專利名稱：一種香菇多糖注射用凍干粉針劑及其含量測定方法
技術領域：
本發明涉及一種香菇多糖制劑，尤其涉及一種香菇多糖注射用凍干粉針劑及其制備方法。
本發明還涉及所述香菇多糖注射用凍干粉針劑的含量測定方法。
背景技術：
香菇(Lentinus edodes)為擔子菌綱傘形科真菌，味甘性平，健脾祛邪，調和陰陽，食藥兼用。香菇中含有多種有效藥用組分，尤其是香菇多糖(Lentinan)是一類特殊的生理活性物質，具有調節人體生理功能，增強人體免疫機能，預防和治療多種慢性疾病的作用。尤其是，它具有顯著的、獨特的抗腫瘤活性，并能減輕放療和化療的毒性反應。臨床醫學證明香菇多糖安全無毒副作用，其抗腫瘤的藥理作用并非直接殺死致病原，而是表現在增強人體免疫調節作用。它通過刺激免疫細胞成熟、分化和增殖，改善人體機體平衡，達到恢復和提高人體細胞對淋巴因子、激素及其他生理活性因子的反應。
作為藥物的香菇多糖研究始于上世紀50年代，成為免疫促進劑而引起人們興趣則在60年代以后。1968年日本人千原吳郎首先利用熱水從香菇子實體中浸提出6種胞外香菇多糖，其中二種有明顯抗腫瘤作用，測試表明其平均分子量為100萬，是一種帶分支側鏈的β-葡聚糖結構，并定商品名為Lentinan。70年代初，Shida等用三氯醋酸浸提，甲醇等沉淀又從香菇中提取得到三種水溶性多糖，首次報道香菇中除β-葡聚糖以外的另一種抗腫瘤物質，認為除分子量100萬的香菇多糖外，另一種分子量在16000的香菇多糖也具有抗腫瘤活性。80年代以來，香菇多糖的研究更為深入，更為多元化，提取香菇多糖已由子實體發展到從深層發酵香菇菌絲體中提煉，對香菇多糖的研究大量轉向藥理和臨床試驗。研究充分表明香菇多糖具有抗腫瘤作用，尤其對慢性粒細胞白血病、胃癌、鼻咽癌、直腸癌和乳腺癌等有抑制和防止手術后微轉移的效果，此作用是通過增強肌體免疫力而對癌細胞表現出間接毒性，尤其適用于病后肌體康復。與其他抗腫瘤藥物相比，香菇多糖幾乎無任何副作用，是目前已知最強的免疫增強劑之一。除此之外，香菇多糖還是治療各種肝炎，特別是慢性遷移性肝炎的良好藥物。香菇多糖是迄今為止國內唯一一個可以供靜脈注射的大分子多糖凍干粉針劑。
香菇多糖的化學結構曾經利用甲基化分析和Smith降解等方法測定來源于香菇中的β-葡聚糖物質，顯示該多糖的一級結構具有β-D(1→3)連接的吡喃葡聚糖主鏈，在主鏈中葡萄糖的C6位上含有支點(每5個D-葡萄糖有2個支點)，其側鏈是由β-D-(1→6)和β-D-(1→3)鍵相連的D-葡萄糖聚合體組成，在側鏈上也含有少數內部β-D-(1→6)鏈。現已知道水溶性β-葡聚糖為線性結構，無長分支，以β-D-(1→3)鏈為主結構的葡聚糖，其生理活性高于β-D-(1→6)為主的多糖，而β(1→3)和β(1→6)結合的側鏈共存是抗腫瘤作用所必不可少的。
藥理毒理研究情況香菇多糖的抗腫瘤、抗疾病作用是通過提高機體的免疫功能來實現的。香菇多糖對正常機體并無免疫促進作用，但對機體免疫功能下降或感染疾病，患上癌癥后，造成人體免疫系統紊亂患者，能有效調節免疫作用特點在于識別脾及肝臟中抗原的巨噬細胞，促進淋巴細胞活化因子的產生，釋放各種輔助性T細胞因子，誘導或增強宿主腹腔巨噬細胞吞噬作用，恢復或刺激輔助性T細胞的功能，同時促進免疫球蛋白形成的核酸蛋白合成的作用，提高機體的免疫功能。許多學者研究了香菇多糖對臨床癌癥患者免疫狀態的影響，證實香菇多糖與化療合用可提高化療療效，增加淋巴細胞轉化率、NT細胞活性和T4/T8細胞比值。
經用香菇多糖給小鼠靜脈注射時，LD50為1500mg/Kg，小鼠肌肉注射增至最大劑量2250mg/Kg，無法測出LD50，用香菇多糖對狗和Wister大鼠長期毒性試驗，以香菇多糖注射液人用劑量的50倍和100倍分別給予狗和大鼠肌肉注射，每天1次，連續6個月，檢查動物外觀、體重、肝、腎功能、血常規、病理檢查、電鏡觀察等均無明顯影響。甚至狗和大鼠用藥分別增至人用劑量的400倍時也無明顯影響，試驗表明香菇多糖長期應用是相當安全的。
中國專利申請00112407.2公開了抗腫瘤藥物香菇多糖凍干粉針劑的配方及其可工業化的制備方法，配方中省去了使患者可能產生過敏的右旋糖酐，而采用甘露醇作為凍干賦形劑。
由于香菇多糖的化學本質為葡聚糖，因此該藥品的含量測定采用經典的硫酸蒽酮法(國家藥品標準WS1-(X-032)-2004Z)和還原糖測定法(國家藥品標準WS1-(X-152)-2004Z)，但是目前上市的凍干粉針劑一般采用右旋糖酐或甘露醇(中國專利申請00112407.2)作為凍干賦形劑，而上述輔料對多糖測定含量有明顯的干擾，因此國家藥品含量測定方法中均采用對照品法。由于香菇多糖價格昂貴，對照品要求純度較高，目前還沒有對照品上市；并且制劑含量測定是需要在對照品中加入一定量的輔料來排除輔料的干擾，造成測定方法操作繁瑣。
發明內容
針對現有技術存在的上述問題，本發明采用氨基酸和鹽類作為凍干賦形劑，其對多糖含量測定無影響，便于藥品的質量檢查和控制；并且不需要使用昂貴的對照品，降低了生產成本。
因此，本發明的一個目的在于提供一種香菇多糖注射用凍干粉針劑。
本發明的另一個目的在于提供一種香菇多糖注射用凍干粉針劑的制備方法。
本發明的還一個目的在于提供所述香菇多糖注射用凍干粉針劑的含量測定方法。
根據本發明的一方面，本發明提供了一種香菇多糖注射用凍干粉針劑，其包含作為活性成分的香菇多糖和凍干賦形劑，所述凍干賦形劑為選自鹽類和氨基酸中的一種或多種，所述香菇多糖和凍干賦形劑的重量比為0.1～80∶20～99.9。
優選的，所述香菇多糖和凍干賦形劑的重量比為1～10∶50～99。
所述香菇多糖在注射用凍干粉針劑中的含量范圍一般為0.1～10mg，優選0.5～5mg；所述凍干賦形劑在注射用凍干粉針劑中的含量范圍一般為10～100mg。
所述鹽類應為在注射用溶媒中可溶的鹽類。優選的，所述鹽類可為氯化鈉、磷酸鹽或檸檬酸鹽等。
優選的，所述凍干賦形劑為氨基酸，如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸、組氨酸等。
更優選的，所述氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或賴氨酸等。
根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種香菇多糖注射用凍干粉針劑的制備方法，其包括下述步驟1)稱取0.1～80重量份的香菇多糖并用注射用水溶解定容到一定體積，用0.45μm濾膜過濾，用活性炭吸附，用0.22μm濾膜過濾，得a溶液；2)用注射用水溶解20～99.9重量份的凍干賦形劑，得b溶液，所述凍干賦形劑為選自鹽類和氨基酸中的一種或多種；3)將a溶液和b溶液混合均勻，用滅菌注射用水定容到一定體積，分裝入瓶，進行冷凍干燥，封口，制備得到凍干針劑。
優選的，所述凍干賦形劑為氨基酸。
更優選的，所述氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或賴氨酸。
優選的，所述香菇多糖為1～10重量份，所述凍干賦形劑為50～99重量份。
根據本發明的還一方面，本發明還提供了所述香菇多糖凍干粉針劑的含量測定方法，所述方法包括下述步驟1)對照品溶液的制備取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的葡萄糖對照品20mg，精密稱定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；2)供試品溶液的制備取本品約12mg，精密稱定，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次轉移至500ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻；3)標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分別置于具塞試管中，各加水至3.0ml，再分別沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml，以上操作均在冰浴中進行；劇烈振搖混勻后，立即置沸水浴中加熱，自振搖起計時，準確反應6分鐘，將試管移至冰浴中冷卻后，放至室溫；自振搖起，在20分鐘～40分鐘內，以0號管為空白，按照分光光度法，分別在625nm的波長處測定吸收度，以對照品溶液濃度與相應的吸收度計算回歸方程；4)測定法精密量取供試品溶液3ml，照標準曲線的制備項下的方法，自“沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法測定，從回歸方程計算多糖的含量。
本發明提供的香菇多糖制劑方法及含量測定方法有以下優點1、本發明的香菇多糖制劑中輔料對含量測定無干擾；2、含量測定不需要香菇多糖對照品；3、含量測定以葡萄糖為對照品，對照品容易得到；4、含量測定方法為經典方法，測定結果準確可靠，并且該法易于為檢驗人員掌握；5、含量測定操作相對簡單；6、含量測定時，不需要提供輔料來消除干擾。
為了更好地理解本發明的本質，下面通過對本發明較佳實施方式的描述，詳細說明但不限制本發明。
具體實施例方式
本發明所用試驗材料，如無特別說明，均為市售購買產品。
本發明所用香菇多糖可按照文獻工藝(cancer research，No.30，2776～2781，November 1970)制備、提純得到。
香菇多糖注射用凍干粉針劑的制備實施例1制備本發明香菇多糖注射用凍干粉針劑的具體配方和工藝如下1、配方
2、制備工藝(1)配液準備各種配液用品齊全；稱量稱取處方量的香菇多糖(按成品計算)，二人復核；溶藥稱取處方量的香菇多糖并用適量滅菌的注射用水(從滅菌到使用時間間隔不得超過24小時)，置水浴(80℃)中至全部溶解，然后定容到500ml，用0.45μm濾膜過濾，用活性炭吸附，用0.22μm濾膜過濾，得a溶液；用注射用水溶解處方量的凍干賦形劑，得b溶液；將a溶液和b溶液混合均勻，用滅菌注射用水定容到1000ml，調節pH值至7.0左右。
除菌過濾在百級潔凈區，過0.22μm濾膜；起泡點試驗起泡點壓力＞0.35Mpa。
(2)灌裝試車裝好機器、接通電源，檢查各部運轉情況，由低速到高速運行完好后，方可使用；準備裝瓶上塞，將西林瓶送入理瓶盤，將膠塞裝入理塞器內；調裝量按半成品含量測定結果確定裝量，旋轉調量螺母，調到確定的裝量，理想裝量1±0.02ml。
灌裝理盤作順時針旋轉，將瓶子送入理瓶軌道，進入分度齒盤，分度齒盤以每分鐘10～50次間歇速度旋轉，將瓶子撥到灌裝位置，灌裝機構以同步間歇的上下往返運動進行灌裝，灌裝后的西林瓶轉至按塞位，進行按塞。
膠塞由理塞器輸塞軌道將其送到按塞輪處，膠塞在真空吸力下牢靠的跟隨按塞輪作間歇轉位，使塞對準瓶口，按塞推桿將瓶上推，瓶塞按入瓶口內，此時真空自動關閉，塞脫開按塞輪，隨瓶進入輸瓶軌道。
將灌裝半壓塞的藥瓶裝盤，送入凍干機，清場。
從過濾結束到灌裝結束時間間隔應不超過7小時。
(3)冷凍干燥a.預凍擱板溫度控制在-35℃至-40℃，制品溫度達-35℃以下，從視窗可見凍結成冰；b.升華前期緩慢升溫至制品全白(-25℃左右)，同時將系統真空度保持在6～8Pa，然后，升溫速度可稍快至板溫與制品接近；c.二次干燥制品35～30℃，保持4～6小時；d.壓蓋。
香菇多糖凍干粉針劑的兩種硫酸-蒽酮測定法比較實施例2本發明采用的含量測定方法1、對照品溶液的制備取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的葡萄糖對照品20mg，精密稱定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。
2、供試品溶液的制備取本品約12mg，精密稱定，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次轉移至500ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻。
3、標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分別置于具塞試管中，各加水至3.0ml，再分別沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml(以上操作均在冰浴中進行)，劇烈振搖混勻后，立即置沸水浴中加熱，自振搖起計時，準確反應6分鐘，將試管移至冰浴中冷卻后，放至室溫。自振搖起，在20分鐘～40分鐘內，以0號管為空白，按照分光光度法(中國藥典2000年版二部附錄IVB)，分別在625nm的波長處測定吸收度。以對照品溶液濃度與相應的吸收度計算回歸方程。
4、測定法精密量取供試品溶液3ml，照標準曲線的制備項下的方法，自“沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法測定，從回歸方程計算多糖的含量。
實施例3國家藥品標準注射用香菇多糖(WS1-(X-152)-2004Z)含量測定方法1、對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的香菇多糖對照品10mg，置研缽中，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液1ml研磨溶解，用水分次轉移至20ml量瓶中，加甘露醇1.0g，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液3ml至25ml量瓶中，加6mol/L硫酸溶液2.5ml，搖勻，密塞，置水浴中，準確反應40分鐘，取出，放冷，加酚酞指示液1滴，用30％氫氧化鈉溶液調至微紅色，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻。
2、供試品溶液的制備取本品3mg，分別精密加水2.0ml使溶解，合并混勻，精密量取3ml至25ml量瓶中，照對照品溶液的制備方法，自“加6mol/L硫酸溶液2.5ml”起，依法制備。
3、測定法精密量取對照品溶液及供試品溶液各10ml，分別置碘量瓶中，精密加入堿性硫酸銅溶液[取無水碳酸鈉與酒石酸鉀鈉各25g，加水約800ml使溶解，在不斷攪拌下，通過長徑漏斗加入10％硫酸銅溶液75ml至容器底部，再加碳酸氫鈉20g，碘化鉀5g，攪拌使溶解，移至1000ml量瓶中，加碘酸鉀溶液(稱取碘酸鉀35.7g，加水溶解使成1000ml，搖勻)25ml，用水稀釋至刻度，搖勻。放置過夜，備用]5ml，搖勻，將碘瓶置水浴中，準確計時15分鐘，迅速移出碘瓶，立即在流動水中冷卻，沿瓶壁加碘化鉀-草酸鉀溶液(取碘化鉀、草酸鉀各2.5g，加水溶解使成100ml，臨用前新制)2ml(以上操作切勿振搖)，加1mol/L硫酸溶液3ml，加塞，置冷水浴中充分振搖至氧化亞銅沉淀全部溶解，用硫代硫酸鈉滴定液(0.005mol/L)滴定，至近終點時，加淀粉指示劑5滴，繼續滴定至藍色消失。另取水10ml，照上述方法測定，作為空白。按下式計算含量 V0為空白消耗硫代硫酸鈉滴定液毫升數；
VT為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液毫升數；V0為對照品消耗硫代硫酸鈉滴定液毫升數；S為10ml對照品溶液中含對照品量(mg)；0.6為10ml供試品溶液的供試品表示量(mg)。
比較上述二種測定方法，前一種方法需要香菇多糖對照品。本發明提供的制劑方法，所采用的藥用輔料對多糖含量測定無干擾，采用經典的硫酸蒽酮法，以葡萄糖為對照品，測定方法簡便，結果準確。
凍干賦形劑不同的香菇多糖凍干粉針劑的硫酸-蒽酮法測定比較實施例4采用實施例2的含量測定法，測定四種香菇多糖凍干粉針劑的香菇多糖含量，這四種凍干粉針劑所用凍干賦形劑分別為右旋糖酐40、甘露醇、甘氨酸、氯化鈉。結果見表1。由結果可知，采用甘氨酸或氯化鈉作為凍干賦形劑時，實測含量與理論含量相符，表明輔料不干擾香菇多糖的含量測定；而采用右旋糖酐40或甘露醇作為凍干賦形劑時，實測含量與理論含量偏差很大，表明輔料明顯干擾香菇多糖的含量測定。
表1硫酸-蒽酮法測定四種香菇多糖制劑的結果(n＝6)
以上對本發明較佳實施方式的描述并不限制本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求的范圍。
權利要求
1.一種香菇多糖注射用凍干粉針劑，包含香菇多糖和凍干賦形劑，其特征在于，所述凍干賦形劑為選自鹽類和氨基酸中的一種或多種；所述香菇多糖和凍干賦形劑的重量比為0.1～80∶20～99.9。
2.權利要求1所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述香菇多糖和凍干賦形劑的重量比為1～10∶50～99。
3.權利要求1所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述香菇多糖為0.1～10mg。
4.權利要求3所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述香菇多糖為0.5～5mg。
5.權利要求1所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述凍干賦形劑為氨基酸。
6.權利要求6所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或賴氨酸。
7.權利要求1所述的注射用凍干粉針劑，其特征在于，所述鹽類為氯化鈉、磷酸鹽和/或檸檬酸鹽。
8.一種香菇多糖注射用凍干粉針劑的制備方法，包括下述步驟1)稱取0.1～80重量份的香菇多糖并用注射用水溶解定容到一定體積，用0.45μm濾膜過濾，用活性炭吸附，用0.22μm濾膜過濾，得a溶液；2)用注射用水溶解20～99.9重量份的凍干賦形劑，得b溶液，所述凍干賦形劑為選自鹽類和氨基酸中的一種或多種；3)將a溶液和b溶液混合均勻，用滅菌注射用水定容到一定體積，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制備得到凍干針劑。
9.權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述凍干賦形劑為氨基酸。
10.權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述氨基酸為甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和/或賴氨酸。
11.權利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述香菇多糖為1～10重量份，所述凍干賦形劑為50～99重量份。
12.一種權利要求1所述香菇多糖注射用凍干粉針劑的含量測定方法，包括下述步驟1)對照品溶液的制備取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的葡萄糖對照品20mg，精密稱定，置于500ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；2)供試品溶液的制備取本品約12mg，精密稱定，加0.5mol/L氫氧化鈉溶液10ml，研磨，使溶解，加水分次轉移至500ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻；3)標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml，分別置于具塞試管中，各加水至3.0ml，再分別沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml，以上操作均在冰浴中進行；劇烈振搖混勻后，立即置沸水浴中加熱，自振搖起計時，準確反應6分鐘，將試管移至冰浴中冷卻后，放至室溫；自振搖起，在20分鐘～40分鐘內，以0號管為空白，按照分光光度法，分別在625nm的波長處測定吸收度，以對照品溶液濃度與相應的吸收度計算回歸方程；4)測定法精密量取供試品溶液3ml，照標準曲線的制備項下的方法，自“沿管壁緩緩加入0.2％蒽酮硫酸溶液5ml”起，依法測定，從回歸方程計算多糖的含量。
全文摘要
本發明涉及一種香菇多糖注射用凍干粉針劑，其包含作為活性成分的香菇多糖和凍干賦形劑，所述凍干賦形劑為選自鹽類和氨基酸中的一種或多種，所述香菇多糖和凍干賦形劑的重量比為0.1～80∶20～99.9。本發明還涉及制備這種注射用香菇多糖凍干粉針劑的方法。本發明采用氨基酸和鹽類作為凍干賦形劑，其對多糖含量測定無影響，便于藥品的質量檢查和控制；并且不需要使用昂貴的對照品，降低了生產成本。
文檔編號A61P35/00GK1939334SQ200510086530
公開日2007年4月4日 申請日期2005年9月28日 優先權日2005年9月28日
發明者馬骉, 王天燕 申請人:北京賽生藥業有限公司