高純度質粒dna制備物及其制備方法

專利名稱：高純度質粒dna制備物及其制備方法
技術領域：
本發明通常涉及高純度質粒組合物及其制備方法，所述組合物具有低的，或者不可檢測的莢膜異多糖酸及其他污染物的水平。也描述了在該方法中的有用的多肽。在此描述的方法及組合物具有一系列的用途，包括在生物恐怖主義、環境科學、食品科學、法醫學、 分子生物學以及健康和醫學領域內的各種應用。在將核酸引入生物體的任何應用中，關鍵的步驟是制造高度純化的，通常是藥物級別的核酸。該純化的核酸必須滿足安全性、能力及效力的藥物質量標準。此外，期待有可放大的方法，其能夠用于產生多克的量的DNA。因此，期待有生產高純度核酸的方法，其不需要有毒的化學品、誘變劑、有機溶劑或其他危害所得的核酸的安全性或效力的試劑，或者使得擴大規模困難或者不可行。也期待制備不含有污染性內毒素的核酸，所述內毒素若給予患者會引起毒性反應。污染性內毒素的去除是尤其地重要的，例如，自革蘭氏陰性(_)細菌來源中純化的質粒DNA具有高水平的內毒素及莢膜異多糖酸，后者為細胞外膜的必須組分。質粒是自我復制的遺傳性元素，其在宿主細菌中存在及復制。從本質上，涉及特定 DNA片段操作的所有分子遺傳學方法都使用質粒DNA制造大量的特定的DNA片段(或者得自所述片段的蛋白質/RNA)。細菌宿主的選擇，或質粒的來源通常反應了歷史上的觀點。Stanley Cohen及Herb Bayer選擇了大腸桿菌(E. Coli)的K-12株用于其1970年代初期的開創性的分子遺傳學實驗，由于其容易培養并對于代謝研究而言容易控制。這些相同的性質也使得大腸桿菌Κ-12 成為用于細菌遺傳學研究的首選的微生物。分子生物學家現在使用相同株的大腸桿菌用于成熟的步驟，這是由于其對于多種分子遺傳學應用而言證明是尤其好的宿主。此外，在過去的25年中，大腸桿菌Κ-12已經證明是對于重組DNA分子增長反應的無害的生物宿主。毒性減弱的大腸桿菌Κ-12株在實驗室環境外不能繁盛生長，其也不能與通常在人類腸中發現的遺傳學上更加強壯的大腸桿菌血清型競爭。在其他技術中，當前可得的用于分離及純化質粒DNA的方法應用離子交換層析(Duarte 等人，Journal of Chromatography A，606 (1998)，31-45)以及尺寸排阻層析 (Prazeres, D. Μ. , Biotechnology Techniques Vol. 1, No. 6, June 1997, ρ 417—420)，胃結合添加劑的使用，所述添加劑如聚乙二醇(PEG)、去污劑及其他組分如六氨合鈷、亞精胺及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。將DNA從污染物中分離的其他方法依靠尺寸排阻層析，其涉及基于尺寸上的小差別，將核酸從內毒素及其他污染物分離。這些方法通常是可以接受的，然而可能無法以期待的純度水平提供有效力的，及成本上合算的核酸(如DNA，包括超螺旋的和/ 或帶切口的(或者松弛的))分離。同時，質粒DNA制備物，其通過細菌制備物制備，并通常含有松弛的及超螺旋的質粒DNA的混合物，經常要求內毒素的去除，如FDA所要求的，由于多種細菌宿主產生的內毒素已知在接受所述質粒DNA的宿主中導致炎癥反應，例如發燒或者敗血病，或者在一些案例中死亡。這些內毒素通常為脂多糖，或者其片段，其為革蘭氏(_)陰性細菌的外膜的組分，并存在于宿主細胞及宿主細胞膜或者大分子的DNA制備物中。因此，內毒素的去除可能是質粒DNA的純化的關鍵步驟，所述質粒DNA用作治療或者預防上的用途。從質粒DNA溶液的內毒素去除主要地利用內毒素的負電性結構。然而，質粒DNA，也是負電性的，并因此分離通常使用陰離子交換樹脂達到，所述樹脂結合這兩種分子，并在一定的情況下，優先地洗脫質粒DNA而結合內毒素。該分離僅僅導致部分去除，這是由于顯著量的內毒素與質粒 DNA 一起洗脫和/或達到非常少的質粒DNA回收。因此，質粒DNA從小體積或大體積的微生物發酵物中的小規模及大規模的分離和純化需要開發改進的質粒制備方法。對于基于質粒的研究和治療而言這也是期待的，即核酸能以可再現的方式分離純化并保持相同的結構，以及為了避免雜質對于哺乳動物體的不良效果，要求所述核酸被分離及純化到高純度。用于基因療法的質粒DNA典型地分離自E. coli K_12。內毒素，也已知為脂多糖(LPS)，已知為革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌的細胞膜的主要組分。實際上，一些報導表示E. coli外膜的脂質部分完全由內毒素分子組成。(Qiagen Plasmid Purification Handbook, July 1999)。LPS含有疏水的脂類A部分，這是一系列復雜的糖殘基及負電性的磷酸酯基團。 LPS的脂類A部分證明內毒素活性并在哺乳動物中引發強烈的、潛在地危及生命的炎癥反應。該炎癥反應的特征在于發燒，降低的血壓，局部的炎癥以及感染性休克。脂類A通過結合于血清脂多糖結合蛋白(LBP)并通過在單核細胞、內皮細胞以及多形核白細胞上表達的 CD14 受體引發信號轉導(Ingalls, R. R.等人 1998. J. Immunol. 161 54135420)。內毒素當注射到小鼠中時是極為致命的，其在注射的1小時內導致死亡。內毒素也已知劇烈地減少細胞中的轉染效率(Weber,M.，等人1995. Biotechniques 19 930 940)。因此，使用不含內毒素的質粒DNA用于基因療法的應用的重要性長期以來被強調。多個科學家為了減少用于基因治療的DNA樣品的毒性，努力從DNA樣品中除去LPS 及其他的內毒素。然而，近期的證據指出具有可忽略不計的量的LPS的DNA樣品當以顯著量給予的話，仍然是有毒的。因此，必須鑒定DNA樣品中額外的有毒組分并去除，以確保臨床上使用的DNA制備物的安全性。內毒素分子的化學結構及性質，及其形成膠團結構的傾向在 一開始導致LPS及質粒DNA的共純化。例如，DNA經常與LPS在CsCl超離心步驟中共純化，這是由于LPS及質粒 DNA在CsCl中具有類似的密度。此外，膠團LPS在尺寸排阻樹脂上與大的DNA分子一起分離。類似地，存在于LPS分子上的負電荷與陰離子交換樹脂相互作用，以至于導致其與DNA 在陰離子交換樹脂上共純化。已經報道細胞壁多糖污染分離自多種來源的DNA，所述來源包括細菌、酵母、植物、 藍綠藻、原生動物、真菌、昆蟲及哺乳動物(Edelman, M. · 1975. Anal. Biochem. 65 :293_297 ；Do, N.和 Adams，R. P. 1991. BiotechniqueslO 162-166 ；Chan, J. W.和 Goodwin，P. H. 1995. Biotechniques 18 :419_422)。污染植物基因組DNA的植物多糖據報道抑制限制性內切酶處理及聚合酶鏈式反應(Robbins，M.等人1995. Benchmarks 18:419-422)。進一步地，由多頭絨泡菌黏質物純化的多糖據報道抑制DNA聚合酶的活性(Shioda，Μ.和K. Murakami-Murofushi. 1987. Biochem. Biophys. Res. Commun. 146 :61_66)以及已知來自海膽胚胎的酸性多糖抑制RNA聚合酶的活性(Aoki，Y.和 H. Koshihara. 1972. Biochim. Biophys. Acta 272 :33_43)。
文獻中描述了幾種方法純化質粒DNA，然而這些方法通常僅去除一部分多糖，如果去除的話。例如，脂類A純化方法基于脂類A的疏水性質。因此，這些方法將脂類A及與脂類A共價連接的多糖去除。然而，由于僅有小部分的E. coli莢膜多糖共價地連接于脂類A，僅有其少數在質粒DNA的標準制備及純化步驟中被去除(Jarm，B.和K. Jarm. 1990. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 150 19-42 ；fficken, A. J. 1985. In Bacterial Adhesion, D. M. Pletcher (ed.) ,Plenum Press :New York，pp. 45-70)。一些E. coli 莢膜多糖具有磷月旨酸作為脂類部分；然而，所述磷脂酸典型地在標準的質粒分離步驟中水解。因此，這些多糖在當前使用的基于疏水性(例如，脂類A結合的存在)減少內毒素的方法下不能從DNA中去除。已經開發了幾種方法從分離自E. coli的DNA中減少內毒素-陽性LPS的水平 (Neudecker, F.和 S. Grimm. 2000. Biotechniques 28 107-110)，其包括幾種商業上可得的試劑盒(Qiagen, Inc. , Valencia, CA ；Sigma Chemical Co. , Inc. , St. Louis, M0)。使用 Qiagen試劑盒純化的DNA通常認為是潔凈的質粒DNA的“黃金標準”。Qiagen試劑盒不僅設計用于去除LPS，其還包括RNA酶以消化質粒DNA制備物中的RNA。實際上，多數的DNA 制備方法包括RNA酶消化步驟。然而，能夠加入質粒DNA的RNA酶是受限的，這是由于高數量的RNA酶會開始消化DNA。難以使用當前的標準純化步驟將多糖從DNA中分離。DNA及多糖均由有機溶劑沉淀，所述有機溶劑如乙醇和聚乙二醇(PEG)。由于多糖是陰離子性的，采用陰離子交換樹脂會與DNA共純化多糖。進一步，高分子量多糖和質粒DNA在CsCl中具有類似的密度。已經提出了親和層析從DNA中去除多糖污染物。例如，早期的論文報道了從多種來源的DNA的純化，所述來源包括植物、昆蟲、真菌以及藻類，其使用親和層析，其中脫蛋白的DNA組分通過連接于瓊脂糖的伴刀豆球蛋白A的柱(Edelman，M. 1975. Anal. Biochem. 65 293-29)。不幸的是，Ε. Coli多糖通常不含有與伴刀豆球蛋白A結合的糖。類似地，據報道凝集素親和層析在從分離自真菌及植物的DNA中去除多糖污染物中是有用的(Do，N.和 R. P.Adams. 1991. Biotechniques 10 162-166)；然而由凝集素識別的糖不存在于來自有機體的大多數多糖中，所述有機體如E. coli。革蘭氏陰性細菌沉淀物的鹽洗也被提出作為純化細菌基因組DNA的方法(Cahn， J. W.和 P. H. Goodwin. 1995. Biotechniques 18:519-422)。由于存在于 DNA 中的多糖引起的限制性酶切的干擾，提出了鹽洗作為改進DNA的純化的方式。然而上述方法無一成功地去除在見于質粒DNA中的全部多糖。WO 95/20594及美國專利5，969，129描述了用于成批純化來自玉米及其他植物的
基因組DNA的方法。該純化方法使用含有硼酸鹽基團的聚合物凝膠，以從DNA/多糖混合物中分離DNA。盡管在制備用于臨床應用的“干凈的”DNA中，臨床醫生的整個重心在于LPS的去除，近期的研究指出“無LPS”的DNA在高劑量下仍然顯示毒性。例如，在DNA-脂質體復合物的靜脈注射后，科學家觀察到導致小鼠死亡的毒性，所述DNA-脂質體復合物含有50-300mg 的DNA及量減少的LPS，然而等濃度的脂質體的注射沒有毒性的效果。也觀察到在使用具有量減少的LPS的DNA轉染之后，基因表達減少了。近期的報告還提出，在肌肉注射據認為純的DNA后，產生了炎癥和顯著的免疫響應(Fields, P. Α.等人2000. Molec. Therap. 1 225-235)。因此，甚至據認為是純的，臨床級別以及具有低水平的LPS的DNA在動物中也產生毒性的響應。發明簡述 在本發明的不同方面中，提供了高純質粒DNA組合物。也描述了用于制備該質粒組合物的方法，以及具有莢膜異多糖酸降解活性的多肽。這些多肽在制備高純質粒DNA制備物中是有用的，并在用于降解莢膜異多糖酸的方法中也是有用的。簡單來說，因此，本發明涉及革蘭氏陰性細菌質粒組合物。該組合物包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA以及少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。在一個實施方案中，例如，所述組合物包含少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。在另一個實施方案中，所述組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸。在這些及其他實施方案中，所述組合物可能還含有少于0. Img每毫克革蘭氏陰性質粒DNA的糖醛酸， 和/或少于0. Img每毫克革蘭氏陰性質粒DNA的巖藻糖。在一個實施方案中，例如，所述組合物進一步包含少于0.05mg每毫克革蘭氏陰性質粒DNA的糖醛酸。在另一個實施方案中， 所述組合物包含每毫克革蘭氏陰性質粒DNA的少于0.05mg巖藻糖。在另一個實施方案中， 所述組合物不包含可檢測的糖醛酸和/或巖藻糖。本發明的另一個方面涉及革蘭氏陰性細菌質粒組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA，少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于約0. Img 每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。本發明的另一個方面涉及革蘭氏陰性細菌質粒組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA，少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于約 0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖酸。在一個實施方案中，所述組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸、巖藻糖、糖醛酸、染色體DNA或基因組DNA、RNA、蛋白質和/或內毒素污染物。本發明的另一個方面涉及用于純化質粒DNA的方法。在一個實施方案中，所述方法包括用多肽處理含有質粒DNA的含水組合物以消化莢膜異多糖酸，以及將質粒DNA從處理的含水組合物中分離。本發明的另一個方面涉及用于純化質粒DNA的方法，所述方法包括(a)通過使含水組合物與陰離子交換樹脂組合來預處理含有質粒DNA的含水組合物；(b)用多肽處理經預處理的含水組合物以分解莢膜異多糖酸；(c)將質粒DNA從經處理的含水組合物中分離， 該分離包括將經處理的含水組合物與親和層析樹脂組合，隨后將經處理的含水組合物與疏水相互作用層析樹脂組合；以及(d)過濾質粒DNA。本發明的另一個方面涉及多肽，所述多肽與SEQ ID NO 1及其保守的氨基酸替換具有至少90%的同源性。在一個實施方案中，所述多肽與SEQ ID NO :1及其保守的氨基酸替換具有至少95%的同源性。在另一個實施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。本發明的另一個方面涉及多肽，所述多肽與SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸替換具有至少90%的同源性。在一個實施方案中，所述多肽與SEQ ID NO :2及其保守的氨基酸替換具有至少95%的同源性。在另一個實施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。本發明的另一個方面涉及分離的多核苷酸，其包含核酸序列，該序列與SEQ ID NO 7或其互補序列具有至少90%的序列同一性。在一個實施方案中，所述核酸序列與SEQ ID NO :7或其互補序列具有至少95%的序列同一性。在另一個實施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO 7的核酸序列。本發明的另一個方面涉及分離的多核苷酸，其包括核酸序列，該序列與SEQ ID NO 8或其互補序列具有至少90%的序列同一性。在一個實施方案中，所述核酸序列與SEQ ID NO :8或其互補序列具有至少95%的序列同一性。在另一個實施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID NO 8的核酸序列。本發明的其他方面涉及包含多核苷酸的載體，其中，該載體選自質粒、病毒及噬菌體。在一個方面，其多核苷酸與SEQ ID NO :7或其互補序列具有至少90%的序列同一性。 在另一個方面，其多核苷酸與SEQ ID NO :8或其互補序列具有至少90%的序列同一性。在任一方面的一個實施方案中，所述載體為質粒或者噬菌體。在任一方面的優選的實施方案中，所述載體為噬菌體。本發明的另一個方面涉及在生物材料中消化莢膜異多糖酸的方法，該方法包括使生物材料與多肽接觸，所述多肽能夠消化莢膜異多糖酸。在一個實施方案中，所述生物材料選自粗細菌裂解液，部分純化的細菌裂解液以及含有提取的細菌核酸的含水溶液。在另一個實施方案中，所述生物材料為細菌粘液。在另一個實施方案中，所述生物材料為生物膜。本發明的另一個方面涉及從含水組合物中去除內毒素的方法，所述組合物含有細菌大分子，該方法包括消化該含水組合物中的莢膜異多糖酸，以及隨后將該含水組合物與層析材料組合，以從細菌大分子中分離內毒素。在特定的實施方案中，所述含水組合物得自細菌裂解液。其他的方面及特征或者為顯而易見的，或者在此后指出。前述內容指出了本發明相當廣泛的數個方面，從而可能更好地理解隨后的本發明詳述。本發明的附加特征及優點于此后描述，其形成了本發明的權利要求的主題。本領域技術人員應當意識到，所公開的觀念和特定的實施方案可能容易地作為修改或者重新設計組合物及方法的基礎，用于實現與本發明相同的目的。本領域技術人員應當了解，該修改或重新設計的組合物及方法不悖離本發明在所附的權利要求中的精神及范圍。附圖簡述

圖1A、1B、1C及ID顯示了根據一個實施方案的莢膜異多糖酸降解酶的核苷酸及氨基酸序列。圖2顯示了凝膠，其中幾種不同的DNA質粒樣品以該凝膠電泳方法檢測多糖可視
化及定量。
圖3-8顯示了 SEQ ID NOS :1_6的多肽序列。圖9-10顯示了 SEQ ID NO 7及SEQ ID NO 8的多核苷酸序列。圖11顯示了 SEQ ID NO :9_17的多肽序列。圖12-14顯示了表格，為從120只小鼠的高劑量DNA-BIV脂質體復合物靜脈注射之后的結果，所述脂質體復合物根據在此描述的方法純化。縮寫及定義除非另外地定義，所有在此使用的工藝、符號及其他科學術語或者專門用語意為具有本發明所屬領域的技術人員一般理解的意義。在一些情況下，為了清楚和/或便于引用，本文對具有廣泛理解的意義的術語進行定義，并且該定義在此包含不應該必然地解釋為描述與本領域通常理解地基本上不同。在此描述或引用的多種技術和步驟被本領域技術人員使用常規的方法學而充分理解并廣泛采用，例如廣泛地使用的分子克隆方法學，其描述于 Sambrook等人白勺Molecular Cloning :A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N. Y.中。視情況而定，涉及商業上可得的試劑盒及試劑的使用的步驟通常地根據生產商所規定的步驟和/或參數進行，除非另外指出。術語“類似物”指與另一個分子在結構上相似或者具有相似的或者對應的屬性 (如CAE相關蛋白)的分子。例如，CAE蛋白的類似物可能被特異結合CAE的抗體或者T細胞特異地結合。術語“抗體”以最廣泛的含義使用。因此“抗體”可能為天然地產生的或人造的， 如單克隆抗體，其由常規的雜交瘤技術制備。抗-CAE抗體包括單克隆及多克隆的抗體，以及含有所述抗原結合結構域和/或這些抗體的一個或者多個互補性決定區域的片段。“抗體片段”定義為免疫球蛋白分子可變區域的至少一部分，所述部分結合于其靶點，即抗原結合區域。在一個實施方案中，其特別地涵蓋單一的抗-CAE抗體及其克隆(包括激動劑，拮抗劑及中和抗體)及具有多表位特異性的抗-CAE抗體組合物。術語“同系物”指顯示與另一個分子的同源性的分子，例如，通過在對應的位置上具有相同或者類似的序列或者化學殘基。術語“雜交”、“雜交(hybridizing) ”，“雜交(hybridizes) ”等等，用于核酸的環境下，意為指常規的雜交條件，優選地如在50%甲酰胺/6xSSC/0. 1 % SDS/100 μ g/ml ssDNA 中雜交，其中用于雜交的溫度高于37°C以及用于在0. lxSSC/0. 1% SDS中洗滌的溫度高于 55 °C。短語“分離的”或者“生物純的”指這樣的物質，其基本上或本質上不含在物質見于天然狀態下與其正常地共存的組分。因此，根據本發明的分離的肽優選地不含有在肽的原位環境下通常與其結合的物質。例如，核酸或多核苷酸被稱為“分離的”是這樣一種情況 核酸或多核苷酸基本上與污染物多核苷酸分離，所述污染物多核苷酸對應于或互補于靶基因之外的基因，或者編碼靶基因產物或其片段之外的多肽。技術人員能夠容易地使用核酸分離步驟來獲得分離的多核苷酸。例如當采用物理、機械或者化學方法將目標蛋白或者多肽從正常地與所述蛋白結合的細胞組分中去除時，該蛋白被稱為是“分離的”。技術人員能夠容易地使用標準純化方法獲得純化的蛋白質。可選地，分離的蛋白質可以通過化學的方式制備。
術語“哺乳動物”指分類為哺乳類的任意生物體，其包括小鼠、大鼠、兔子、狗、貓、 牛、馬和人類。在本發明的一個實施方案中，所述哺乳動物為小鼠。在本發明的另一個實施方案中，所述哺乳動物為人類。術語“單克隆抗體”指由相同的核酸分子編碼的抗體的集合，所述核酸分子可選地由單一的雜交瘤或者其他細胞系產生，或者由轉基因哺乳動物產生，從而各個單克隆抗體典型地識別抗原上的相同表位。術語“單克隆”不限于任意特定用于產生抗體的方法，該術語也不限制于在特定的物種中所產生的抗體，所述物種如小鼠、大鼠等等。術語“多克隆抗體”指抗體的異種混合物，其識別并結合于相同抗原上的不同表位。多克隆抗體可以從例如粗血清制備物獲得，或者可以使用例如抗原親和層析或者蛋白A/蛋白G親和層析純化。本文關于多肽序列所說明的術語“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”，定義為在候選序列中氨基酸殘基與特定的多肽序列中氨基酸殘基相同的百分比，如必要，在比對序列和引入缺口之后進行以達到最大百分比的序列同一性，而并不考慮作為序列同一性的部分的任何保守替換。為了確定氨基酸序列同一性百分比的比對可以以本領域技術范圍內的多種方式實現，例如，使用公眾可用的電腦軟件如BLAST，BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2或者Megalign (DNASTAR)軟件。本領域普通人員能夠確定測量比對的合適參數，包括任何為了在所比較的序列的全長上達到最大比對所需要的算法。例如，氨基酸序列同一性百分比可以使用序列比較程序 NCBI-BLAST2 (Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25 3389 3402 (1997))確定。所述NCBI-BLAST2序列比較程序可以得自位于Bethesda，Md的National Institute of Health。NCBI-BLAST2使用幾個搜索參數，其中所有那些搜索參數設定為默認值，包括例如 unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0. 01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 以及 scoring matrix = BL0SUM62。本文關于編碼多肽的核酸序列說明的術語“核酸序列同一性百分比(％ ) ”定義為在候選序列中與目標多肽核酸序列中的核苷酸一致的核苷酸的百分比，如必要，在比對序列和引入缺口之后進行以達到最大百分比的序列同一性。為了確定核酸序列同一性百分比的比對可以以在本領域技術范圍內的多種方式實現，例如，使用公眾可用的電腦軟件如 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 或者 Megalign (DNASTAR)軟件。本領域普通人員能夠確定測量比對的合適參數，包括任何為了在所比較的序列的全長上達到最大比對所需要的算法。例如，核酸序列同一性百分比也可以使用序列對比程序NCBI-BLAST2 (Altschul等人， Nucleic Acids Res. 25 3389 3402 (1997))來確定。所述 NCBI-BLAST2 序列比較程序可能得自位于 Bethesda，Md 的 National Institute ofHealth。NCBI-BLAST2 使用幾個搜索參數，其中所有那些搜索參數設定為默認值，包括例如unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0. 01, constant formulti-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 以及 scoringmatrix = BL0SUM62。術語“多核苷酸”意為聚合物形式的核苷酸，其長度為至少10個堿基或者堿基對， 其為核糖核苷酸或者脫氧核苷酸，或者核苷酸任意一種類型的修飾形式，并意圖包含單鏈或者雙鏈形式的DNA和/或RNA。在本領域中，該術語通常與“寡核苷酸”可交換地使用。 多核苷酸可以包括本文公開的核苷酸序列，其中胸腺嘧啶(T)也可以為尿嘧啶(U)；該定義屬于DNA與RNA的化學結構之間的差別，具體地觀察到RNA中的四種主要堿基中之一為尿嘧啶(U)而非胸腺嘧啶(T)。術語“多肽”意為至少約4，5，6，7或8個氨基酸的聚合物。在本說明書中，使用標準的三字母或者單字母的氨基酸名字。在本領域中，該術語通常與“肽”或者“蛋白質”可交換地使用。“重組”的多核苷酸(如DNA或者RNA分子)或者“重組”的多肽為在體外進行分子操作的多核苷酸或者多肽。具有本領域普通技術人員能容易地確定雜交反應的“嚴格性”，該嚴格性是通常地憑經驗計算的，其取決于探針長度，洗滌溫度以及鹽濃度。通常地，為了適當的變性，較長的探針要求較高的溫度，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常地取決于當互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環境下時，變性的核酸序列再退火的能力。探針與可雜交序列的想要的同源性程度越高，則能使用越高的相對溫度。結果是，隨后更高的相對溫度將傾向于使反應條件更嚴格，而更低的溫度較不如此。雜交反應嚴格性的額外細節以及解釋參見Ausubel 等人’ Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)。以下可以確定為本文定義的“嚴格的條件”或者“高嚴格性的條件”，而其不限于此(1)洗滌采用低離子強度及高溫度，例如0.015M氯化鈉/0. 0015M檸檬酸鈉/0. 十二烷基硫酸鈉在50°C下；(2)在雜交中采用變性劑，如甲酰胺，例如具有下列成分的50% (ν/ ν)甲酰胺0. 胎牛血清白蛋白/0. 聚蔗糖/0. 聚乙烯吡咯烷酮/pH為6. 5的具有750mM的氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的42°C的50mM磷酸鈉緩沖液；或者(3)42°C采用50% 甲酰胺，5X SSC (0. 75M NaCl，0. 075M 檸檬酸鈉)，50mM 磷酸鈉(ρΗ 6·8)，0· 焦磷酸鈉，5χ Denhardt溶液，超聲的鮭魚精子DNA(50 μ g/ml)，0. 1% SDS以及10%硫酸葡聚糖，并且在 42°C的0. 2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)以及55°C的50%甲酰胺中洗滌，隨后通過含EDTA的 0. IxSSC在55°C下進行高嚴格性洗滌。““中等嚴格的條件”描述為，然而不限于Sambrook 等人 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, New York : Co Id Spring Harbor Press, 1989中的那些條件，并包括不如上述嚴格的洗滌溶液以及雜交的條件(例如溫度，離子強度以及％ SDS)的使用。中等嚴格條件的實例為在溶液中，37°C下過夜孵育，所述溶液包含 20% 甲酰胺，5X SSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(ρΗ 7. 6)，5X Denhardt 溶液，10%硫酸葡聚糖以及20mg/ml的經變性剪切的鮭魚精子DNA，隨后使用約37_50°C的 IxSSC洗滌濾器。技術人員能認識到如何在必要時調節溫度，離子強度等等，從而適應如探針長度等等因素。術語“變體”指顯示描述的類型或者標準的變化的分子，如與具體描述的蛋白質 (如示于圖1或者圖2的CAE-蛋白)在相應的位置(或者多個位置)具有一個或者多個不同的氨基酸殘基的蛋白質。類似物是變體蛋白的實例。剪接同等型及單核苷酸多態性 (SNP)是變體的其它實例。本發明的具有莢膜異多糖酸降解(CAE)活性的多肽包括在此具體指出的那些，以及等位基因的變體，保守的替換變體，類似物以及同源物，其可以在本文列出或者在本領域中容易獲得的的方法之后，在經過度實驗分離/產生及表征。也包括組合了不同CAE蛋白或其片段的部分的融合蛋白，以及CAE蛋白與異種多肽的融合蛋白。該CAE蛋白共同地指CAE相關的蛋白，本發明的蛋白或CAE。術語“CAE相關蛋白”指至少10，15，25，50，100，150， 200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700 或者多于 700 個氨基酸的多肽片段或者 CAE蛋白質序列。艦本發明總的來說涉及“超潔凈”的質粒DNA制備物，其制備方法及在這些方法中有用的酶。經報導地，發現多糖特別是莢膜異多糖酸污染“潔凈”的質粒DNA制備物，當使用時，例如用于基因治療時，其在人類和哺乳動物中誘導毒性作用。據信誘導這些毒性作用的組合物尚未在文獻中確定。可能被DNA制備物中的多糖污染的存在不利地影響的其他應用包括臨床診斷，法醫學及其他生物技術方法，如其上包括核酸的芯片及微陣列，以及在分子研究(如建立染色體，轉錄起始位點的分析，X-射線晶體學以及DNA結構研究等)中。存在從DNA制備物中去除此類污染分子的急需。除了別的之外，因此，本發明提供了分離的，純化的以及重組的多肽及涉及其應用的方法，所述多肽具有莢膜異多糖酸降解活性。本發明還提供了編碼該多肽的分離的多核苷酸。本文描述的多肽具有一系列的應用，并使得在生物材料中消化莢膜異多糖酸的方法， 以及在從包括生物大分子的組合物中去除內毒素的方法成為可能。值得注意的是，所述多肽也使得質粒DNA制備物的制備成為可能，優選地為革蘭氏陰性細菌質粒DNA，其包含少于約0. Img每毫克的質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及更優選地少于約0. 05mg每毫克的質粒 DNA的莢膜異多糖酸。在特定的優選實施方案中，在由本文描述的方法制備的質粒組合物中找不到可檢測的莢膜異多糖酸。所述質粒組合物可能還具有非常低水平的，或者不可檢測水平的其他多糖污染物，例如糖醛酸及巖藻糖。本發明部分涉及這一發現本發明的多肽化合物能夠消化莢膜異多糖酸(也稱作 M-抗原)，其為由一系列的腸細菌產生的胞外多糖，所述腸細菌包括大多數大腸桿菌株。取決于細菌，例如，莢膜異多糖酸可以包括多種比例的巖藻糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸以及乙酸鹽和丙酮酸鹽(參見例如Sutherland, Biochem. J. 115，935-945 (1969)。如前文所記錄的，發現了內毒素及多糖，特別是莢膜異多糖酸污染核酸的制備物，所述制備物例如用于治療用途，同時使用現有的標準純化步驟很難將內毒素及多糖如莢膜異多糖酸從核酸中分離出來。相應地，本文描述的多肽可以通常地用于材料中莢膜異多糖酸的消化。通常地，含有莢膜異多糖酸的任意材料可以使用本文描述的多肽處理，典型地，所述材料為生物材料。 所述生物材料可以得自微生物，人類或者動物的組織以及環境樣品的部分，所述環境祥品如考古學上的殘留物、堆肥或者其他分解物質、泥炭沼、植物物質、沉淀物、污泥、泥土以及廢水，廢水例如其從來源上為地面上或者地面下的。在特定的實施方案中，所述生物材料為生物粘液。根據這些實施方案，例如，所述莢膜異多糖酸可以存在于完整細菌的細胞膜中。 在其他的實施方案中，所述生物材料可以為粗細菌裂解液，部分地純化的細菌裂解液以及包括提取的細菌核酸的含水溶液。在另一個實施方案中，所述生物材料可以為生物膜。在另一個實施方案中，所述生物材料可以為漿粕或者漿粕衍生物(例如，如那些機械地或者化學地由木頭或者纖維來源制備的)。如前文所記載的，根據本發明的其他方面，本文描述的多肽可以用于從包含細菌大分子(例如，質粒DNA)的含水組合物中去除內毒素的方法中。 在特定的優選方面，所述多肽用于純化質粒DNA的方法中，所述質粒DNA典型地為革蘭氏陰性細菌質粒DNA。質粒DNA組合物本發明的一個關鍵的方面是高度純化的質粒組合物及藥物級別的質粒DNA組合物。這些組合物，例如，可以通常由本文描述的莢膜異多糖酸酶促消化方法制備，其可以與或者可以不與常規的純化技術組合，常規的純化技術如一種或多種層析或者過濾步驟的組合。因此，本發明包括，或者進一步地包括制備及分離高度純化的質粒組合物的方法，所述質粒組合物基本上不含多糖，所述多糖包括莢膜異多糖酸，巖藻糖以及糖醛酸，以及其他的污染物，并因此為藥物級別的DNA。除了具有非常低的，優選地不可檢測水平的莢膜異多糖酸和其他多糖之外，由本文描述的方法制備及分離的所述質粒DNA通常包括非常低水平的內毒素，所述內毒素包括一種或者多種污染性的染色體DNA、RNA、蛋白質及內毒素，并優選地含有絕大多數閉環形式的質粒DNA。根據本文描述的方法制備的所述質粒DNA具有足夠的純度用于研究及基于質粒的療法。本發明的質粒組合物可以包括任意類型具有任意尺寸的載體。例如，可以由本文描述的方法純化的質粒DNA的尺寸范圍可以為從約0. 3kbp (小環或者最小的轉錄單位)到約50kbp,典型地3kbp到20kbp,或者更大(例如5到IOOkbp,或者更大，如得自噬菌體的穿梭載體、HAC, YAC、MAC及得自EBV或者其他的非整合病毒的游離體)。在某些實施方案中，所述 DNA 包括約 0. 3kbp、0. 5kbp、0. 75kbp、lkbp、3kbp、5kbp、lOkbp、15kbp 或者 20kbp 的載體骨架，治療性的基因以及相關的調節序列。這可以應用于單鏈DNA(即0. 3kb到50kb 等等，如得自M13的那些)。因此例如，載體骨架可以能夠攜帶約l_50kbp或者更大(例如 3-20kbp)或者約l_50kb，或者更大(例如3-20kbp)的插入物。該插入物通常地取決于該質體組合物將用于的應用。對于基因療法或者基于疫苗的應用，例如，該插入物可以包括來自任何生物體的DNA，然而典型地為哺乳動物來源的，并除了編碼治療蛋白的基因之外， 可以包括調節序列(如啟動子)、聚腺苷酸化序列、增強子、基因座控制區等等。編碼治療蛋白的基因可以為基因組來源的，并從而含有如在其基因組組織中所反映的外顯子及內含子，或者其可以得自互補的DNA。該載體可以包括，例如能以高拷貝數量復制的載體骨架， 所述骨架對于治療基因的插入具有多聚接頭，編碼可選擇標記物的基因(例如四環素或者卡那霉素抗性基因)，并且其在物理上是小的及穩定的。所述質粒的載體骨架有利地允許哺乳動物片段、其他真核的、原核的或者病毒DNA的插入，并且所得的質粒可以按照本文描述地純化，并用于體內或者離體的基于質粒的療法或者其他應用。所述質粒組合物可以還包含其他藥學上可接受的組分，緩沖劑、穩定劑或者用于改進基因轉移以及特別是質粒DNA 轉移進入細胞或者生物體的化合物。通常，本文提供“超凈”質粒DNA組合物。典型地，所述質粒DNA組合物為革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物。如本文所描述的，開發了有效的基于酶促的方法，其使得莢膜異多糖酸污染從多種細菌材料中去除，所述細菌材料如質粒DNA樣品。在不同的實施方案中， 所述方法的第一步可以涉及檢測作為污染源(如質粒DNA污染)的莢膜異多糖酸。這可以直接或者間接地實現，例如，通過測試樣品中巖藻糖的存在(如下所述)，這是由于已知巖藻糖占莢膜異多糖酸的約22%。在一個實施方案中，所述質粒DNA組合物為革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA以及少于約0. Img每毫克的革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。在該實施方案中更優選地，所述組合物包含少于約0. 05mg每毫克的革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。在一個尤其優選的實施方案中，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA 組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸。如本文另外記載的，本發明的所述質粒DNA組合物也優選地包括低水平的或者不可檢測的水平的其他多糖污染物，如糖醛酸或者巖藻糖。因此，在一個實施方案中，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物包含少于約0. Img每毫克的革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。在該實施方案中更優選地，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物包含少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。優選地，在所述的質粒DNA組合物中不能發現可檢測的糖醛酸。在這些和其他實施方案中，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物優選包含少于約 0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。在該實施方案中更優選地，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物包含少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。優選地，在所述的質粒DNA組合物中不能發現可檢測的巖藻糖。組合來說，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA 的糖醛酸。例如，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含0.05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。優選地，在所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物中不存在可檢測的莢膜異多糖酸以及可檢測的糖醛酸。按照另一種組合，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。例如，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的0. 05mg的莢膜異多糖酸，以及少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。優選地，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物中不存在可檢測的莢膜異多糖酸以及可檢測的巖藻糖。在再另一個組合中，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含少于約0. Img 每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸，以及少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。例如，所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物可以包含0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸，以及少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。優選地，在所述革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物中不存在可檢測的莢膜異多糖酸、可檢測的糖醛酸以及可檢測的巖藻糖。除了前述的莢膜異多糖酸、糖醛酸和/或巖藻糖的減少的水平，本文描述的質粒組合物可以也包括，例如，少于0. Olmg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的染色體DNA或者基因組DNA、RNA、蛋白質和/或內毒素污染物；更優選地，所述組合物包括每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的少于0. OOlmg，少于0. OOOlmg或者少于0. OOOOlmg的染色體DNA或者基因組DNA、RNA、蛋白質和/或內毒素污染物。在一個實施方案中，例如，所述質粒組合物可以包含少于0. lmg(更優選地少于0.05mg，再更優選地無可檢測的量)每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸，以及少于0. Olmg (更優選地少于0. OOlmg,再更優選地0. OOOlmg)每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的宿主細胞染色體DNA或者基因組DNA污染物。所述質粒組合物可以還包含每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA組合物的少于0. lmg(更優選地少于 0. 05mg，再更優選地無可檢測的量)的莢膜異多糖酸，以及每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA 的少于0. 01mg(更優選地少于0. OOlmg，再更優選地0. OOOlmg)的宿主細胞蛋白污染物。用于檢測莢膜異多糖酸、糖醛酸、巖藻糖以及其他多糖的水平的測試在本領域內為公知(或者本文所描述)；檢測可能存在于質粒組合物中的染色體DNA或者基因組DNA、 RNA、蛋白質和/或內毒素的方法也是本領域公知的。在一個實施方案中，例如，本發明的質粒組合物可已包括每mg的革蘭氏陰性細質粒DNA的少于0. Img,優選地少于0. 05mg的莢膜異多糖酸(例如，0. 04,0. 03,0. 02或者0. Olmg)，更優選地不含有可檢測的莢膜異多糖酸，其按照二喹啉甲酸(BCA)測試進行測量。適用的BCA測試描述于例如Meeuwsen等人的Biosci. Bioeng. 89，107-109 (2000)；以及Verhoef等人的Carbohyd. Res. 340(11)，1780-1788(2005)中。示例性的用于測量莢膜異多糖酸水平的BCA測試見于實施例16。在另一個實施方案中，所述質粒組合物可以包括莢膜異多糖酸，其水平列舉于前段中，以及進一步地包含每mg的革蘭氏陰性質粒DNA的少于約0. Img的，優選地少于約 0. 05mg的糖醛酸(如0. 04,0. 03,0. 02或者0. Olmg)，以及更優選地按照糖醛酸測試沒有可檢測的糖醛酸。通常地，質粒DNA樣品的糖醛酸含量使用標準曲線進行測量，所述標準曲線由硫酸肝素或者葡萄糖醛酸作為標準獲得。例如，硫酸肝素類似于來自E. Coli的多糖污染物，這是由于糖醛酸包含約25%的硫酸肝素總重。硫酸肝素按重量50%由糖組成。這些糖的半數為葡萄糖胺，糖的另外一半為艾杜糖醛酸以及葡萄糖醛酸，剩下的硫酸肝素由糖的修飾提供，所述修飾包括硫酸酯以及乙酰胺。可選地，葡萄糖醛酸可以用于產生用于直接測量糖醛酸的標準曲線。標準溶液置于玻璃試管中，所述玻璃試管具有硼酸鹽/硫酸溶液(例如0. 025M四硼酸鈉十水合物，其溶解于具有1. 84的比度的硫酸中)并進行混合。將咔唑的純乙醇溶液加入混合物中，所述整個混合物進行渦旋震蕩并浸沒于沸水中。將試管冷卻， 并在分光光度計中讀出所述溶液在530nm的吸收。將獲得的標準的吸收值對標準的濃度進行作圖。當DNA樣品經歷相同的反應時，質粒DNA樣品的糖醛酸含量可以從其在530nm處的吸收值進行推斷。質粒DNA樣品的多糖含量可以隨后通過將糖醛酸的量加倍進行推斷， 所述加倍的倍數從3. 3到9. 1 (取決于樣品中莢膜異多糖酸、ECA以及0-和K-抗原的普遍性)。示例性的用于測量糖醛酸水平的糖醛酸測試見于實施例16。在另一個實施方案中，所述質粒組合物可以包括前述段落中所列舉水平的莢膜異多糖酸和/或糖醛酸，并進一步包含每mg的革蘭氏陰性質粒DNA的少于約0. lmg，優選地少于約0. 05mg的巖藻糖(例如0. 04,0. 03,0. 02或者0. Olmg)，以及更優選地沒有可檢測的巖藻糖，其按照巖藻糖測試進行測量。用于樣品中的巖藻糖含量的測試的基本步驟可見于Morris，Anal. Biochem. 121，129-134 (1982)。溶液制備及溶液儲存條件以及用于此測試的樣品的詳細描述也已經公開(Passonneau，J. V.和0. H. Lowry. 1974. In =Methods of Enzymatic Analysis, U. H. Bergmeyer(ed. ) , 2nd edition, Academic Press :New York, volume 4,pp. 2059-2072)。使用這種方法，測定了所述質粒DNA樣品的巖藻糖水平，并計算了莢膜異多糖酸水平的濃度。如本文別處描述的，發現莢膜異多糖酸是多種來源的質粒DNA 中的首要污染物，所述質粒DNA甚至是GMP級別的質粒DNA。示例性的用于測量巖藻糖水平的巖藻糖測試見于實施例16。在這些以及其他的實施方案中，所述革蘭氏陰性質粒組合物當與多糖選擇性標記試劑組合時，優選地不包含可視覺檢測的多糖。通常地，多糖可視化測試涉及將多糖使用熒光試劑標記，然后檢測其存在，例如，在電泳介質中。優選地，該試劑與本文描述的質粒組合物組合時沒有可檢測的多糖。在一個實施方案中，所述多糖選擇性標記試劑為(4，6_ 二氯三嗪基)_氨基熒光素(DTAF)。其他的多糖選擇性標記試劑是已知的，或者對于本領域技術人員是明顯的。示例性的利用多糖選擇性標記試劑的測試見于實施例16。此外，本文描述的莢膜異多糖酸降解方法導致質粒DNA組合物的粘度降低。相應地，通過將與處理的質粒DNA組合物的粘度與未處理的質粒DNA樣品的粘度相比，可以檢測莢膜異多糖酸的存在。示例性的利用質粒DNA的粘度水平的測試見于實施例16。通常地，隨著存在于質粒組合物中的莢膜異多糖酸的水平(和/或糖醛酸、巖藻糖或者其他多糖或者其他污染物的水平)降低，該質粒組合物的LD5tl (對于50 %的試驗種群致死的劑量)上升。例如，通過減少莢膜異多糖酸的水平到每mg革蘭氏陰性細菌質粒DNA的少于0. Img,在一個實施方案中，質粒組合物的相應的LD5tl上升至少25% ；更優選地，在本實施方案中，至少50%。通過進一步地降低莢膜異多糖酸(以及其他多糖)的水平，并且可選地類似地減少其他污染物的水平，所述污染物如染色體DNA或者基因組DNA、RNA、蛋白質和 /或內毒素，所述質粒組合物的相應的LD5tl可能上升至少50%，至少75%或者至少100%。 作為另一個實例，通過降低莢膜異多糖酸的水平到每mg的革蘭氏陰性細菌質粒DNA的少于 0. 5mg,以及將染色體DNA或者基因組DNA、RNA、蛋白質和/或內毒素污染物的水平降低到每 mg的革蘭氏陰性細菌質粒DNA的少于0. Olmg，所述質粒組合物的相應LD5tl上升至少50%， 更優選地在本實施方案中為至少100%。一般而言，本發明的質粒組合物可能用于廣泛的應用中，舉幾個例子來說，包括以下的那些領域生物恐怖(試劑檢測和分析)、環境科學(如農業、園藝學以及林學)，食品科學、法醫學、分子生物學、健康及醫學(例如基因療法、診斷、重組蛋白表達)以及空間科學。本文描述的高純質粒組合物可以用于體內或者離體，例如用于基因療法和基于疫苗的應用(即所述質粒組合物可以給予哺乳動物，包括人類)。除此之外地，或者可選地，所述質粒組合物可以用于常規的診斷以及法醫技術中，例如，用于改進此類方法學的穩定性、特異性、可再現性和/或靈敏性。這可以包括例如得自環境的樣品的分析、檢測或者檢查，例如來自公共供水系統，來自食品的樣品以及來自其他生物學或者臨床的樣品，所述樣品如血、唾液、痰、精液、頰部涂片、尿或者糞便廢物，細胞及組織的活組織檢查以及微解剖，羊水或者植物、動物或者人類患者的組織勻漿，等等。本文描述的質粒組合物的應用的其他實例包括微生物基因分型，植物及動物的DNA指紋圖譜，泥土、水、植物及動物中病原體及有益微生物的檢測，被不同的生物實體污染的生物樣品及環境樣品的法醫鑒定，以及分子學研究，如，例如建立染色體、轉錄信息的分析、X-射線晶體學以及DNA結構研究。所述的質粒組合物也可以用于與固體基質芯片連接或者組合使用的形式，除其他之外，其檢測基因、突變或者mRNA表達水平，如核酸微陣列以及分子檢測芯片，其采用如熒光、放射能力、光學干涉測量法、拉曼光譜、半導體或者其他的電子學(參見如美國專利No. 7，098，286 ；美國專利 No. 6，924，094以及美國專利No. 6，824，866 (其各個在此結合作為參考))。方法
如本文別處描述的，本發明的多肽可以在廣泛范圍的方法中應用，尤其是涉及、要求或者受益于莢膜異多糖酸的消化或者降解的那些方法，所述莢膜異多糖酸典型地為生物材料中的，如細菌樣品或者包含細菌大分子的組合物(如含水的組合物)。一般來說，含有不期待的莢膜異多糖酸的生物材料可以使用本文描述的多肽處理，所述生物材料包括生物膜(即包裹在自行產生的聚合物基質中的微生物的構造的群體，其或者粘附于活的或者無生命的表面，或者其獨自存在)、細菌裂解物、質粒DNA等等。本文描述的方法通常涉及生物材料中或者在包含生物材料的組合物中的莢膜異多糖酸的降解。通常地，所述方法使用本文描述的多肽，用于消化或者降解可能存在于材料中的莢膜異多糖酸。本文描述的方法的一個實施方案涉及，例如來自生物材料的莢膜異多糖酸的消化。可選地，該方法可以涉及含水組合物中莢膜異多糖酸的消化，所述含水組合物含有細菌大分子。作為另外可選的，所述方法可以涉及使用多肽處理含水的組合物以消化莢膜異多糖酸，所述組合物包含質粒DNA。使用多肽來消化存在于樣品中的莢膜異多糖酸；因此，所述多核苷酸具有莢膜異多糖酸降解活性，或者為莢膜異多糖酸降解酶。在一個特定的實施方案中，該方法涉及在生物材料中消化，以及該方法包括使生物材料與多肽接觸，所述多肽能夠消化莢膜異多糖酸。 所述生物材料可以為例如粗細菌裂解液，部分地純化的細菌裂解液以及含有提取的細菌核酸(如革蘭氏陰性質粒DNA)的含水溶液。可選地，所述生物材料可以為細菌粘液。作為另外可選的，所述生物材料可以為生物膜，所述生物膜包含革蘭氏陰性細菌。在另一個可選的實施方案中，所述細菌材料可以存在于漿粕(例如木或者纖維漿粕)組合物、溶液或者混合物中。在另一個實施方案中，該方法涉及從含水組合物中去除內毒素，所述組合物含有細菌大分子，并且該方法包括消化該含水組合物中的莢膜異多糖酸，以及隨后將該含水組合物與層析材料組合，以從細菌大分子中分離內毒素。在一個優選的實施方案中，所述方法涉及純化質粒DNA，如革蘭氏陰性細菌質粒DNA，并且所述方法包括使用多肽處理含有質粒DNA 的含水組合物以消化莢膜異多糖酸，并將質粒DNA從處理的含水組合物中分離，例如使用常規的層析技術。在下文描述的一系列的工業方法中也可以采用所述多肽。在特定的方面，已經開發了用于從質粒DNA樣品中去除污染性多糖的方法，其使得多糖的去除成為可能，包括從質粒DNA樣品中去除包括LPS之外的那些。除此之外，RNA 及LPS也從所述質粒DNA樣品中去除。因此，本發明的方法導致了純化的質粒DNA，如下所述，其含有極低的以及在多個情況下不可檢測水平的多糖。不像前述的方法無法確定污染性多糖的水平，可以進行特定步驟來對DNA樣品中的多糖水平定量，從而使得研究者能夠確信多糖從DNA樣品的去除。總的來說，可以采用本文描述的任意多肽。例如，所述多肽可以包含與SEQ ID NO 1具有至少90%同源性的氨基酸序列，或者所述多肽可以包含與SEQ ID NO :2具有至少 90%同源性的氨基酸序列。在一個特定實施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列。在另一個特定實施方案中，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列。對于本文描述的特定方法的起始物料為大量的細菌材料，或者含水組合物，其包含該生物材料，如細菌細胞或者其他細菌物質，其通過例如發酵或者細胞培養、從環境中分離或者得自組織或者其他生物體(如真菌、細菌等等)制備。在一個實施方案中，所述生物材料包括得自腸細菌的細菌細胞，所述腸細菌如E. Coli0在另一個實施方案中，所述生物材料為細菌粘液，根據此實施方案中，例如，莢膜異多糖酸存在于細菌的細胞膜中。在一個優選的實施方案中，所述生物材料為革蘭氏陰性細菌質粒DNA材料。多種細胞類型可以用作本文描述的方法的原料，如細菌(例如革蘭氏(_)、革蘭氏 (+)以及古細菌)、酵母以及其他的原核及真核細胞，包括哺乳動物細胞和重組細胞。在這些以及其他的細胞類型中，細菌細胞，以及尤其優選革蘭氏陽性(+)以及革蘭氏陰性(_)細菌細胞，如E.coli、沙門氏菌或桿菌，而革蘭氏陰性(-)細菌細胞為最優選的。在特定的實施方案中，所述細菌為革蘭氏陰性(_)細菌，在本實施方案中更優選的細菌為E. Coli.根據本文描述的方法，E. Coli宿主株是有用的，所述宿主株具有廣泛選擇的并是廣泛接受的，同時所述宿主株除了其他商業來源，可得自Stratagene (La Jolla, CA)，Qiagen (Valencia, CA), New England BioLabs (Ipswich, MA)以及 Promega (Madison, WI)。典型地，所述生物材料為細菌裂解液，或者其衍生物。因此，細菌的起始物料(如細菌細胞等等)必須裂解或者瓦解以形成裂解物。總而言之，細菌裂解步驟涉及用于打開細菌細胞的任意常規方法，從而將核酸及其他細胞組分從中釋放出來。所述裂解步驟可能涉及機械方法、裂解試劑或溶液，或其組合的使用。對于得自發酵或者細胞培養的生物材料，所述細胞使用如下所述的化學的或者機械的技術瓦解，從而形成粗裂解液。例如，采用細菌培養時，將細菌細胞裂解，從而形成粗細菌裂解液。通過這些操作，細胞組分從細胞中釋放，所述細胞組分包括DNA、RNA、蛋白質、莢膜異多糖酸以及其他多糖。在特定的實施方案中，所述裂解液可能經歷預處理的步驟，如純化步驟，以去除細胞污染物以及內毒素，從而形成部分純化的(如細菌的)裂解液。當使用裂解試劑時，裂解試劑用于破壞細胞膜，從而使DNA、RNA以及蛋白質從細胞中釋放。一種優選的裂解試劑包括堿性溶液。在常規堿性裂解步驟中可以采用多種堿， 包括，例如，氫氧化鹽，如氫氧化鉀(KOH)、氫氧化鋰(LiOH)或者氫氧化鈉(NaOH)。典型地， 所述堿為氫氧化鈉。通常，在裂解溶液中采用去污劑，其單獨使用或者與堿性溶液組合使用。一般而言，以及取決于其應用，所述去污劑可以為陽離子的、陰離子的、非離子的或者兩性離子的去污劑或者其組合。一種示例性的陰離子去污劑為十二烷基硫酸鈉(SDS)。一種示例性的兩性離子的或者非離子的去污劑為Tween20。用于裂解細菌細胞的機械方法包括攪拌，超聲，離心，冷凍/解凍，弗氏細胞壓碎器等等，其單獨使用或者與裂解溶液及試劑組合使用。用于裂解細菌細胞并釋放和提取蛋白質及核酸的堿性裂解以及機械技術通常是公知的，并且描述于如前文的Sambrook等人的。在一些實施方案中，可能期待形成澄清的裂解液制備物，其中宿主細胞的染色體 DNA、蛋白質以及膜部分已經至少部分地去除了，如通過裂解液的化學處理或者離心，從而留下含有質粒DNA的溶液。可選地可以在步驟中不同的點加入RNA酶，以產生澄清的、基本上不含RNA的裂解液。如本文另外地記載的，開始多種細胞的和核酸污染物的去除可以改進莢膜異多糖酸的消化和/或質粒DNA使用常規層析技術的進一步的純化。產生澄清的裂解液的方法在本領域內公知。例如，可以通過使用氫氧化鈉或者其等價物(0.2N)以及十二烷基硫酸鈉(SDS) (1%)來處理宿主細胞，離心并丟棄上清液。產生澄清的裂解液的此方法通常描述于，例如 Burnboim 等人的 Nucl. Acids Res. ,7,1513 (1979)；以及 Horowicz 等人的 Nucl. Acids Res.，9，2989 (1981)。
對于許多用途，例如治療用途如用于基因療法或者疫苗的形成，可能期待在樣品與莢膜異多糖酸降解多肽接觸之前或之后，進一步純化得自細菌或者其他裂解液的核酸。在如前所述形成細菌裂解液之后，在使用所述多肽嘗試消化莢膜異多糖酸之前， 通常優選地使粗裂解液經過分離技術，以消除至少部分的存在的其他核酸、蛋白質以及細胞污染物。因此，在一個實施方案中，例如，在使用多肽處理之前，將含有生物物質的材料或者組合物與離子交換層析材料組合。典型地，所述層析材料為陰離子交換層析樹脂。在優選的實施方案中，所述陰離子交換層析樹脂包括二乙基氨基乙基纖維素(DEAE)。一般來說， 常規的DNA，包括質粒DNA，可以采用清除技術。生物材料也可以在使用多肽處理后與層析材料組合。這通常地涉及親和層析和/ 或疏水相互作用層析。在特定的實施方案中，生物材料或者含水組合物與陰離子交換層析樹脂組合，使用多肽處理，與親和層析樹脂組合，與疏水相互作用層析樹脂組合，并經歷過濾，以該順序。一旦所述生物材料經過裂解或者制備，該材料使用本文描述的多肽處理。典型地， 處理涉及使多肽與生物材料接觸或者混合，從而該多肽到達該材料或者組合物中存在的莢膜異多糖酸底物。優選地，將所述生物材料及所述多肽孵育，以使所述酶以及莢膜異多糖酸底物之間能夠充分地相互作用。典型地，該孵育可以持續1到6個小時，6到12個小時， 12到24個小時，或者更長，其取決于所消化的樣品的尺寸，所使用的多肽的量，以及環境因素，所述環境因素如溫度、氣氛等等。該孵育通常在0°C至100°C的溫度下進行，更優選地在 25°C至75°C (例如30°C至50°C)。在一些實施方案中，可以期待在孵育過程中改變溫度， 例如在較冷的溫度下開始該孵育，并隨后在剩余的孵育循環中升高溫度，或者反過來。如前文所記載的，通常期待在使用本發明的多肽處理之前或者之后，純化所述生物材料或者含有生物材料的含水組合物。一般來說，這可能涉及使所述材料或者組合物經歷一個或者多個層析方法或者進行過濾。在一個實施方案中，采用層析分離的組合。因此例如，可以在該方法中的不同時間將所述生物材料或者組合物與層析材料組合。適用的層析材料包括，例如，除了一系列其他的之外，離子交換層析樹脂(例如陰離子交換層析樹脂以及陽離子交換層析樹脂)、疏水相互作用層析樹脂以及親和層析樹脂。在一個實施方案中，所述層析材料選自陰離子交換層析樹脂，陽離子交換層析樹脂，疏水相互作用層析樹脂及親和層析樹脂。如前文所記載的，所述生物材料或者組合物可以在使用多肽處理之前或之后，或者處理之前以及之后與層析材料(或者多種層析材料)組合，其采用單次的或者多次層析分離。例如，所述樣品可以與層析材料組合，使用本文描述的多肽處理，然后經歷第二次 (或者第三次、第四次、第五次等等)層析步驟。除此之外，所述樣品可以經歷常規的過濾技術，從而進一步地純化或者從所述樣品中去除污染物。所述過濾步驟可以在所述方法中相對早地進行，例如在使用酶處理之前，或者在所述方法中更晚地進行，例如作為最終產品的儲存或者使用之前的最終過濾步驟。在另一個方面，因此，本發明的方法包括能夠降解存在于細菌裂解樣品中的莢膜異多糖酸的多肽的用途，所述用途為至少一個額外的層析技術之前或者之后。所述額外的層析步驟可以可選地存在，或者典型地作為一個或多個最終的純化步驟存在，或者至少在樣品或者質粒純化方案的結尾或者接近結尾存在，或者在莢膜異多糖酸消化步驟之前。因此，優選一次或者多次離子交換層析、親和層析(如硼酸鹽親和層析)、疏水相互作用層析以及過濾與所述莢膜異多糖酸降解步驟結合。其他的技術可以包括凝膠滲透或者尺寸排阻層析、羥磷灰石(I型和II型)層析以及反相層析。一般來說，任意可用的涉及核酸分離的層析步驟以能改變以應用。除此之外，任一個或者多個步驟或者技術中可以采用高效層析技術或者系統。因此，本發明的方法包括莢膜異多糖酸消化步驟，所述步驟具有一個或者多個離子交換層析步驟，并可以進一步包括親和層析、疏水相互作用層析或者凝膠滲透層析和/或過濾(如切向流過濾(TFF)或者尺寸排阻過濾)。離子交換層析的步驟，例如可以用于流化床離子交換層析以及軸向和/或徑向高分辨率陰離子交換層析中。在一個優選的實施方案中，在莢膜異多糖酸降解步驟之前進行離子交換層析，從而去除可能妨礙酶與底物相互作用的顆粒。本發明在此描述的方法，例如用于純化質粒DNA的方法，是可擴展的，并因此可以修改放大到大規模生產。在本發明的一些實施方案中，莢膜異多糖酸降解步驟可以與額外的純化步驟組合，以產生含質粒DNA的高純度產品。其可以例如，與至少一種絮凝物去除(如裂解液過濾、沉降或者離心)、離子交換層析(如陽離子或者陰離子交換)以及疏水相互作用層析組合。在一個實施方案中，所述莢膜異多糖酸降解步驟在離子交換層析之后。在這些以及其他的實施方案中，所述莢膜異多糖酸降解步驟在疏水相互作用層析之前。在優選的實施方案中，細菌裂解之后為離子交換層析，離子交換層析之后為親和層析(例如，使用硼酸鹽或者其他的連二醇或者順式二醇特異的化合物)，其隨后為疏水相互作用層析。在一個或者多個這些步驟之后或者之間，可以使樣品經歷過濾，例如切向流過濾。這些步驟使得可真實地擴展的質粒生產方法成為可能，該方法能夠產生大量的具有高純度水平的質粒DNA。宿主細胞DNA及RNA、蛋白質、內毒素及莢膜異多糖酸污染物優選地為不可檢測的。如前文所記載的，本發明的方法也可以使用進一步的步驟，所述步驟為尺寸排阻層析(SEC)、反相層析、羥磷灰石層析和/或其他可用的層析技術、方法或者系統，根據本申請，以上與本文描述的步驟相組合。可以采取絮凝物去除步驟，從而為所得到的質粒DNA產物帶來更高的純度。該步驟可以用于去除一大部分的沉淀材料(絮凝物)。一種實施絮凝物去除的機理是通過裂解液過濾步驟，如通過1到5mm，優選地3. 5mm的柵格過濾器，隨后以深層過濾作為精制過濾步驟。實施絮凝物去除的其他方法為通過離心或者沉降。可選地，所述絮凝物可以通過離子交換層析去除。因此，在內毒素去除和/或質粒DNA純化過程中的不同時間，可以使樣品經歷一次或者多次離子交換層析(如陰離子或者陽離子交換層析)、親和層析、疏水相互作用層析以及過濾(如通過0. 2 μ m和/或0. 45 μ m的濾器過濾)以及可選地，過濾或者經歷層析方法第二次、第三次或者第四次或者更多次。因此，例如，可以使所述樣品經受第一次層析材料，使用多肽處理，經受第二次層析材料，然后經受第三次層析材料。該樣品也可以在該順序的不同時間進行過濾，例如在第一次層析分離之后，或者在第三次層析分離之后。應當認識到，使所述樣品經受第一次層析材料也涉及將想要的樣品的部分(例如含有純化的質粒DNA的部分)從層析材料上洗脫， 并丟棄樣品不想要的部分。取決于所述層析材料的性質，想要的部分可能留在層析材料中并在不同的步驟中洗脫，而不想要的材料在該材料上流過，或者不想要的材料可能留在層析材料中而想要的部分在該層析材料上流過。在上述過程的不同位置，有利地對核酸產量和純度進行分析測定。典型地，該測試在各個純化步驟之前和之后對例如來自制備型離子交換層析或者過濾的各個含有核酸的組分進行。進行這些分析測定的代表性方式包括純度的HPLC分析、產量的分光光度法測定，用于蛋白質分析的銀染以及SDS-PAGE以及用于DNA分析的瓊脂糖凝膠電泳以及DNA印跡。在特定的實施方案中，本文描述的方法產生純化的濃度，其中質粒DNA濃度(包括例如主要為超螺旋的或者其他的質粒DNA)為大約70 %，75 %，80 %，85 %，90 %，95 %以及優選地99%，或更大。除此之外，通常也期待分析測定中間產物以及最終產物中多糖的存在，所述多糖如莢膜異多糖酸、糖醛酸和/或巖藻糖。對于莢膜異多糖酸及其他的多糖適用的測試本文另外描述(例如在實施例16中)。下文中進一步地詳細描述了特定的層析以及過濾技術。離子交換層析。如前文所記載的，離子交換層析可以用于在使用多肽處理之前或者之后純化所述生物樣品。該方法通常地在生物裂解液中或者裂解液衍生物中，將核酸例如質粒DNA從污染性內毒素、痕量蛋白質及殘留的細胞污染物中分離。陽離子或者陰離子交換可以選用， 其取決于污染物的性質以及溶液的PH。例如，陰離子交換層析通過將負電性的(或者酸性的)分子結合于正電性的支持物上起作用。離子交換層析的應用，隨后，使得分子能夠基于其電荷而被分離。分子的各種類(酸性、堿性以及中性)可以容易地通過該技術分離。可以采用分步的洗脫方案，其中多種污染物在早期組分中洗脫，而所述質粒DNA在隨后的組分中洗脫。離子交換層析對于從質粒DNA制備物中去除蛋白質以及內毒素是相對地常見的方法。使用的所述離子交換層析或者任意一種或者更多種其他層析步驟或者技術可以采取固定相、置換層析法方法、模擬移動床技術和/或連續床柱或系統。能夠用于本發明的方法中的離子交換柱包括陽離子以及陰離子離子交換柱。在更優選的實施方式中，所述離子交換層析材料為陰離子交換層析樹脂。例如，所述陰離子交換層析材料樹脂可以包括二乙基氨基乙基纖維素(DEAE)、三甲基氨基乙基(TMAE)、季氨基乙基(QAE)或者聚乙基亞胺基(PEI)樹脂。在一個實施方案中，所述陰離子交換層析樹脂包括DEAE。在另一個實施方案中，所述陰離子交換層析樹脂包括季銨樹脂。例如，可以使用一種或者多種本文描述陰離子交換層析樹脂填充層析柱。柱的最優容量按照經驗，基于所使用的樹脂以及純化的核酸的大小決定。對于多種質粒DNA，優選的樹脂為沒有孔的或者具
有大的孔尺寸的(例如大于1000°A,優選地約3000°A到4000°A)，具有中等的珠子尺寸的 (例如，約20到500 μ m的直徑)，其不浸出基質組分的那些。理想地，該樹脂是可洗滌的， 如使用氫氧化鈉洗滌，從而允許重復的使用。也可以使用相對弱的陽離子及強的陽離子交換柱。相對強的陽離子交換柱典型地具有聚羥基化的聚合物涂布的、并通過丙磺酸基、由丙磺酸基功能化的葡聚糖基質功能化的表面，或者具有聚羥基化的聚合物涂布的表面，所述聚羥基化聚合物由乙磺酸基功能化。 使用各個的這些材料的強陽離子交換柱的實例除了別的之外，分別包括POROS HS 、POROS S 以及SP-S印hadex 柱。相對弱的陽離子交換柱典型地具有葡聚糖基質，該基質由羧甲基或者由羥基功能化的丙烯酸基質功能化。使用各個的這些材料的弱陽離子交換柱的實例除了別的之外，分別包括CM-S印hadex 以及BiO-Rex70TM。在本發明的方法中，也可以使用相對弱的陰離子及強的陰離子交換柱。弱的陰離子交換柱典型地具有聚乙烯亞胺(所述聚乙烯亞胺能夠表面離子化到PH為約9)、含有磺酸基團的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物或者葡聚糖基質(其由二乙基氨基功能化)涂布的表面。使用各個的這些材料的弱陰離子交換柱的實例除了別的之外，分別包括POROS PI 柱、Dowex 50 柱以及DEAE-S印hadex 。相對強的陰離子交換柱典型地具有季銨化的聚乙烯亞胺涂布的表面，其具有離子化的表面，PH為約1到約14。該強陰離子交換柱的實例為POROS HQ 柱或者SOURCE 柱。用于前文列出的柱的樹脂可得自Amersham/ Pharmacia (Piscataway, N.J. ), PerSeptive Biosystems (Foster City, Calif. ), Toso Haas (Montgomeryville, Pa. ), GE Healthcare (Piscataway, NJ),以及其他供應商。典型地，所述樣品與存在于柱中的離子交換層析樹脂組合。所述柱可以為0. 5ml 的柱，1. 5ml的柱，IOml的柱，20ml的柱，30ml的柱，50ml的柱，IOOml的柱，200ml的柱，30ml 的柱，400ml 的柱，500ml 的柱，600ml 的柱，700ml 的柱，800ml 的柱，900ml 的柱，1000ml (IL) 的柱，2000ml (2L)的柱，20L的柱，30L的柱，40L的柱，50L的柱，60L的柱，70L的柱，80L的柱，90L的柱，100L的柱，或者具有大于100L的體積的柱，以及任意其他具有前面列出的體積之間的容量的柱。典型地，所述離子交換層析材料在使用前平衡，所述平衡在pH從約6. 0到約7. 2， 以及鹽濃度為從約IOOmM到200mM進行。因此，所述柱可以在pH為約6. 0，6. 1,6. 2,6. 3, 6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9,7. 0,7. 1,7. 2或者任意其他這些pH值之間的pH下，以及在 IOOmM, 125mM, 150mM, 175mM,200mM或其他位于前面列出的鹽濃度數值之間的任意濃度下進行。能用于平衡所述層析材料的通常使用的鹽包括NaCl，KCl或者其他任意的能夠調節到與KCl的離子強度匹配的鹽。對于離子交換層析而言，填充材料以及用于制備該材料的方法，以及制備的過程， 聚合及使陰離子及陽離子交換層析功能化，以及從中洗脫及分離質粒DNA在本領域中為公知的。除此之外，可以使用二價金屬離子的螯合劑，如，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，用于抑制質粒由于DNA降解酶的降解，所述降解酶在大腸桿菌的裂解液中。對于二價金屬離子的螯合試劑的濃度優選地為0. 1到100mM。當將目標蛋白質施用到陰離子交換基質上，可以采用任意合適的基質，所述基質包括但不限于氨基乙基、二乙基氨基乙基、四級氨甲基、四級氨乙基、二乙基-(2-羥丙基)氨基乙基、三乙基氨基甲基、三乙基氨基丙基以及聚乙烯亞胺交換劑，從而達到目標蛋白質的過濾。商業上可得的陰離子交換劑的實例包括，纖維素離子交換劑如 DE32 及 DE52 (WHATMAN, Florham Park, N. J.)，葡聚糖離子交換劑如 DEAE-SEPHADEX C-25, QAE-SEPHADEX C-25， DEAE-SEPHADEX C-50 以及 QAE-SEPHADEX C-50(Pharmacia, Piscataway, N. J.)，瓊脂糖或者交聯的瓊脂糖如 DEAE ΒΙΟ-GEL A(BIO-RAD, Hercules, Calif.), DEAE-SEPHAROSE CL-6B 以及 Q-SEPHAROSE Fast Flow (Pharmacia)，合成的有機聚合物如 MONO Q(Pharmacia)，DEAE-5-PW 以及 HRLC MA7P (BIO-RAD)以及涂布的二氧化硅基質如DEAE Si5500及TEAPSilOO。期待地，所述陰離子交換基質在非常低的鹽濃度下平衡，并在堿性PH(例如pH8. 0到11. 5)下使用，從而促進酸性和弱堿性的污染物的結合。當將目標蛋白質施用于陽離子交換基質時，預期可以采用使用羧甲基、磺酸鹽、磺乙基或者磺丙基基團功能化的任意基質。期待地，所述陽離子交換基質在酸性的PH(例如 PH3. 0到6. 5)平衡和使用以促進堿性和弱酸性的污染物的結合。商業上可得的陽離子交換劑的實例為，基于纖維素的CM 23，CM 32以及CM 52 (WHATMAN)；基于葡聚糖的CM-SEPHADEX C-25, SP-SEPHADEX C-25， CM-SEPHADEX C-50 以及 SP-SEPHADEX C-50(Pharmacia)；基于瓊脂糖或者交聯瓊脂糖的 CM ΒΙΟ-GEL A(BIO-RAD)，CM-SEPHAROSE Fast Flow and S-SEPHAROSE Fast Flow (Pharmacia)；基于合成的有機聚合物的 MONO S (Pharmacia)， SP-5-PW 和 HRLC MA7C(BIO-RAD)，以及涂布的二氧化硅基質，如 CM Si300 及 SP SilOO0所述樣品(例如裂解液或者其衍生物，包括核酸)典型地在加載緩沖液中加載到柱上，所述緩沖液包含比核酸從柱上洗脫的濃度更低的鹽濃度。一般地說，在特定的實施方案中，所述鹽濃度為從約10到50mS，其取決于所使用的樹脂。一般地說，對于較弱的陰離子交換樹脂，使用較低電導率的溶液，然而對于較強的陰離子交換樹脂，使用較高電導率的溶液。所述柱隨后使用幾個柱容量的緩沖液洗滌，以去除與樹脂弱結合的物質。隨后，使用根據常規方法，使用平緩連續的鹽水梯度從柱上洗脫各組分，所述方法例如使用Tris-HCl 緩沖溶液中高達1.5M NaCl。從柱上收集樣品組分。對于中等規模的制備而言(例如從約 IOOmg到約3克核酸)，組分典型地為至少50ml到2升，其中預期有核酸峰，在預期的峰后的組分中體積增加。核酸產量及純度的分析測定對一種或者多種組分施行。除此之外，鱟變形細胞溶解物(LAL)測試(例如檢測內毒素的脂類A部分)可以對于各個組分施行，從而測定殘留的內毒素和/或其他本文描述的測試可以對各個組分實施，從而測定剩余的多糖污染物水平，例如在各個組分中的莢膜異多糖酸或者相關的多糖(如下文所述)。含有高水平的核酸以及低的內毒素或者低的莢膜異多糖酸的組分可以積累或者保持為分開的組分。 如下所述，所得到的核酸樣品可以再次過濾(例如，通過0.2μπι的濾器)或者經歷進一步的層析技術，其取決于內毒素及多糖的水平及期待的純度。本文公開的離子交換層析材料的支持基質不是嚴格的，然而，基于葡聚糖、纖維素、交聯葡聚糖、合成的有機聚合物、涂布的二氧化硅或者瓊脂糖的支持物基質在本領域中是常規的并適于在此的用途。親和層析如前文所記錄的，親和層析能夠額外地或者可選地采用，以純化所述的生物樣品。 本發明的一個特別的方面涉及使用本文描述的多肽的莢膜異多糖酸降解方法，以及使所消化的材料與親和層析材料組合，以選擇性地去除消化的多糖，如莢膜異多糖酸。尤其優選的親和層析材料對連二醇或者順式二醇具有親和性。在一個特別的實施方案中，所述親和層析材料為硼酸鹽層析樹脂，如基于硼酸或者基于硼酸鹽的樹脂。在基本的方面，所述親和層析涉及選擇性的吸附劑的制備，所述制備通過使分子共價地固定化在適用的不溶的支持物上，所述分子含有可識別的區域，對于進行分離的靶樣品，該區域是特異的。所述固定化的化合物通常指配體，以及公認地所述配體與支持物的偶聯必須以不影響其被目標識別的能力的方式完成。在配體及要純化的目標分子之間的親和性可以通過使含有樣品的樣品通過含有選擇性吸附劑的柱完成，后者樣品包括目標分子。隨后通過使用緩沖液洗滌柱完成純化，所述緩沖液用于將不需要的材料從吸收性基質中釋放，隨后將吸收的目標分子洗脫。通過將一定體積的生理緩沖溶液，例如PH約7. 2的磷酸鹽緩沖液通過該柱完成洗滌。在洗滌步驟中所使用的緩沖液的體積不應該大到使目標分子損失的地步，然而從另一方面來說，也不應該有限到不去除雜質的地步。洗脫是將目標分子從柱上去除的步驟，其通過溶劑進行，所述溶劑減少目標分子與配體的親和性或者配體-靶分子復合物的分子與固體支持物的親和性。與抗原偶聯的抗體的洗脫可以通過鹽梯度以改變PH ；緩沖的步驟梯度以改變離子強度；或者其他方法完成。理想的固體支持物或者基質應該具有幾個性質，包括大孔性、機械穩定性、容易活化、疏水性以及惰性，也即低的特異性吸收。在這些全部的方面中，沒有基質是理想的；基質通常按照經驗確定。本領域技術人員通常使用的親和層析基質包括交聯葡聚糖，瓊脂糖，聚丙烯酰胺，纖維素，二氧化硅以及聚(甲基丙烯酸羥乙酯)。對于免疫吸附而言，珠狀的瓊脂糖由于其高的蛋白質吸收能力、高孔性、親水性、化學穩定性、缺少電荷以及對于非特異性吸收的相對惰性，通常地為本領域技術人員優選的固體支持物。配體可以物理地吸附到基質上，或者共價地與含有羥基或者氨基的聚合物基質通過雙官能的試劑連接。連接通常需要兩步基質的活化和配體與活化的基質的偶聯。活化的基質是商業上可得的。將配體偶聯到基質上的選擇性方法部分地由基質的選擇決定，部分地由配體的選擇決定。在用于樣品施用的制備中，用于平衡親和柱的特異性的緩沖條件應該反應所使用的作用體系的特異性質。所使用的緩沖液的性質，包括其PH及離子強度，應該對于所述配體-靶分子體系是最優的。應用于柱的目標樣品應該優選地包含于與用于平衡柱一樣的緩沖液中。在樣品施用以及吸附之后，柱可以使用開始的緩沖液洗滌以去除任何未結合的樣品及任何雜質。隨后將柱用與開始的緩沖液不同的緩沖液洗滌也是常見的，其用于去除非特異性吸附的物質。靶分子的洗脫可以通過多種方法完成，其包括但不限于在此所列出的這些。典型地，緩沖液的條件可以變化，從而結合復合物的親和充分地下降，從而破壞彼此或者與固體支持物的有效結合。這通過改變緩沖液的PH或者離子強度，或者兩者，或者通過離液序列高的離子，例如氰酸鹽來實現。可以通過梯度洗脫獲得增強的分離。適用的洗脫方法包括使用離液序列高的試劑如KSCN ；有機溶劑如乙二醇、DMSO或者乙腈；變性劑，如8M尿素或者6M鳥嘌呤；電泳洗脫；壓力引發的洗脫以及金屬離子洗脫。不完全的洗脫導致產品的損失以及柱容量的損失。理想地，洗脫條件應該在一個或者兩個柱體積通過柱之后，實現產品的完全洗脫。親和層析的詳細討論可以見于Handbook of Affinity Chromatography, David S. Hage(ed. )CRC Press(2006)禾口 Affinity Chromatography :A Practical Approach,編輯為 Dean P. D. G. , Johnson, W. S. , Middle, F. A. , Affinity Chromatography, Principles and Methods,由 Pharmacia 出版，(Pharmacia LKB Biotechnology,Uppsala, Sweden),以及 Immunoaffinity Purification :Basic Principles and Operational Considerations, Yarmush，M. L，等人，(1992) Biotech Adv. , 10 :412-446 用于親和層析的配體在結構上及生物學上與所要純化的靶分子緊密聯系。出于本發明的目的，可以采用任何適用的親和層析材料及其配體，從而將目標樣品(如質粒DNA) 結合并洗脫。一般地說，這進行對每個情況特異的配體的選擇。
優選地，用于親和層析材料的配體對于二醇復合物具有特異性，其優選地為連二醇或者順式二醇。多糖，例如，如莢膜異多糖酸含有連二醇復合物。在特別地優選的實施方案中，所述親和層析材料為硼酸鹽親和層析材料。硼酸鹽親和柱首先被Weith等人， Biochemistry 9，4396_4401，1970用于糖和核酸組分的分離；此后，該技術用于廣泛范圍的順式二醇化合物的分離，所述化合物包括核苷、核苷酸、碳水化合物、糖蛋白以及酶。一般來說，硼酸與順式二醇之間的作用機理涉及硼酸鹽在堿性條件下的羥基化；所述硼酸鹽從三角形共面形式變為四面體硼酸鹽陰離子，其隨后能夠與順式二醇形成酯。所得到的酯可以在酸性條件下水解，從而將此反應逆轉。其他的用于制備連二醇的方法描述于 Barry 等人的，Australian J. Chem. 37，(1984) ；Gable, Organometallics 13(6),2486 88(1994) ；Liu, J.Microbial Methods29，85—95(1997)Kinrade 等人， DaltonTrans. 3713-3716(2003)；以及 Zhao 等人的，Analytical Sciences, 22 (5)， 747(2006)中。用于本方法中的親和層析材料的適用的硼酸鹽配體包括，例如3-氨基苯基硼酸 (3aPBA) ,2-(((4-二羥硼基苯基)_甲基)乙基氨基)乙基，2-(((4-二羥硼基苯基)_甲基) 二乙基氨基)乙基，Ρ_(ω-氨基乙基)苯基-硼酸鹽，聚(對乙烯基芐基硼酸)，N-(4-硝基-3- 二羥基硼基苯基)琥珀酸，4- (N-甲基)羧酰胺-芐基硼酸)，3-硝基-4-羧酰基芐基硼酸，2-硝基-3-琥珀酰胺基-芐基硼酸以及3-琥珀酰胺基-4-硝基芐基硼酸等等。一種優選的硼酸鹽配體為3-氨基苯基硼酸(3aPBA).本文公開的用于親和層析材料的一類支持物基質包括硼酸鹽親和層析材料，這不是嚴格的，然而基于葡聚糖、纖維素、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅、聚苯乙烯以及聚甲基丙烯酸酯的支持基質在本領域中是常規的，并適用于本文應用。硼酸鹽親和基質在多個商家處可以商業上得到，包括例如Sigma-Aldrich Inc.(硼酸凝膠；聚甲基丙烯酸酯支持物) (間氨基苯基硼酸-丙烯酸酯；丙烯酸珠支持物)；Bio-Rad (AfTi-Gel 601 ；聚丙烯酰胺支持物)；Pierce (免疫的硼酸凝膠；聚丙烯酰胺支持物)；以及Tosoh (間氨基苯基硼酸-瓊脂糖；瓊脂糖支持物)(TSKgel硼酸鹽-5PW柱；聚甲基丙烯酸酯支持物)。其他提供硼酸
Denisco (Hyderabad, India) \)J,R Synthonix Corporation (Wake
Forest, NC)。描述于美國專利No. 5，969，129 (在此以其全文結合作為參考)中的含有硼酸鹽基團的聚合物凝膠也可以使用。用于硼酸鹽親和層析的原理、理論及設備也描述于Boronate Affinity Chromatography, Chapter 8, pages 215—230, Handbook of Affinity Chromatography, David S. Hage (ed. ) CRC Press (2006)。疏水相互作用層析法在采用了疏水相互作用層析(HIC)材料和方法的實施方案中，這些層析方法通常地采用基質上的疏水部分吸引用于純化的樣品中分子的疏水區域。一般來說，HIC支持物要通過聚集效果起效，典型地，當這些分子結合的時候，，沒有共價鍵或者離子鍵形成或者共享。疏水相互所用層析是有利的，這是由于其至少部分地去除開環的質粒形式以及其他污染物，如基因組DNA、RNA以及內毒素。出于本發明的目的，可以采用任何適用的疏水相互作用基質，用于目標樣品(如質粒DNA)結合并洗脫。該疏水相互作用基質包括，但不限于天然的或者人工的表面，所述表面含有無電荷的基團，如甲基、乙基或者其他烷基基團。這些基團與蛋白質形成疏水鍵， 所述蛋白質通過基質，并導致多核苷酸和/或多肽的分離，該分離基于所述多核苷酸和/或多肽與基質基團之間的相互作用的強度。樹脂材料的疏水性程度可以根據培養基中的鹽濃度或者洗脫液中的鹽濃度而變化。疏水相互作用柱通常地包括基礎基質(例如交聯的瓊脂糖或者合成的共聚物材料)，疏水性的配體(如烷基或者芳基)偶聯于其上。優選的疏水相互作用層析樹脂通常地包括2到20個碳原子長的烷基部分(如4到18個碳原子或者6到 15個碳原子)，其典型地是未取代的。用于疏水相互作用層析的基體材料的孔直徑通常在500到4000A,然而其可以在所述的范圍內，根據要分離的樣品及其組分的分子尺寸進行適當的選擇。一般來說，由于核酸在填充材料上的保留以及吸附能力可能根據孔直徑變化，優選地對于具有相對地大的分子尺寸的核酸使用具有相對地大的孔直徑的基體材料，而對于具有相對地小的分子尺寸的核酸使用具有相對地小的孔直徑的基體材料。疏水相互作用層析可以在低壓或者高壓下進行，其中所述柱在含水緩沖液的存在下使用相對高的鹽濃度(如1.2到1.7M硫酸銨)平衡，并在含水緩沖液的存在下使用相對低的鹽濃度(如從1.2M到0.5M降低的硫酸銨梯度)洗脫。因此，多核苷酸以及多肽根據與基質上的疏水基團之間疏水相互作用的不同強度洗脫，也即按照蛋白質疏水性提高的順序。用于相對低壓的應用的商業上可得的疏水相互作用基質的例子包括Phenyl SEPHAROSE(Pharmacia)以及丁基、苯基以及醚 T0Y0PEARL 650 系列樹脂(Toso Haas)。其他的商業上可得的疏水相互作用層析樹脂包括Wienyl SEPHAR0SE6 FAST FLOW 柱，其具有低度或者高度的修飾(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden) ；Phenyl SEPHAROSE High Performance column(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden) ；Octy1 SEPHAROSE High Performance column(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden)； FRACT0GEL EMD Propyl 或 FRACT0GEL EMD Phenyl columns(E. Merck，Germany)； MACRO-PREP Methyl 或 MACRO-PREP t-Butyl Supports (Bio-Rad, California)；以及 WP HI-Propyl (C3) column (J. T. Baker, New Jersey).再其他的商業上可得的疏水相互作用層析樹脂為可得自 Sigma-Aldrich, Inc (St. Louis, MO)的(例如，TSK-GEL Butyl-NPR ； TSK-GEL Ether-5Pff ；TSK-GEL Phenyl_5PW ；其各個及其他可能具有多種顆粒尺寸)，GE Healthcare (Piscataway, NJ)(例如，HiScreen Phenyl FF (high or low sub) ；HiScreen Butyl FF ；HiScreen Butyl-S FF ；HiScreen Octyl FF)。從疏水相互作用基質的洗脫可以按照分步的或者線性梯度來進行。適用的洗脫緩沖液在現有技術中是公知的。適用的柱的尺寸與離子交換層析材料一起描述于前文。類似地，本文公開的疏水相互作用層析材料的支持物基質不是嚴格的，然而，基于葡聚糖、纖維素、交聯瓊脂糖、合成的有機聚合物、涂布的二氧化硅或者瓊脂糖的支持物基質在本領域中是常規的并適于在此的用途。用于疏水相互作用層析的基體材料的合成以及用于制備、聚合及功能化疏水相互作用層析及洗脫和分離如質粒DNA樣品的方法在現有技術中是公知的，并尤其描述于美國專利No. 6，441，160以及美國專利No. 7，169，917中(其各自在此以其全文結合作為參考)。過濾
根據特定的優選實施方案，也可以進行一次或者多次過濾、超過濾或者滲濾步驟， 包括切向流過濾。通過尺寸排阻濾器的過濾可以用于至少部分地去除內毒素及其他污染物，而導致最小程度上的核酸損失。對于多種應用，例如可能期待進一步地純化樣品(如質粒DNA)，降低所得的樣品的鹽濃度，將所述樣品濃縮，和/或將緩沖液換為更適宜的緩沖液用于隨后應用。對于治療上的應用，如在基因療法中的應用，可以期待將得自切向流過濾或者其他步驟的核酸進一步地純化。可以進行一次或者多次(開始或最后)的過濾、超過濾或者滲濾，從而通常地獲得該結果(或者多種結果)。如果期待，可以將更小的MWCO超過濾膜用于隨后的或者最終的滲濾步驟，而不是此前用于開始的純化，由于核酸典型地在稍后的階段是高度純化的，以及主要地小的溶解質分子通過膜進入濾液中。對于多種質粒DNA中，例如，可以使用10，000 到100，000MWC0或者更大的膜。具有約100，000MWC0的膜的空纖維設備是常用的，尤其當處理濃縮的核酸溶液時，這是由于更小的滯留容量，增加的流量，更高的產量以及更短的處理時間。根據本領域已知的標準技術，標準的，商業上可得的過濾及滲濾材料適用于此方法中。細微顆粒尺寸的污染物從流體中的過濾已經通過使用不同的多孔濾器介質完成， 污染的組合物通過所述介質，從而濾器留下污染物。污染物的滯留可以通過機械過濾或者電動的顆粒捕獲及吸附發生。在機械過濾中，顆粒當其試圖通過小于其的孔時，被物理捕獲而截留。在電動的捕獲機制中，所述顆粒與多孔濾器中的表面碰撞，并通過短程吸引力留在表面上。為了實現電動捕獲，可以使用電荷修飾的系統以改變濾器的表面電荷特征(參見例如WO 90/11814)。例如，要去除的污染物為陰離子的時，可以使用陽離子的電荷改性劑來改變濾器的電荷特征，從而使得污染物被濾器截留。在特定的實施方案中，在過濾之前或者之后，樣品使用含有兩性離子去污劑的含水溶液進行處理。適用的兩性離子劑包括例如EMPIGEN BB (正十二烷基-N，N- 二甲基甘氨酸)，ZWITTERGENT 3-08，ZffITTERGENT 3-10，ZffITTERGENT 3-12, ZffITTERGENT
3-14，ZffITTERGENT 3-16，CHAPS, CHAPSO 以及其他。在一個優選的實施方案中，所述樣品使用切向流過濾進行過濾。用于切向流過濾的原理、理論以及設備描述于Michaels，S. L.等人的，〃 Tangential Flow Filtration" in Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, W. P. Olson, ed.，Interpharm Press, Inc.，Buffalo Grove, 111. (1995).為了將樣品通過切向流過濾進行過濾及濃縮，例如，通常選擇膜，所述膜具有的分子量截留值(MWCO)基本上低于要保留的分子的分子量。一般的規律是選擇的膜具有比要保留的分子的分子量低3 到6倍的分子量截留值。裝載所述膜，將切向流過濾系統初始化(通常地使用水沖洗并測試水過濾的流速及完整性)，將樣品加入，建立切向流，設置進料及保留壓強，并收集濾液。 當達到期待的濃度或者體積時，停止該過程并回收樣品。一個優選的過濾方法為使用超過濾膜的滲濾，所述膜具有30，000到500，000MWC0 的分子量截留值，這取決于質粒的尺寸。該滲濾步驟使得在濃縮之前可以進行緩沖液交換。 如前所述地，典型地使用切向流過濾將洗脫液濃縮3到4倍至目標濃度，其中使用例如30kD 的膜截留值，該濃度通過滲濾在恒定的體積下進行緩沖液交換，并調節到到目標質粒濃度。 所得的質粒DNA溶液可以隨后進一步過濾，例如，通過0. 2 μ m濾器，并典型地分為幾個等份，其儲存于相對冷的溫度(如 0°C )下的容器中，直至進行進一步的處理。附加地或者可選地，所述濾器可以為結合核酸的，同時允許內毒素及其他的污染物通過所述濾器。一旦不想要的材料通過所述濾器，可以將核酸從濾器上洗脫并收集。適用的尺寸排阻濾器可得自多個商業來源，其包括例如Ambion (Austin，TX)，GE Healthcare(Piscataway, NJ), Gelman (Ann Arbor, Mich. ), Pall-Filtron (East Hills, N. Y. ), Roche (Basel, Switzerland), Sartorius (Edgewood,N. Y.),以及 Thermo Scientific Pierce (Rockford，IL)。所使用的濾器是這樣的一種其結合內毒素及其他污染物而允許核酸通過。已經發現了 I^all Ultipor ‘ N66, 濾器去除幾乎全部內毒素而核酸產率高。在一次或者更多次本文描述的層析或者過濾步驟之前，含有核酸的裂解液溶液或者裂解液衍生物也可以預先過濾(如使用0. 45 μ m濾器)。根據前述的規程純化的DNA要與脂質載體復合以用于基因療法時，例如，將DNA交換進入低電導率的緩沖液中可能是期待的，其優選地通過滲濾進行。低電導率的緩沖液意味著包括低于IOmS的任意緩沖液，其優選地低于約lmS。除了前文所述的過濾技術外，也可以采用常規的過濾方法(也即尺寸排阻層析材料)。參見，例如 Gel Filtration Principles and Methods，Edition Al，Amersham Biosciences，2002。本文描述的多肽可以額外地或者可選地用于多種工業上的過程中，所述過程要求或者受益于莢膜異多糖酸或者其他多糖的消化。一般而言，這可能涉及處理機器、產品和/ 或洗脫管線及產品、中間產物或者帶有本文描述的多肽的流出物，從而例如去除或者防止這些工業過程中導致的腐蝕，污垢或者其他的累積。一個特別的實例是生物膜的去除或者預防(例如，那些含有細菌如革蘭氏陰性細菌的)，所述生物膜可能在過程中或者隨著時間形成；生物膜及類似的材料可以使通道及導管變窄或者堵塞，或者增加機器部件或者系統的磨損。可以從本文描述的多肽使用中受益的代表性工業上的過程包括，例如，紙及纖維素制造過程，膜重建以及清潔，循環，水-水處理(如需氧固體及泥渣的消化)，石油化學精制及廢物修復，高純度的水過濾及系統，水冷卻系統/熱交換器，以及食物處理。對于紙或者纖維素處理操作，例如，生物膜可能在中間產物處理液流中形成，其可能不利地影響下游處理和/或影響最終產品的質量。本文描述的多肽可以通過去除、最小化或者預防此類生物膜使該過程受益。多月太如前文所記載地，本發明涉及能夠降解莢膜異多糖酸的多肽，所述莢膜異多糖酸可在如生物材料中發現。這可以包括如得自細菌的生物膜或者細菌核酸制備物，所述細菌如大腸桿菌，沙門氏菌或者其他的腸細菌，所述制備物如得自大腸桿菌的質粒DNA。本文描述的多肽也有益地使得高純革蘭氏陰性細菌質粒DNA制備物的制備成為可能。在特定的實施方案中，所述多肽包括大致地對應于SEQ ID NO 1及其保守的氨基酸替換的氨基酸序列。該多肽通常地對應于全長的莢膜異多糖酸降解多肽，所述多肽具有約84，3M道爾頓的分子量。一般而言，所述多肽為分離的多肽。在特定的實施方案中，所述多肽分離自細菌來源的生物體，并經過純化。典型地，多肽具有至少70%的純度，該純度更優選地為至少80 %，更優選地為至少90 %，更優選地為至少95 %，更優選地為至少98 %， 更優選地為至少99%。
本文提供多肽片段。該片段例如當與全長蛋白比較時，可以是在N-端或者C-端截斷的，或者可以缺少內部殘基。例如，特定片段缺少對于多肽所期待的活性(例如生物的或其他)并非必需的氨基酸殘基。在一個特定的實施方案中，所述多肽包含大致地對應于 SEQ ID NO :2及其保守氨基酸替換的氨基酸序列。該多肽大致地對應于全長多肽的截短的形式，其中缺少全長多肽(SEQ ID NO 1)的開頭的106個氨基酸。除了本文描述的全長的及截短的多肽，還考慮了可以制備多肽變體，例如通過向多肽DNA中引入合適的核苷酸變化，和/或通過期待的多肽的合成，或者通過分離和純化具有莢膜異多糖酸降解活性的變體多肽。本領域技術人員應意識到氨基酸的變化可能改變該多肽特定的翻譯后加工，如改變糖基化位點的數量或位置或者改變膜錨定的性質。本文描述的多肽全長和/或截短序列中的或者在各種結構域中的變化可以使用例如任意的技術和準則制造，所述技術及準則用于保守的和非保守的突變，其于文獻中列出(例如美國專利No. 5，364，934(以其全文在此結合作為參考))。變化可以為替換，刪除或者插入一個或多個用于編碼多肽的密碼子，與天然序列多肽相比，其導致多肽氨基酸序列的變化。可選地，所述變化通過將一個或者多個功能域中至少一個氨基酸替換為任意其他的氨基酸。確定哪個氨基酸殘基可以插入、替換或者刪除而不會不利地影響期待的活性的指導能通過比較同源蛋白分子的序列與所述多肽的序列，并最小化高同源性的區域內氨基酸序列變化的數量來建立。氨基酸替換可以通過將一個氨基酸用另一個具有類似結構和 /或化學性質的氨基酸替換來實現，例如將亮氨酸替換成絲氨酸，即保守的氨基酸替代。插入或者刪除可以可選地在約1到5個氨基酸的范圍，5到10個氨基酸的范圍，10到25個氨基酸的范圍，25到50個氨基酸的范圍，或者更多，如100個氨基酸或者更多。所允許的變化可以通過以下確定系統地在序列中產生氨基酸的插入、刪除或者替換，然后通過全長的或者成熟的天然序列測試所得到的變體所體現的活性。如前文所記載的，多肽可以為本文描述的全長的或者截短的多肽的變體。通常， 多肽變體與本文公開的全長多肽序列(如SEQ ID NO 1)具有至少約80%的氨基酸序列同一性，可選地至少約81%的氨基酸序列同一性，可選地至少約82%的氨基酸序列同一性， 可選地至少約83%的氨基酸序列同一性，可選地至少約84%的氨基酸序列同一性，可選地至少約85%的氨基酸序列同一性，可選地至少約86%的氨基酸序列同一性，可選地至少約 87%的氨基酸序列同一性，可選地至少約88%的氨基酸序列同一性，可選地至少約89%的氨基酸序列同一性，可選地至少約90%的氨基酸序列同一性，可選地至少約91%的氨基酸序列同一性，可選地至少約92%的氨基酸序列同一性，可選地至少約93%的氨基酸序列同一性，可選地至少約94%的氨基酸序列同一性，可選地至少約95%的氨基酸序列同一性， 可選地至少約96%的氨基酸序列同一性，可選地至少約97%的氨基酸序列同一性，可選地至少約98%的氨基酸序列同一性，以及可選地至少約99%的氨基酸序列同一性。對于截短的多肽變體而言，所述多肽變體與本文公開的截短的多肽序列(如SEQ ID NO 2)具有至少約80%的氨基酸序列同一性，可選地至少約81%的氨基酸序列同一性， 可選地至少約82%的氨基酸序列同一性，可選地至少約83%的氨基酸序列同一性，可選地至少約84%的氨基酸序列同一性，可選地至少約85%的氨基酸序列同一性，可選地至少約 86%的氨基酸序列同一性，可選地至少約87%的氨基酸序列同一性，可選地至少約88%的氨基酸序列同一性，可選地至少約89%的氨基酸序列同一性，可選地至少約90%的氨基酸序列同一性，可選地至少約91 %的氨基酸序列同一性，可選地至少約92 %的氨基酸序列同一性，可選地至少約93%的氨基酸序列同一性，可選地至少約94%的氨基酸序列同一性， 可選地至少約95%的氨基酸序列同一性，可選地至少約96%的氨基酸序列同一性，可選地至少約97%的氨基酸序列同一性，可選地至少約98%的氨基酸序列同一性，以及可選地至少約99%的氨基酸序列同一性。在一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO 1及其保守的氨基酸替換具有至少約90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO :1及其保守的氨基酸替換具有至少約95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO :1及其保守的氨基酸替換具有至少約98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID N0:1及其保守的氨基酸替換具有至少99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸替換具有至少約90%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO :2及其保守的氨基酸替換具有至少約95%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID NO :2及其保守的氨基酸替換具有至少約98%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽包含與SEQ ID N0:2及其保守的氨基酸替換具有至少約99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在特定的實施方案中，示例性的目標保守替換列于表1中。如果該替換導致了生物活性的變化，或者期待的活性的變化，可以引入更多其它的變化，如描述于下文作為氨基酸類別參考的，并對產品進行篩選。不言而喻的，能夠編碼該保守替換的密碼子在本領域內已知的。表權利要求
1.一種革蘭氏陰性細菌質粒組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA以及少于約 0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。
2.權利要求1的組合物，其中，所述組合物包含少于約0.05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸。
3.權利要求1或2的組合物，其中，所述組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸。
4.權利要求1的組合物，其中，通過二喹啉甲酸(BCA)測試測量，所述組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸。
5.權利要求1-4中任一項的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。
6.權利要求1-5中任一項的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。
7.權利要求1-5中任一項的組合物，其中，所述組合物不包含可檢測的糖醛酸。
8.權利要求1-5中任一項的組合物，其中，通過糖醛酸測試測量，所述組合物不包含可檢測的糖醛酸。
9.權利要求1-8中任一項的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。
10.權利要求1-9中任一項的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。
11.權利要求1-9中任一項的組合物，其中，所述組合物不包含可檢測的巖藻糖。
12.權利要求1-9中任一項的組合物，其中，通過巖藻糖測試測量，所述組合物不包含可檢測的巖藻糖。
13.權利要求1-12任一項的組合物，其中，所述組合物不包含當與多糖選擇性標記試劑組合時可視覺檢測的多糖。
14.權利要求13的組合物，其中，所述多糖選擇性標記試劑為(4，6_二氯三嗪基)-氨基熒光素(DTAF)。
15.一種革蘭氏陰性細菌質粒組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA、少于約0. Img 每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸以及少于約0. Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。
16.權利要求15的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.Img每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。
17.權利要求16的組合物，其中，所述組合物不包含可檢測的莢膜異多糖酸、糖醛酸及巖藻糖。
18.一種革蘭氏陰性細菌質粒組合物，其包含革蘭氏陰性細菌質粒DNA、少于約0. 05mg 每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的莢膜異多糖酸以及少于約0. 05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的巖藻糖。
19.權利要求15的組合物，其中，所述組合物進一步包含少于約0.05mg每毫克革蘭氏陰性細菌質粒DNA的糖醛酸。
20.權利要求19的組合物，其中，所述組合物進一步不包含可檢測的莢膜異多糖酸、巖藻糖、糖醛酸、染色體DNA或基因組DNA、RNA、蛋白質和/或內毒素污染物。
21.一種用于純化質粒DNA的方法，所述方法包括使用多肽處理含有質粒DNA的含水組合物以消化莢膜異多糖酸，然后將質粒DNA從經處理的含水組合物中分離。
22.權利要求21的方法，其中，所述含水組合物選自粗細菌裂解液、部分純化的細菌裂解液以及含有提取的細菌核酸的含水溶液。
23.權利要求21的方法，其中，所述含水組合物為粗細菌裂解液。
24.權利要求21的方法，其中，所述含水組合物為部分純化的細菌裂解液。
25.權利要求21的方法，其中，所述含水組合物為含有提取的細菌核酸的含水溶液。
26.權利要求21-25中任一項的方法，其中，所述分離包括將所述經處理的含水組合物與層析材料組合。
27.權利要求沈的方法，其中，所述層析材料選自陰離子交換層析樹脂、陽離子交換層析樹脂、疏水相互作用層析樹脂及親和層析樹脂。
28.權利要求沈的方法，其中，所述分離包括將所述經處理的含水組合物與親和層析樹脂組合，隨后將經處理的含水組合物與疏水相互作用層析樹脂組合。
29.權利要求21-29中任一項的方法，其中，在使用多肽處理之前預處理所述含水組合物以從含水組合物中部分去除內毒素，所述預處理包括將所述含水組合物與層析材料組
30.權利要求觀的方法，其中，所述親和層析樹脂包括基于硼酸的或者含有硼酸鹽的化合物。
31.權利要求四的方法，其中，所述層析材料為陰離子交換樹脂。
32.權利要求31的方法，其中，所述陰離子交換樹脂包括季銨樹脂。
33.權利要求21-33中任一項的方法，其進一步包括過濾所述含水組合物以進一步從質粒DNA中分離內毒素。
34.權利要求33的方法，其中，所述過濾在從層析材料洗脫經處理的含水組合物之后進行。
35.權利要求21-34中任一項的方法，其中，所述多肽為重組多肽。
36.權利要求21的方法，其中，在使用多肽處理之前預處理所述含水組合物以從含水組合物中部分去除內毒素，所述預處理包括將所述含水組合物與層析材料組合；在使用多肽處理后與親和層析樹脂組合，隨后與疏水相互作用層析樹脂組合；以及在將質粒DNA從所述疏水相互作用層析樹脂上洗脫后，過濾以進一步從質粒DNA中分離內毒素。
37.權利要求21-36中任一項所述的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
38.權利要求21-36中任一項所述的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。
39.權利要求21-36中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :1。
40.權利要求21-36中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :2。
41.權利要求1的方法，其中，所述質粒DNA為革蘭氏陰性細菌質粒DNA。
42.一種用于純化質粒DNA的方法，所述方法包括(a)通過將含水組合物與陰離子交換樹脂組合預處理含有質粒DNA的含水組合物；(b)使用多肽處理所述經預處理的含水組合物以消化莢膜異多糖酸；(c)將所述質粒DNA從經處理的含水組合物中分離，該分離包括將經處理的含水組合物與親和層析樹脂組合，隨后將經處理的含水組合物與疏水相互作用層析樹脂組合；以及(d)過濾所述質粒DNA。
43.權利要求42的方法，其中，所述陰離子交換樹脂包括季銨樹脂。
44.權利要求42或43的方法，其中，所述親和層析樹脂包括基于硼酸的或者含有硼酸鹽的化合物。
45.權利要求42-44中任一項所述的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
46.權利要求42-44中任一項所述的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。
47.權利要求42-44中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :1。
48.權利要求42-44中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :2。
49.權利要求42-48中任一項的方法，其中，所述質粒DNA為革蘭氏陰性細菌質粒DNA。
50.權利要求42-48中任一項的方法，其中，所述多肽為重組多肽。
51.一種多肽，其包含與SEQ ID NO :1及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
52.權利要求51的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO 1及其保守的氨基酸取代具有至少95%同源性。
53.權利要求51的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO :1及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性。
54.權利要求51的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO 1及其保守的氨基酸取代具有至少99%同源性。
55.權利要求51巧4中任一項的多肽，其中，所述氨基酸序列為SEQID NO :1。
56.一種多肽，其包含與SEQ ID NO :2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
57.權利要求56的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO :2及其保守的氨基酸取代具有至少95%同源性。
58.權利要求56的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO :2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性。
59.權利要求56的多肽，其中，所述氨基酸序列與SEQID NO :2及其保守的氨基酸取代具有至少99%同源性。
60.權利要求56-59中任一項的多肽，其中，所述氨基酸序列為SEQID NO :2。
61.權利要求51-60中任一項的多肽，其中，所述多肽為純化的多肽。
62.權利要求51-61中任一項的多肽，其中，所述多肽為重組的多肽。
63.一種分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO :7或其互補序列具有至少90%序列同一性的核酸序列。
64.權利要求63的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :7或其互補序列具有至少95%序列同一性。
65.權利要求63的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :7或其互補序列具有至少98%序列同一性。
66.權利要求63的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :7或其互補序列具有至少99%序列同一性。
67.權利要求63-66中任一項的多核苷酸，其中，所述核酸序列為SEQID NO :7。
68.一種分離的多核苷酸，其包含與SEQ ID NO :8或其互補序列具有至少90%序列同一性的核酸序列。
69.權利要求68的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :8或其互補序列具有至少95%序列同一性。
70.權利要求68的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :8或其互補序列具有至少98%序列同一性。
71.權利要求68的多核苷酸，其中，所述核酸序列與SEQID NO :8或其互補序列具有至少99%序列同一性。
72.權利要求68-71中任一項的多核苷酸，其中，所述核酸序列為SEQID NO :8。
73.—種載體，其包含權利要求63的多核苷酸，其中，所述載體選自質粒、病毒及噬菌體。
74.權利要求73的載體，其中，所述載體為質粒或者噬菌體。
75.權利要求73的載體，其中，所述載體為噬菌體。
76.權利要求73的載體，其中，所述核酸序列與SEQID NO :7或其互補序列具有至少 99%序列同一性。
77.權利要求73-76中任一項的載體，其中，所述核酸序列為SEQID NO :7。
78.—種載體，其包含權利要求68的多核苷酸，其中，所述載體選自質粒、病毒及噬菌體。
79.權利要求78的載體，其中，所述載體為質粒或者噬菌體。
80.權利要求78的載體，其中，所述載體為噬菌體。
81.權利要求78的載體，其中，所述核酸序列與SEQID NO :8或其互補序列具有至少 99%序列同一性。
82.權利要求78-81中任一項的載體，其中，所述核酸序列為SEQID NO :8。
83.權利要求73任一項的載體，其中，所述載體為重組表達載體。
84.權利要求78任一項的載體，其中，所述載體為重組表達載體。
85.一種用于消化生物材料中的莢膜異多糖酸的方法，所述方法包括使所述生物材料與能夠消化莢膜異多糖酸的多肽接觸。
86.權利要求85的方法，其中，所述生物材料為細菌粘液。
87.權利要求85的方法，其中，所述生物材料選自粗細菌裂解液、部分純化的細菌裂解液以及含有提取的細菌核酸的含水溶液。
88.權利要求85的方法，其中，所述生物材料為粗細菌裂解液。
89.權利要求85的方法，其中，所述生物材料為部分純化的細菌裂解液。
90.權利要求85的方法，其中，所述生物材料為含有提取的細菌核酸的含水溶液。
91.權利要求85-90中任一項的方法，其中，所述多肽為重組多肽。
92.權利要求86的方法，其中，所述莢膜異多糖酸存在于細菌的細胞膜中。
93.權利要求85的方法，其中，所述生物材料為生物膜。
94.權利要求85-93中任一項的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
95.權利要求85-93中任一項的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO :1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。
96.權利要求85-93中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :1。
97.權利要求85-93中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :2。
98.一種用于從含有細菌大分子的含水組合物中去除內毒素的方法，所述方法包括消化所述含水組合物中的莢膜異多糖酸，隨后將所述含水組合物與層析材料組合，以從細菌大分子中分離內毒素。
99.權利要求98的方法，其中，所述含水組合物得自細菌裂解液。
100.權利要求99的方法，其中，在使用多肽處理之前預處理所述細菌裂解液，以從所述裂解液中部分去除內毒素。
101.權利要求100的方法，其中，所述預處理包括使所述細菌裂解液與層析材料組合。
102.權利要求98-101中任一項的方法，其中，所述細菌大分子包括質粒DNA。
103.權利要求102的方法，其中，所述質粒DNA為革蘭氏陰性細菌質粒DNA。
104.權利要求98-104中任一項的方法，其中，通過使用具有莢膜異多糖酸降解活性的多肽處理所述含水組合物來消化莢膜異多糖酸。
105.權利要求98-104中任一項的方法，其中，所述層析材料選自陰離子交換層析樹脂、陽離子交換層析樹脂、疏水相互作用層析樹脂及親和層析樹脂。
106.權利要求101的方法，其中，所述層析材料為陰離子交換樹脂。
107.權利要求106的方法，其中，所述陰離子交換樹脂包括季銨樹脂。
108.權利要求105的方法，其中，所述親和層析樹脂包括基于硼酸或者硼酸鹽的樹脂。
109.權利要求98-108中任一項的方法，其進一步包括在從層析材料上洗脫所述生物大分子后過濾所述含水組合物，以進一步從生物大分子中分離內毒素。
110.權利要求98的方法，其中，所述含水組合物首先與親和層析樹脂組合，隨后與疏水相互作用層析樹脂組合。
111.權利要求110的方法，其中，所述親和層析樹脂包括基于硼酸或者硼酸鹽的樹脂。
112.權利要求98-111中任一項的方法，其中，所述多肽為重組多肽。
113.權利要求98-112中任一項的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO 1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少90%同源性的氨基酸序列。
114.權利要求98-112中任一項的方法，其中，所述多肽包含與SEQID NO 1或者SEQ ID NO 2及其保守的氨基酸取代具有至少98%同源性的氨基酸序列。
115.權利要求98-112中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :1。
116.權利要求98-112中任一項的方法，其中，所述多肽為SEQID NO :2。
全文摘要
本發明通常涉及高純質粒組合物及其制備方法，所述高純質粒組合物具有低的或者不可檢測水平的莢膜異多糖酸及其他污染物。也描述了在該方法中有用的多肽。本文描述的方法及組合物具有一系列的用途，包括在生物恐怖主義、環境科學、食品科學、法醫學、分子生物學以及健康和醫學領域內的各種應用。
文檔編號C12N15/63GK102171341SQ200980125536
公開日2011年8月31日 申請日期2009年4月30日 優先權日2008年4月30日
發明者N·S·坦普爾頓 申請人:格蘭達利斯有限公司