專利名稱：Nmb0928蛋白及其在藥物制劑中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學領域，特別是涉及開發預防性或治療性應用的新的疫苗制劑，所述新的疫苗制劑可提高抗來自不同來源的疾病的疫苗抗原的免疫應答的質量。
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，其唯一已知的宿主是人的革蘭氏陰性雙球菌，是流行性腦脊髓膜炎(meningococcameningitis)病原體(causal agent)。通常該細菌發現于正常人群中的一些無癥狀攜帶者中，因為該生態位是其微生物分離的最常見來源。
在世界范圍內，小于兩歲的兒童是對感染性流行性腦脊髓膜炎比較易感的群體，但青少年和正常成人群體也可受到感染。
對大多數受感染的個體，未治療的腦膜炎球菌病具有致命的發展過程，而接種疫苗可通過早在細菌定居期阻止事件發生來預防該病癥。
為了在普通人群中誘導對該疾病的防護，已發展了數個策略來獲得能夠滿足所需要求的疫苗。為了該目的，已考慮使用莢膜抗原，因為其免疫學特異性可分類成該微生物的血清群。這些血清群中的五個群已被確定為導致了全球范圍內的大部分腦膜炎球菌病的臨床病例。在亞撒哈拉非洲(sub-Saharan Africa)，血清群A是流行病的主要原因。在大多數情況下，在發達國家，血清群B和C與發病相關聯。血清群Y和W135在大多數疾病的復發病例中較為普遍，并且其在美國的一些地區較為流行，在過去數年中有顯著增長。從該數據可看到將莢膜多糖作為疫苗候選物使用、研究和測定的原因是很顯然的。基于莢膜多糖的提供抗血清群A、C、Y和W-135的保護作用的四價疫苗在美國已獲許可。接種后引發的抗體是血清群特異的(Rosenstein N.等人2001.Menningococcal disease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。
血清群B，與其它血清群不同，一直是地方性和流行性腦膜炎球菌病的重要原因，并且這主要是由于完全缺少有效的針對其的疫苗。已注意到B莢膜多糖的免疫原性較差，而且對于基于該化合物的疫苗存在理論上的風險，即因為其結構與存在于人神經系統胎兒結構中寡糖鏈相似，從而誘導免疫耐受性和自身免疫(Finne J.等人1987.AnIgG monoclonal antibody to group B meningococci cross-reactswith developmentally regulated polysialic acid units ofglycoproteins in neural and extraneural tisues.J.Immunol，1384402-4407)。因此，抗血清群B的疫苗的開發集中在亞莢膜抗原的使用上。
外膜蛋白和泡囊(vesicle)疫苗在70年代，產生基于外膜蛋白的疫苗的最初償試是基于通過去污劑排除外膜蛋白制劑中的LPS(Frasch CE和Robbins JD.1978.Protection against group B meningococcal disease.III.Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity ofprotection in a guinea pig model.J Exp Med 147(3)629-44)。然后沉淀外膜蛋白(OMP)以產生懸浮在氯化鈉中的聚集體。盡管在動物中產生了很有前景的結果，但這些疫苗在成人或青少年中都不誘導殺菌性抗體(Zollinger WD，等人1978.Safety and immunogenicityof a Neisseria menningitidis type 2 protein vaccine in animalsand humans.J.Infect.Dis.137(6)728-39)，這些疫苗的欠佳表現主要歸因于伴隨沉淀作用而產生的三級結構的喪失。因此，下一個合理的步驟是制備外膜泡囊形式的具有其天然構象的蛋白的疫苗(Zollinger WD，等人1979.complex of meningococcal group Bpolysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenicin man.J.Clin.Invest.63(5)836-48，Wang LY和Frasch CE.1984.Development of a Neisseria meningitidis group B serotype 2bprotein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun46(2)408-14136)。
這些外膜泡囊疫苗的免疫原性顯著超過OMP聚集體，而且通過吸附至佐劑氫氧化鋁，免疫原性顯示進一步被加強(Wang LY和FraschCE.1984.Neisseria meningitidis group B serotype 2b proteinvaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)408-14136)。
已使用不同制劑的可溶性外膜泡囊疫苗進行了許多功效試驗。在1980年代為應對在古巴(Sierra GV等人1991.Vaccine againstgroup B Neisseria meningitidisprotection trial and massvaccinationre sults in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)和挪威(Bjune G，等人1991.Effect of outer membrane vesicle vaccineagainst group B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)暴發的疾病分別開發了兩個研究最廣泛深入的疫苗。由古巴Finlay研究院生產的OMV疫苗(商標為VA-MENGOC-BC)制備于具有血清群C多糖的株系B:4:P1.19，15和高分子量OMP的制劑，并且被吸附至氫氧化鋁(Sierra GV等人1991.Vaccine againstgroup B Neisseria meningitidisprotection trial and massvaccination results in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)195-210)。該疫苗為快速減退古巴的流行病作出了貢獻(Rodriguez AP，等人Theepidemioiogical impact of antimeningococcal B vaccination inCuba.1999.Mem Inst Oswaldo Cruz.94(4)433-40)。
由挪威國家公共衛生研究院(NIPH)生產的疫苗類似地最初打算在由來自ET-5克隆(B:15:P1.7，16)的另一種生物導致的高度地方性疾病時期使用。其也是產生自吸附至氫氧化鋁的純化的外膜泡囊的單價疫苗(BjuneG，等人1991.Effect of outer membrane vesiclevaccine against group B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)1093-6)。
外膜泡囊疫苗似乎有效地提供了充分天然構象的外膜蛋白，使得至少在青少年和成人中產生功能性細菌抗體。產生的抗體應答也已顯示增加腦膜炎球菌的調理素性吞噬作用(opsonophagocytosis)。疫苗的精確配制(即OMP含量、LPS含量和佐劑的存在或不存在)對免疫原性具有顯著的影響(Lehmann AK，等人1991.Immunizationagainst serogroup B meningococci.Opsonin response in vaccineesas measured by chemiluminescence.APMIS.99(8)769-72，Gomez JA，等人1998.Effect of a djuvants in the isotypes and bactericidalactivity of antibodies against the transferrin-bindingproteins of Neisseria meningitidis.Vaccine.16(17)1633-9，Steeghs L，等人1999.Immunogenicity of Outer MembraneProteins in a Lipopolysaccharide-Deficient Mutant of NeisseriameningitidisInfluence of Adjuvants on the Immune Response.Infect Immun.67(10)4988-93)。
疾病分離物的抗原性特征譜也在快速地改變，因而如果不改變疫苗組成以反映地方流行病學，只作用有限數目的經選擇的株系的疫苗在數年內可能會變得無效。
目前，OMV疫苗使用范圍超過任何一種其它的血清群B疫苗，并且在由單個PorA型引起的疾病暴發的情況下具有潛在的用途。
在株系間產生交叉反應的免疫原還需要充分確定。來自Finlay研究院和NIPH疫苗試驗的接種后血清的研究顯示抗PorA(P1，1類血清亞型蛋白)和OpcA(另一種主要的OMP，以前稱為Opc)二者的抗體(Wedege E，等人1998.Immune Responses against Major OuterMembrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees andControls Who Contracted Meningococcal Disease during theNorwegian Serogroup B Protection Trial.Infect Immun.66(7)3223-31)，在介導血清殺菌活性(具有PorA mosl免疫原性的)上都是非常重要的，這些抗原都顯示明顯的株系與株系之間的差異。
PorA蛋白的重要性和該蛋白中明顯的變異性水平使得更加關注通過單鏈(單價)基于OMV的疫苗提供的保護可能是血清亞型限制性的(即，依賴于PorA型)，所述蛋白在暴發之間和期間在接種后(和病后)主要殺菌活性所針對的表位上進行持續的變異(Jelfs J，等人2000.Sequence Variation in the porA Gene of a Clone of Neisseriameningitidis during Epidemic Spread Clin Diagn Lab Immunol.7(3)390-5)。
為克服該潛在的問題，在荷蘭的RIVM開發了含有來自6個不同流行病原分離物的PorA蛋白的OMV疫苗(Van Der Ley P和PoolmanJT.1992.Construction of a multivalent meningococcal vaccinestrain based on the class 1 outer membrane protein.Infect Immun.60(8)3156-61，Claassen I，等人 1996.Production，characterization and control of a Neisseria meningitidishexavalent class 1 outer membrane protein containing vesiclevaccine.Vaccine.14(10)1001-8)。在該情況下，從兩個已良好表征的H44/76株系的變體提取疫苗泡囊，所述株系已通過基因工程改造表達三個分別的PorA蛋白。
對廣譜抗原的搜尋很明顯，外膜蛋白(OMP)可誘導抗血清群B疾病的功能性免疫應答，但由于外膜蛋白的表面暴露區域的不均勻性導致至今未開發出具有廣譜性保護作用的疫苗。由外膜泡囊(OMV)疫苗誘導的適中的交叉免疫性已推動了對外膜抗原(或抗原群)的搜尋，所述抗原誘導功能性抗體并且存在于所有腦膜炎球菌(meningococcal)株系上。這些抗原，如果其存在于所有株系而與血清群無關，就可能形成真正的廣譜性腦膜炎球菌疫苗的基礎，該疫苗可消除多糖接種后產生的病原株系上的莢膜轉換的潛在問題。
當免疫顯性PorA蛋白的變異性限制其用作廣譜疫苗變得明顯時，對許多其他主要的外膜蛋白的疫苗的潛能進行了考慮，這些蛋白中的數個蛋白處在進一步的開發之中。已被考慮的蛋白包括第5類蛋白(OpcA)、NspA和鐵調節蛋白(TbpA和B、FbpA、FetA)。TbpB和TbpA形成轉鐵蛋白結合復合物的部分。最近的工作顯示TbpA在結合鐵上具有比TbpB更大的功能作用(Pintor M，等人1998.Ahalysis of TbpAand TbpB functionality in defective mutants of Neisseriameningitidis.J Med Microbiol 47(9)757-60)并且是比TbpB更有效的免疫原。
通過新的技術，使用來自不同腦膜炎球菌株系的外膜蛋白制劑組合免疫小鼠，已發現高度保守的小的外膜蛋白(Martin D，等人1997.Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface ProteinConfers Protection against Experimental Infection.J Exp Med185(7)1173-83)。將來自小鼠的B細胞用于產生雜交瘤，然后就抗多個腦膜炎球菌株系的交叉反應性篩選所述雜交瘤。發現一個高度交叉反應性的單克隆抗體結合被稱作NspA的22kDa的外膜蛋白。使用重組NspA蛋白的免疫顯示在小鼠中誘導抗來自血清群A-C株系的交叉反應性殺菌應答。接種疫苗也保護小鼠免受致死的腦膜炎球菌性感染(Martin D，等人1997.Higly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein Confers Protection against ExperimentalInfection.J Exp Med 185(7)1173-83)。在遺傳上多樣性的腦膜炎球菌株系之間的NspA序列的比較表明所述蛋白是高度保守的(97％的同源性)(Cadieux N，等人1999.Bactericidal andCross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directedagainst Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。
使用抗NspA單克隆抗體通過ELISA法在99.2％的來自血清群A-C的受試株系中檢測到NspA的存在(Martin D，等人1997.HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein ConfersProtection against Experimental Infection.J Exp Med 185(7)1173-83)。這些單克隆抗體已顯示抗許多腦膜炎球菌株系的殺菌性并且能夠在小鼠模型中減少腦膜炎球菌菌血癥(Cadieux N，等人1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of a MonoclonalAntibody Directed against Neisseria meningitidis NspA OuterMembrane Protein.Infect Immun 67(9)4955-9)。盡管該數據似乎表明NspA是個能夠跨血清群界限起保護作用的很有前景的疫苗候選物，但來自小鼠的多克隆抗重組NspA血清不和大約35％的病原性血清群B腦膜炎球菌株系的表面結合，盡管在這些生物中存在nspA基因(Moe GR等人1999.Differences in Surface Expression ofNspA among Neisseria meningitidis Group B Strains.Infect Immun67(11)5664-75)。
抗原呈遞和疫苗制劑更早期的工作已顯示抗原呈遞的形式可能是極其重要的。膜結合蛋白上的表位通常依賴于正確的三級結構的維持，而這反過來通常依賴于疏水性的膜結合結構域。已顯示，外膜蛋白的制劑只有當以泡囊形式呈遞時才能在人體中引起免疫性(Zollinger WD，等人1979.complex of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outermembrane protein immunogenic in man.J Clin Invest 63(5)836-48，Zollinger WD，等人1978.Safety and immunogenicity ofa Neisseria meningitidis type 2 protein vaccine in animals andhumans.J Infect Dis 137(6)728-39)。
單個蛋白的疫苗已在本領域內使用了數十年并且通常表現出良好的穩定性。如果為了可使抗原保持膜結合而要求以泡囊的形式進行呈遞，那么可能難以保證穩定性和可重復性。外膜泡囊的免疫原性和反應原性可隨著在純化過程中除去的蛋白和LPS的量的改變而變化。但在OMV疫苗生產中，在泡囊生產上已積累了大量的經驗，當前生產的疫苗要接受全面的質量控制。完全合成的脂質體泡囊的構建可以允許進一步優化和標準化這些疫苗(Christodoulides M，等人1998.Immunization with recombinant class 1 outer-membrane proteinfrom Neisseria meningitidisinfluence of liposomes andadjuvants on antibody avidity，recognition of native proteinand the induction of a bactericidal immune response againstmeningococci.Microbiology 144(Pt11)3027-37)。換句話說，已將外膜蛋白以泡囊或作為純的表達蛋白的形式呈遞，產生的抗體應答適中。目前主要的償試已集中在導致全身性IgG的產生的腦膜炎球菌疫苗的肌內注射。然而，在經鼻上皮侵入宿主的腦膜炎球菌疾病中，分泌性IgA的產生也可能是很重要的。
腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組序列在2000年期間闡明和公開了MC58(血清群B腦膜炎球菌)(Tettelin H，等人2000.complete Genome Sequence of Neisseriameningitidis Serogroup B strain MC58.Science 287 (5459)1809-15172)和Z2491(血清群A菌株)(Parkhill J，等人2000.complete DNA sequence of a serogroup A strain of Neisseriameningitidis Z2491.Nature 404(6777)502-6173)的基因組序列。經注釋的基因序列的可利用性應當對腦膜炎球菌疫苗研究產生極大的影響。雖然MC58基因組測序正在進行中，但Pizza等人開始鑒定經預測為編碼膜結合的、表面暴露的或外運的蛋白的開放閱讀框架。他們鑒定了570個這樣的ORF，通過聚合酶鏈式反應對其進行擴增并將其克隆入大腸桿菌(Escherichia coli)中，使被編碼的蛋白以His標記的融合蛋白或谷胱甘肽S轉移酶融合蛋白表達(Pizza M，等人2000.Identification of Vaccine Candidates Against SerogroupB Meningococcus by Whole-Genome Sequencing.Science 287(5459)1816-20)。61％(350個)的經選擇的OFR被成功地表達，沒有表達的ORF通常是含有超過一個疏水跨膜結構域(可能排除了許多外膜結合蛋白)的ORF。純化重組蛋白并用于接種小鼠。然后通過酶聯免疫吸附(ELISA)測定法和流式細胞術就與多腦膜炎球菌株系的表面結合以及通過使用血清殺菌測定法就抗兩個株系的殺菌活性對免疫血清進行評價。最終基于在所有三個測定中都呈陽性應答的基礎上選擇了7個蛋白以作進一步研究。使用許多這些蛋白和佐劑組合的試驗性疫苗制劑在小鼠中已顯示誘導相當高的抗同源腦膜炎球菌株系(MC58)的殺菌滴度，但沒有一個蛋白誘導的SBA滴度和MC58外膜泡囊疫苗誘導的一樣高(Giuliani MM，等人2000.Proceedings 12th IPNC.p.22)。另一方面，存在一些這樣的證據，即在小鼠中，這些蛋白的組合可比單個蛋白表現出更高的免疫源性(Santini L.等人 2000.Proceedings 12th IPNC.p.25)。在本工作中被排除(可能因為蛋白表達的失敗或其免疫學特性的修飾)的大量開放閱讀框架，也可能具有疫苗潛能和需要作進一步研究。
當理解了單個抗原對腦膜炎奈瑟氏球菌的發病機理的貢獻后，可更有效地選擇疫苗組分。抗原自身可產生有效的疫苗候選物或，可選擇地，可考慮將經減毒的突變體作為疫苗的成分。
在該教導下，使用在幾種病原性微生物中具有高度序列保守性的疫苗候選物可提供對多種其(即這些微生物)可能引起疾病的解決方案，如果這些候選物通過免疫系統的作用誘導便利的應答。
本發明追求的技術目標是開發這樣的疫苗制劑，即其能夠增加和/或拓寬抵抗不同病原體或抵抗廣泛的單個病原體變體的經誘導的免疫應答，這些病原體是癌癥、細菌、病毒或任何其它來源的病原體。
發明描述在本發明的工作目標中，第一次報道將NMB0928蛋白用作具有抗腦膜炎球菌疾病或由奈瑟氏菌屬的成員引起的任何感染的治療性或預防性特性的疫苗制劑的成分。
本發明的新的特點在于以前未報道過的，在制劑中使用具有新的特性的NMB0928蛋白能夠誘導廣譜性保護作用的全身性和粘膜性免疫應答，這是由于該蛋白在不同的腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)分離株中保守的特性導致的。
附圖概述
圖1.用于NMB0928蛋白克隆和表達的克隆載體pM100。pTrip，色氨酸啟動子；N-term P64k，P-64k N-末端片段；T4 Terminator，T4噬菌體轉錄終止子。
圖2.pM100載體中NMB0928基因的核苷酸序列的最終構建體。
圖3.從細胞破碎獲得的級分的SDS-PAGE分析；泳道1，上清液；泳道2，細胞沉淀。
圖4.始于破碎沉淀的NMB0928蛋白的溶解過程的SDS-PAGE分析(A)泳道1，破碎沉淀；泳道2，用含有3M尿素的1×TE緩沖液洗滌后的沉淀；泳道3，由洗滌產生的可溶性級分；(B)泳道1，用含有6M尿素的1×TE緩沖液溶解的上清液；泳道2，溶解沉淀。
圖5.抗重組NMB0928蛋白的抗體(IgG)水平，在經鼻內或腹腔內途徑用相同抗原免疫小鼠后獲得所述抗體。顯示ELISA的結果，結果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。
圖6.存在于腦膜炎奈瑟氏球菌OMV中的NMB0928蛋白的識別，使用來自用所述重組蛋白免疫的小鼠的血清通過Western印跡法來識別箭頭表示對應于經免疫鑒定的NMB0928蛋白的帶。
圖7.在經鼻內途徑用抗原NMB0928重組蛋白免疫的小鼠中，在粘膜水平上抗NMB0928重組蛋白的IgA抗體應答。結果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。(A)唾液中的I gA抗體應答。(B)肺清洗液中的IgA抗體應答。
圖8.使用BLAST程序在NMB0928蛋白(“查詢”)和來自不同血清群的腦膜炎奈瑟氏球菌的基因組中經注釋的序列(“目標”)之間進行同源檢索的結果。
圖9.不同的腦膜炎奈瑟氏球菌株系中NMB0928蛋白的識別，通過抗NMB0928重組抗原產生的血清來識別。在圖中只顯示當經腹膜內途徑使用半純化的蛋白時獲得的結果，然而在其余情況下也觀察到類似的行為。結果表示為使免疫前血清的值加倍的最高稀釋度的倒數。
圖10.在年幼大鼠模型中，在抗腦膜炎球菌感染的被動保護實驗中的血清之間的比較，所述血清是經腹膜內途徑施用通過兩種方法獲得的蛋白免疫產生的。
圖11.NMB0928蛋白和一組非關聯抗原的識別，通過產生的mAb(mAb E45-8-15、2G23-12)來識別。P1，I類蛋白腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.15；P64K，來自腦膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脫氫酶的E3亞基；T.T，破傷風類毒素(tetanus toxoid)；HBsAg，B型肝炎表面抗原。
圖12.NMB0928蛋白的識別，通過來自腦膜炎球菌疾病的存活者的人恢復期血清來識別。使用健康供體的血清作為對照。結果表示為在ELISA型測定法中的吸光度(492nm)。
圖13.來自動物血清的JY1抗肽滴度，所述動物用游離肽(JY1)、重組蛋白(NMB0928)或綴合物JY1-NMB0928來免疫。
實施例實施例1血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌外膜泡囊制劑中的NMB0928蛋白的檢測為了研究存在于血清群B腦膜炎奈瑟氏球菌(株系B:4:P1.19，15)外膜泡囊中的蛋白，按照其他地方描述的方法(Grg A，等人1985.Electrophoresis 6599-604)進行雙相電泳。隨后使用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，U.S.)對膠上提取的蛋白進行酶促消化。通過使用微型柱(Zip Tips，Millipore，MA，U.S.)將消化后產生的肽提取至溶液中。為進行質譜分析用60％乙腈、1％甲酸然后立即使用nanotips(Protana，Denmark)將肽從微柱中洗脫。
在配備有電離源(nanoESI)的具cuadrupole和飛行時間混合質譜儀(QTof-2TM，Manchester，United Kingdom)中進行測量。使用0.02秒的掃描間隔，在0.98秒內在400-2000w/z范圍內獲得質譜測量法的數據。使用MassLynx程序(3.5版本，Micromass)獲取數據和處理數據。
使用ProFound程序(Zhang W和Chait BT.2000.ProFoundanexpert system for protein identification using massspectrometric peptide mapping information.Anal Chem722482-2489.http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)進行基于質譜數據的蛋白質鑒定。考慮到要遇到的可能修飾甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脫酰胺和羧基酰胺甲基化，對SwissProt數據庫(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的基因和衍生的蛋白質序列進行檢索。
使用MASCOT程序(Perkins DN，等人1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence databases usingmass spectrometry data.Electrophoresis 203551-3567.http://www.matrixscience.com/)進行基于質譜的蛋白質鑒定。檢索參數包括半胱氨酸修飾以及氧化和脫酰胺作用。
從結果(從存在于外膜泡囊制劑中的蛋白的鑒定中獲得的結果)的分析，選擇NMB0928蛋白(來自其的一個肽已通過質譜進行了鑒定)就其作為可能的疫苗候選物進行估測。
實施例2NMB0928基因編碼的產物為腦膜炎奈瑟氏球菌的脂蛋白-34的鑒定為鑒定NMB0928蛋白，使用BLAST程序(Altschul SF，等人1990.Basic local alignment search tool.J Mol Biol 215403-410，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI數據庫中進行序列同源性檢索。該方法的結果表明其除了與奈瑟氏菌屬的其他血清群中的相應蛋白同源外，還與幾種微生物中的蛋白同源，所述蛋白包括由1991年鑒定的來自大腸肝菌的nlpB基因編碼的脂蛋白-34。已證明該蛋白被分離成外膜蛋白脂質體(Bouvier J，Pugsley A.P andStragier，P.1991.Agene for new lipoprotein in the dapA-purCinterval of the E.coli chromosome.J Bacteriol173(17)5523-31)。
該蛋白在幾種微生物屬的基因組中的保守性已使其作為直向同源蛋白群包含于NCBI[gnl|CDD|12651，COG3317，NlpB，未表征的脂蛋白(細胞包膜生物發生，外膜)]報道的保守區域中，這表明對所有這些微生物存在共同的系統發生祖先。
使用MBGD數據庫(Uchiyama，I.2003.MBGDmicrobial genomedatabase for comaprative análisis.Nucleic Acids Res.31，58-62.)分析這些基因的相鄰部分，發現了在基因組織上的顯著相似性，從而將NMB0928蛋白鑒定為腦膜炎奈瑟氏球菌的脂蛋白-34(NlpB)。
實施例3編碼來自腦膜炎奈瑟氏球菌的NMB0928蛋白的NMB0928基因在大腸肝菌中的克隆和表達為了克隆和表達NMB0928基因，使用pM-100克隆載體。該載體允許使用不同的限制性酶進行克隆和允許在大腸桿菌中以包函體的形式產生異源蛋白的高表達水平。
pM-100載體(圖1)具有下列元件色氨酸啟動子、編碼來自P64kDa的N端片段(來自腦膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.19，15)的47個氨基酸的穩定性序列的基因區段、噬菌體T4轉錄終止子的序列和賦予對青霉素的抗性的作為選擇標記的基因的序列。
按照編碼NMB 0928蛋白(實施例1)的核苷酸序列設計兩個引物(7740和7741)來擴增來自株系B:4:P1.19，15的基因組DNA的該基因的片段，不具有編碼預計的信號肽的序列。
BgIII77405′GCAGATCTTGGCAGCAAAACCGAAC3′(Seq.ID.No.1)EcoRV77415′ATGGATATCCTCAGCTCGAGATGGAG3′(Seq.ID.No.2)
為預測信號肽，使用SignalP World Wide Web server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0)。
在使用引物7740和7741對NMB0928基因(RandallK，等人1988.Science 42394487-491)進行PCR擴增后，使用BglII和EcoRV限制性酶消化PCR產物，并克隆入之前已被消化的pM-100克隆載體。最終的構建體顯示于圖2，NMB0928蛋白以融合至P64kDa蛋白的Nt-區段的融合蛋白的形式表達。使用ALFexpress II自動測序儀(TermoSequenaseTMCyTM5Dye Terminador Kit，Amersham Biosciences)和分別結合P64穩定子和T4轉錄終止子的序列的寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)對經克隆的NMB0928基因進行測序。此處產生的質粒對其以后的用途稱為pM-242。
為了表達NMB0928基因，通過化學方法使用pM-242質粒(圖2)轉化GC366大腸桿菌株系。在加有1％甘油、1％酪蛋白、0.1mM CaCl2、1mM MgSO4和50ug/mL氨芐青霉素的基本培養基(M9)中進行表達實驗(Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NEW York，USA)。將細菌培養物在37℃和250rpm下溫育12小時。將生長的培養物離心并對細胞沉淀物進行超聲破碎(IKA LABORTECHNIK)。通過SDS-PAGE(Laemmli UK.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly ofthe head of bacteriophage T4.Nature 277680)和考馬斯亮藍R-250染色分析來自沉淀物的級分和上清液。通過凝膠光密度測定法(LKBBromma 2202 Ultrascan laser densitometer；Amersham PharmaciaBiotech，United Kingdom)測量表達百分率。從沉淀部分獲得NMB0928蛋白，約為該部分的總蛋白含量的60％(圖3)。用含有2M尿素的1xTE緩沖液(10mM Tris-羥甲基氨基甲烷、1mM乙二氨四乙酸，pH 8)洗滌沉淀，一些雜質進入上清液中而NMB0928蛋白仍保留在沉淀中(圖4A)。然后，用含有6M尿素的1xTE緩沖液溶解沉淀，涉及的蛋白進入了可溶性部分，該部分對1xTE緩沖液進行透析，產生具有70％純度的最終制劑，如可在圖4B中所看到的。
實施例4在經腹膜內和鼻內途徑用NMB0928蛋白免疫后誘導的免疫應答的評估為評估NMB0928蛋白的免疫原性，設計免疫實驗并在小鼠中進行免疫實驗，其中給藥以兩種不同的方法制備的相同的蛋白。第一方法在于從聚丙烯酰酰胺凝膠上提取條帶(Castellanos L，等人1996.Aprocedure for protein elution from reverse-stainedpolyacrylamide gels applicable at the low picomole levelAnalternative route to the preparation of low a bundance proteinsfor microanalysis.Electroforesis 171564-1572)，第二種方法在實施例3中提及并且產物被稱為半純化的蛋白。
將分成每組8只的4組雌性Balb/C小鼠(8-10周齡)用這些制劑免疫。經鼻內或腹膜內途徑進行三次免疫，兩次免疫間隔15天。用弗氏佐劑乳化經腹膜內施用的蛋白。表1描述了各組的構成表1用于免疫的Balb/C小鼠的組
通過ELISA方法，在第三次接種后采集的血清樣品中確定抗重組蛋白和存在于細菌中的同源蛋白的抗體滴度(IgG)。圖5顯示了各個動物中抗重組蛋白的抗體滴度。在第二次接種后確定抗體水平，盡管其在第三次接種后更高。此外，進行了通過Western印跡法的免疫鑒定，在所述方法中，各蛋白條帶被識別。經腹膜內途徑免疫的組具有顯著高于經鼻內途徑產生的滴度。
由于組內方差的非齊性(non-homogeneity)，為進行結果的統計分析，根據巴特利特檢驗，使用Kruskal-Wallis的方差的非參數分析。使用Dunn的多重比較檢驗比較各處理的平均值。
用重組蛋白免疫后獲得的血清識別存在于CU385株系的外膜蛋白(OMP)制劑中的天然蛋白。這些結果顯示于圖6中。
為分析粘膜應答，對唾液樣品和肺洗滌物進行測定。圖7只顯示經鼻內途徑免疫的組。在接受半純化的蛋白的組內觀察到IgA滴度的增加。
實施例5在不同腦膜炎奈瑟氏球菌株系中編碼NMB0928蛋白的基因的序列的表征。
為分析在奈瑟氏菌屬的病原性種中編碼NMB0928蛋白的基因的序列保守性，使用BLAST程序(Altschul SF，等人1990.Basic localalignment search tool.J Mol Biol 215403-410.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對腦膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B和C)和淋病奈瑟氏球菌的基因組(在NCBI數據庫中注釋為NC003116.1，NC003112.1，NC003221，NC002946 SANGER135720|Contigl)進行檢索。圖8顯示了那些在各個被分析的基因組中產生有效比對的序列的序列比對結果。在血清群A和C中這些序列與獲得的編碼NMB0928蛋白的基因的序列(Seq.ID.No.3)具有98％的同一性，在血清群B中這些基因與編碼NMB0928蛋白的基因序列具有99％的同一性，在淋病奈瑟球菌中這些序列與編碼NMB0928蛋白的基因序列具有96％的同源性。此外，在三個古巴人的分離物中確定了被涉及的基因的序列(Seq.ID.No.5-7)，所述分離物屬于血清群B(B:4:P1.19，15)，并使用ClustalX程序(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)進行序列比對。比對結果顯示在被分析的株系間的NMB0928基因的核苷酸序列上存在極大的保守性。
考慮到前面提到的序列間存在的高度相似性，將NMB0928蛋白用作疫苗候選者將可能產生具有抗腦膜炎球菌疾病的廣譜性保護作用(由于交叉反應的結果)的有效免疫應答。
實施例6通過用NMB0928蛋白免疫Balb/C小鼠誘導的具有廣譜作用的免疫應答的表征為估計使用NMB0928蛋白的免疫是否誘導與其它奈瑟氏球菌屬株系產生廣泛交叉反應的應答，進行ELISA分析。使用7個屬于不同血清型和血清亞型的奈瑟氏球菌屬株系的完整細胞包被聚苯乙烯平板。將該平板用抗NMB0928蛋白的、混合的血清溫育，如實施例4中所描述的，所述血清通過兩種免疫途徑獲得。
圖9顯示使用經腹膜內途徑施用的半純化蛋白引起的抗該蛋白的血清獲得的結果。如所觀察到的，免疫血清識別存在于不同株系中的蛋白，其水平與在CU385株系中發現的水平相似。在該測定中其他血清具有相似的行為。
實施例7在幼年大鼠模型中，由對于NMB0928蛋白特異性的鼠科動物血清誘導的抗同源和異源株系的保護作用為確定獲得的抗血清的功能性活性，在幼年大鼠模型中對針對腦膜炎球菌感染的保護性進行測定。將24只大鼠(5-6天齡)分組，每組6只大鼠。
確定經腹膜內途徑施用的血清是否保護大鼠免受由一小時后經相同途徑接種的細菌(株系CU385)引起的感染。混合各組血清并稀釋10倍(在無菌PBS中)，然后將其接種幼年大鼠。四小時后，對動物取樣并對其血液中存活的細菌計數。
為解釋結果，進行方差分析(Anova)，接著進行Dunnet’s多重比較檢驗，其中將受試組和陰性對照進行比較。如圖10中所看到的，接受了抗血清的組。
用從古巴患者分離的株系M982和120/90感染幼年大鼠來進行相似的測定，所述株系的血清學分類與株系B385同源。此外，使用來自血清群C的株系233(C:2a:P1.5)和來自血清群B的株系H44/76(B:15:P1.7，16)進行攻擊實驗。在所有情況中，抗血清保護幼年大鼠免受腦膜炎球菌感染。
實施例8能夠介導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的殺菌活性的抗NMB0928蛋白的單克隆抗體的產生為產生特異性抗NMB0928蛋白的單克隆抗體(mAb)和研究介導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源株系的殺菌活性的功能性能力，用純度高于70％的NMB0928蛋白制劑(實施例3)進行免疫方案。在Balb/C(H-2d，雌性，5-6周齡)中進行免疫，如下使用4次免疫在第0、15和30天按常規免疫，對每只小鼠經皮下施用用弗氏佐劑乳化的10μg NMB0928抗原(總體積100μl)；在第50天，經腹膜內途徑對每只小鼠施用10μg在磷酸緩沖鹽水(140mM NaCl、270mM KCl、1.5mM KH2PO4、6.5mM Na2HPO4×2H2O、pH 7.2)中的抗原。在第0和第45天進行抽血。
將具有最高滴度(使用NMB0928蛋白作為包被抗原(實施例3)，通過間接ELISA測量的滴度)的來自動物的脾細胞與X63 Ag8 653小鼠骨髓瘤細胞融合。根據標準的方法分離和篩選所得的雜交瘤(Gavilondo JV.1995.Anticuerpos MonoclonalesTeoría yPráctica，Elfos Scientiae，La Habana，Cuba)。
使用5μg/ml的各抗原和相同濃度的各待測mAb，通過間接ELISA法對由雜交瘤分泌的針對NMB0928蛋白的抗體的反應性以及它們的交叉反應性非關聯抗原進行檢測。圖11顯示在該實驗中獲得的結果，總共獲得了2個特異性識別NMB0928蛋白并且既不和對應于P64K的N末端的氨基酸序列反應也不和其他的被測定的非關聯抗原反應的陽性克隆(mAb E45-8-15和2G23-12)。
為確定產生的抗NMB0928蛋白的mAb介導抗腦膜炎奈瑟氏球菌的同源和異源株系的殺菌性應答的能力，進行殺菌性檢測。殺菌性抗體滴度表示為能夠殺死50％或更多細菌的受試抗體的最高稀釋度的倒數，mAb 2G23-12具有高于1∶128的抗同源株系B:4:P1.19，15和高于1∶64的抗異源株系B:15:P1.7，16和C:2a:P1.5的殺菌性滴度。
實施例9抗NMB0928蛋白的鼠科動物免疫應答的靶區域的表征為了在蛋白中鑒定被產生的抗重組抗原的鼠科動物抗血清更經常識別的區域，進行SPOTScan測定法。在纖維素膜上合成成套函蓋蛋白質序列的重疊肽，用以1∶100稀釋的混合血清溫育。通過用綴合抗鼠科動物G免疫球蛋白的堿性磷酸酶進行溫育，接著通過加入含有底物溴氯吲哚磷酸的溶液來檢測抗原-抗體反應。
無論何種用于免疫的制劑，都觀察到蛋白內幾個共同的抗原性區域。然而，在用弗氏佐劑佐化的蛋白免疫的組中，存在更加廣泛的識別模式。
實施例10通過人血清對NMB0928蛋白的識別在該通過ELISA法進行的研究中，使用來自康復期的個體的人血清收集物。用通過制備性電泳獲得的NMB0928蛋白(5μg/ml)包被板。在用3％于含有Tween-20的PBS中的脫脂奶粉封閉板后，在相同的溶液中稀釋(1∶50)血清并在所述板中進行溫育。如已廣泛報道的進行免疫測定。健康供體血清用作陰性對照。此外，將來自用抗乙型肝炎的重組疫苗接種的個體的混合血清用作非關聯對照(數據未顯示)。
圖12顯示在該測定中用5個康復期患者的血清獲得的結果。可以看出人血清識別所述蛋白，這表明在腦膜炎球菌感染期間所述蛋白進行表達并且其具有免疫原性。
實施例11NMB0928蛋白作為肽的載體為證明重組NMB0928蛋白的載體能力，將其綴合至15聚體(15mer)的合成肽，所述肽來源于來自HIV-1、JY1分離株的gp120蛋白的V3區域。通過戊二醛方法進行綴合。以3次免疫的方案將游離的JY1肽、重組NMB0928蛋白和綴合物JY1-NMB0928給藥成年小鼠，其中免疫原用弗式佐劑進行乳化。在第三次免疫后兩周，從經免疫的動物獲取血清樣品，并通過ELISA法分析樣品以確定抗肽抗體滴度。為進行該測定，用游離肽(20μg/ml)包被板并繼續進行免疫測定，如前面所描述的。實驗的結果(圖13)顯示了NMB0928蛋白的載體能力，即在其綴合后能夠顯著地加強抗JY1肽的抗體應答。
序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>NMB0928蛋白及其在藥物制劑中的用途<130>NMB0928<140>CU 2003/0286<141>2003-12-02<150>CU 2003/0286<151>2003-12-02<160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸7740<400>1gcagatcttg gcagcaaaac cgaac25<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸7741<400>2atggatatcc tcagctcgga atggag 26<210>3<211>1197<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)<400>3atgccgtccg aaccgttcgg acggcataac gcaacaaaca ctttaatatc catcacacag 60gatgacacga tgacccatat caaacccgtc attgccgcgc tcgcactcat cgggcttgcc 120gcctgctccg gcagcaaaac cgaacagccc aagctcgact accaaagccg gtcgcaccgc 180ctgatcaaac ttgaagtccc acctgatttg aacaaccccg accaaggcaa cctctaccgc 240ctgcctgccg gttcgggcgc cgtccgcgcc agcgatttgg aaaaacgccg cacacccgcc 300gtccaacagc ctgccgatgc cgaagtattg aaaagcgtca aaggtgtccg cctcgagcgc 360gacggcagcc aacgctggct cgttgtcgac ggcaagtctc ctgccgaaat ctggccgctc 420ctgaaagcct tttggcagga aaacggcttc gacatcaaat ccgaagaacc cgccatcgga 480caaatggaaa ccgagtgggc ggaaaaccgc gccaaaatcc cccaagacag cttgcgccgc 540ctcttcgaca aagtcggctt gggcggcatc tactccaccg gcgagcgcga caaattcatc 600gtccgtatcg aacagggcaa aaacggcgtt tccgacatct tcttcgccca caaagccatg 660
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Glu Gly Lys Ser Leu Ile Val Phe Gly Asp Tyr Gly Arg Asn Trp Arg245 250 255Arg Thr Val Leu Ala Leu Asp Arg Ile Gly Leu Thr Val Val Gly Gln260 265 270Asn Thr Glu Arg His Ala Phe Leu Val Gln Lys Ala Pro Asn Glu Ser275 280 285Asn Ala Val Thr Glu Gln Lys Pro Gly Leu Phe Lys Arg Leu Leu Gly290 295 300Lys Gly Lys Ala Glu Lys Pro Ala Glu Gln Pro Glu Leu Ile Val Tyr305 310 315 320Ala Glu Pro Val Ala Asn Gly Ser Arg Ile Val Leu Leu Asn Lys Asp325 330 335Gly Ser Ala Tyr Ala Gly Lys Asp Ala Ser Ala Leu Leu Gly Lys Leu340 345 350His Ser Glu Leu Arg355<210>5<211>1058<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>5ggcagcaaaa ccgaacagcc caagctcgac taccaaagcc ggtcgcaccg cctgatcaaa 60cttgaagtcc cacctgattt gaacaacccc gaccaaggca acctctaccg cctgcctgcc 120ggttcgggcg ccgtccgcgc cagcaatttg gaaaaacgcc gcacacccac cgtccaacag 180cctgccgatg ccgaagtatt gaaaagcgtc aaaggtgtcc gcctcgagcg cgacggcagc 240caacgctggc tcgttgtcga cggcaagtct cctgccgaaa tctggccgct cctgaaagcc 300ttttggcagg aaaacggctt cgacatcaaa tccgaagaac ccgccatcgg acaaaaggaa 360accgagtggg cggaaaaccg cgccaaaatc ccccaagaca gcttgcgccg cctcttcgac 420aaagtcggct tgggcggcat ctactccacc ggcgagcgcg acaaattcat cgtccgtatc 480gaacagggca aaaacggcgt ttccgacatc ttcttcgccc acaaagccat gaaagaagtg 540tacggcggca aagacaaaga cacgaccgta tggcagccct ccccgtccga tcccaacctc 600gaagccgctt tcctgacgcg ctttatgcaa tatttgggcg ttgacggaca gcaggcggaa 660aacgcatcgg caaaaaaacc tacccttccc gccgccaacg aaatggcgcg tatcgaaagc 720aaaagcctga ttgtctttgg cgactacggc agaaactggc ggcgcaccgt gctcgccctc 780gaccgcatcg ggctgaccgt cgtcggtcaa aacaccgaac gccacgcctt cctggctcaa 840aaagccccga acgaaagcaa tgcagttacc gaacaaaaac ccggcctgtt caaacgcctg 900ctgggcaaag gcaaagcgga gaaacctgcc gaacagccgg aactgattgt ctatgcagaa 960cctgtcgcca acgggtcgcg catcgtcctg ctcaacaaag acggcagcgc atatgccggc 1020aaagacgcat ccgcattatt gggcaaactc cattccga 1058<210>6<211>1058<212>DNA<213>腦膜炎奈瑟氏球菌<400>6ggcagcaaaa ccgaacagcc caagctcgac taccaaagcc ggtcgcaccg cctgatcaaa 60cttgaagtcc cacctgattt gaacaacccc gaccaaggca acctctaccg cctgcctgcc 120
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<223>人工序列描述合成寡核苷酸1573<400>8ttccatggta gataaaagaa tggctttag29<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述合成寡核苷酸6795<400>9aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 2權利要求
1.稱為NMB0928的腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的蛋白，其特征在于其是能夠在受體生物中產生抗感染的保護性應答的抗原和具有示于序列表中Seq.ID.No.4的氨基酸序列，所述感染是由來自奈瑟氏球菌屬的細菌引起的。
2.權利要求1的稱為NMB0928的蛋白，其特征在于其由示于序列表中Seq.ID.No.3的NMB0928基因編碼。
3.權利要求2的NMB0928基因，其特征在于具有示于序列表中Seq.ID.No.3的堿基序列和編碼權利要求1的蛋白。
4.通過重組技術或化學合成獲得的蛋白或肽，其特征在于具有NMB0928蛋白的序列并能夠在受體生物中產生抗感染的保護性應答，所述感染由來自權利要求1的奈瑟氏球菌屬細菌引起。
5.藥物制劑，其特征在于含有權利要求1、2和4的蛋白或肽或根據權利要求1，2和4通過天然方式產生的權利要求1的蛋白。
6.權利要求5的藥物制劑，其特征在于其是能夠在受體生物體中產生抗感染的保護性應答的疫苗，所述感染是由來自奈瑟氏球菌屬的細菌引起的。
7.權利要求5和6的藥物制劑，其特征在于其是能夠在受體生物體中產生抗感染的保護性應答的疫苗，所述感染是由腦膜炎奈瑟氏球菌引起的。
8.權利要求5和6的藥物制劑，其特征在于其是能夠在受體生物體中產生抗感染的保護性應答的疫苗，所述感染是由淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的。
9.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于其是預防性或治療性制劑。
10.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于其是含有一種或幾種不同抗原特征的抗原的組合制劑，所述抗原是通過重組方式、合成方式獲得的或通過天然方式產生的。
11.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于含有多糖抗原。
12.權利要求5、6、7、8和9的藥物制劑，其特征在于制劑成分之一是腦膜炎奈瑟氏球菌的莢膜多糖。
13.權利要求9的藥物制劑，其特征在于含有一種多糖蛋白綴合物，所述多糖部分對應于細菌的多糖。
14.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于含有一種或幾種經滅活的微生物。
15.權利要求5、6、7和8的藥物制劑，其特征在于含有肽抗原。
16.權利要求5和6的藥物制劑，其特征在于含有激素。
17.權利要求5和6的藥物制劑，其特征在于含有生長因子。
18.權利要求5至17的藥物制劑，其特征在于其是經腸胃外途徑給藥的制劑。
19.權利要求5至17的藥物制劑，其特征在于其是經粘膜途徑給藥的制劑。
20.權利要求5至17的藥物制劑，其特征在于其是經口途徑給藥制劑。
21.權利要求5至20的藥物制劑，其特征在于其是免疫刺激劑或免疫強化劑制劑。
22.權利要求5至21的藥物制劑，其特征在于其含有NMB0928抗原的肽或片段。
23.權利要求5至21的藥物制劑，其特征在于其含有NMB0928抗原的模擬表位。
24.經基因修飾的生物，其特征在于含有單獨的或包含于另外的基因序列中的權利要求3的基因或其部分。
25.權利要求24的藥物制劑，其特征在于含有經基因修飾的活的、減毒的生物或其制劑。
26.藥物制劑，其特征在于含有由權利要求24的生物表達的蛋白，并且能夠在受體生物中產生抗感染的保護性應答，所述感染由來自奈瑟氏球菌屬的細菌引起。
27.藥物制劑，其特征在于含有權利要求1、2和4的、作為不同特征抗原的載體的蛋白或肽。
28.藥物組分，其特征在于含有權利要求1和2的NMB0928蛋白或其片段，并且能夠單獨地或在其他組分存在的情況下使得可以在人中檢測腦膜炎球菌病。
29.藥物組分，其特征在于含有權利要求3的基因或其片段，并且能夠單獨地或在其他組分存在的情況下使得可以在人中檢測腦膜炎球菌病。
30.權利要求1和2的NMB0928蛋白或其片段在生物傳感器或其他藥物或生物技術應用中的用途。
31.權利要求3的NMB0928基因或其片段在生物傳感器或其他藥物或生物技術應用中的用途。
全文摘要
本發明涉及新的疫苗抗原的用途，所述新的疫苗抗原用于預防性或治療性抵抗細菌、病毒、癌癥或其它來源的疾病。本發明的技術目的是開發能增加已有疫苗的保護性譜，從而擴展其抵抗不同病原體的制劑。為達到該目的，分離了NMB0928蛋白并鑒定其為能夠誘導殺菌活性的腦膜炎奈瑟氏球菌的外膜制劑的成分。此外，克隆并表達了編碼蛋白NMB0928的基因，純化了所述蛋白和隨后在動物生物模型中評估了其免疫原性。來自同源基因的序列的高度的保守性表明，當其以不同途徑提供時，顯示了其誘導交叉免疫應答的抗原的較高價值。本發明的所得制劑適用于藥物工業，作為供人使用的疫苗制劑。
文檔編號A61K39/095GK1890261SQ200480035879
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月2日 優先權日2003年12月3日
發明者R·帕容費伊特, G·E·古伊倫尼爾托, G·薩蒂納斯加西亞, L·H·貝坦科特紐涅茲, L·R·卡斯特拉諾斯薩拉, Y·佩雷拉尼格林, D·加西亞迪亞茲, O·尼布拉佩雷斯, E·卡巴雷羅米南德斯, S·岡薩雷斯布蘭克 申請人:遺傳工程與生物技術中心