62到66的任何一項中定義的方法獲得。
67.權利要求17到32的任何一項的方法，進一步包括無菌過濾除菌、配制和用純化的質粒DNA填充小瓶的步驟。
68.含有純化的質粒DNA的小瓶，其通過權利要求67的方法獲得。
69.權利要求68的小瓶，其中所述純化的質粒DNA是稱為NV1FGF的質粒，其是攜帶編碼FGFa基因的表達盒的pCOR質粒。
70.權利要求17到32的任何一項的方法，其中所述方法允許除去混雜物，例如蛋白質、變性的基因組DNA、RNA、蛋白質、寡核糖核苷酸、寡-脫氧核糖核苷酸、變性的質粒DNA和脂多糖。
71.根據權利要求17到32的任何一項的方法，其中層析步驟在固相支持物上進行，所述固相支持物是任何有機的、無機的或復合材料，其為多孔的、超多孔的或無孔的，適合于層析分離，所述材料是由聚(亞烷基二醇)(poly(alkene glycol)、烷烴(alkane)、烯烴(alkene)、炔烴(alkyne)、芳烴(arene)或賦予所述支持物疏水特性的其他分子衍生的。
72.根據權利要求17到32的任何一項的方法，其中所述疏水性相互作用層析在固定床中或在膨脹床中進行。
全文摘要
本發明提供了對細菌懸浮液的連續堿性裂解以收獲pDNA的方法。進一步提供了可選擇的額外的純化步驟，包括溶胞產物過濾、陰離子交換層析、三聯體親和層析和疏水性相互作用層析。這些可選擇的純化步驟可以與連續裂解組合，以生產基本上沒有gDNA、RNA、蛋白質、內毒素和其他污染物的高度純化的pDNA產品。
文檔編號A61K48/00GK1882682SQ200480033865
公開日2006年12月20日 申請日期2004年9月17日 優先權日2003年9月17日
發明者弗朗西斯·布蘭奇, 米歇爾·庫德, 尼古拉斯·梅斯特拉利, 戴維·蓋拉克, 蒂里·吉爾明 申請人:森特利昂公司