促濾泡素抑制素突變多肽的制作方法

專利名稱：促濾泡素抑制素突變多肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及促濾泡素抑制素(フオリスタチン，follistatin)突變多肽，與對激活蛋白(アクチビン，activin)的抑制相比，它能選擇性抑制生長/分化因子-8(growth/differentiation factor-8，GDF-8)的活性。
背景技術：
激活蛋白是一種生長/分化因子，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，具有誘導成紅細胞分化、促進垂體分泌促卵泡素(FSH)以及由FSH促進黃體生成、維持神經細胞生存、促進胰島素產生等多種功能。
生長/分化因子-8(GDF-8)，也叫做肌抑素(myostatin)，在發育過程中的及成體的骨骼肌中特異表達，是TGF-β超家族的一成員，屬于激活蛋白亞家族(Nature，(英國)1997，第387卷，第6628號，83-90)。GDF-8具有負向調控肌細胞體積的作用，在GDF-8缺失的小鼠中，肌細胞體積比野生型小鼠增加2～3倍(Nature，(英國)1997，第387卷，第6628號，83-90)。
促濾泡素抑制素與激活蛋白(Science，(美國)1990，第247卷，第4944號，836-838)和GDF-8(Proceedings of the National Academy ofScience of the United States of America，美國，2001，第98卷，第16號，9306-9311)強力結合(對激活蛋白的解離常數是Kd＝540-680pmol/L)，中和它們的活性。此外，提示促濾泡素抑制素體內直接和間接參與調控激活蛋白及GDF-8的各種生理活性的數據日益增多。通過微型滲透泵將促濾泡素抑制素連續施與小鼠，可顯著性減少骨髓和脾臟中成紅細胞前體細胞的數目(Proceedings of the NationalAcademy of Science of the United States of America，美國，1992，第89卷，第5號，1553-1556)，在骨骼肌特異的啟動子的支配下，表達促濾泡素抑制素的轉基因小鼠中，骨骼肌的重量顯著增加(Proceedingsof the National Academy of Science of the United States of America，美國，2001，第98卷，第16號，9306-9311)。
促濾泡素抑制素氨基酸序列分析表明，從N末端開始包括N末端結構域、促濾泡素抑制素結構域I、促濾泡素抑制素結構域II、促濾泡素抑制素結構域III四個結構域(Proceedings of the National Academyof Science of the United States ofAmerica，美國，1988，第85卷，第12號，4218-4222)。因此認為促濾泡素抑制素參與與激活蛋白及其它生長因子的結合。
近年，有GDF-8參與多種疾病的報道。Zimmers等報道將穩定表達GDF-8的細胞移植到裸鼠大腿部，可誘導骨骼肌和脂肪減少等惡液質(cachexic)癥狀(Science，(美國)2002，第296卷，第5572號，1486-1488)。也有伴隨體重減少的HIV感染者的肌肉中，抗GDF-8抗體陽性的蛋白質增加的報道(Proceedings of the National Academy ofScience of the United States of America，美國，1998，第95卷，第25號，14938-14943)。在Duchenne肌肉營養不良的模型小鼠mdx小鼠與GDF-8缺失小鼠交配所得的小鼠中，其肌肉的重量、肌肉的功能均比mdx小鼠有所改善(Annals of Neurology，(美國)，2002，第52卷，第6號，832-836)。另外，在GDF-8缺失小鼠中，可見到骨骼肌增加的同時脂肪量減少；在糖尿病模型小鼠中出現GDF-8基因的缺失，由此提示，由于抑制脂肪蓄積和葡萄糖代謝異常，所以GDF-8參與肥胖和II型糖尿病的發病及病情惡化(The journal of ClinicalInvestigation，(美國)，2002，第109卷，第5號，595-601)。
由此，人們考慮通過抑制GDF-8活性，可對這些GDF-8參與發病或促進病情惡化的疾病進行治療，但為了減輕副作用，優選不抑制激活蛋白的活性而選擇性抑制GDF-8活性的物質。已知抑制GDF-8活性的物質有促濾泡素抑制素(美國專利公開第2002/0157126號說明書，以及特表2002-506044號公報)、抗GDF-8抗體(US6096506說明書)、GDF-8前肽(WO 02/09641號小冊子)、顯性失活GDF-8突變體(WO 01/53350號小冊子及WO 00/43781號小冊子)、GDF-8抗原(US 6369201說明書、WO 01/05820號小冊子及WO 99/42573號小冊子)、GDF-8受體和GDF-8受體抗體(WO02/10214號小冊子)以及Smad2和Smad3磷酸化抑制劑(國際公開第02/055077號小冊子)。

發明內容
本發明的目的是提供能選擇性抑制GDF-8活性，而不抑制激活蛋白的活性的促濾泡素抑制素突變體，其中所述激活蛋白具有下垂體FSH分泌、黃體生成、成紅細胞分化、胰島素分泌等重要功能，所述GDF-8參與惡液質、肌營養不良、肥胖和II型糖尿病的發病和/或病情惡化。
本發明涉及下述的(1)～(28)(1) 一種促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)它包含促濾泡素抑制素結構域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號2或序列號29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數；(c)與抑制激活蛋白的活性相比，選擇性抑制GDF-8的活性。
(2)(1)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括促濾泡素抑制素結構域I，缺失促濾泡素抑制素結構域II。
(3)(1)或(2)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它也不包括促濾泡素抑制素結構域III。
(4)(1)～3任一項中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括2個以上的促濾泡素抑制素結構域I。
(5)(1)～(4)任一項中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它還包括N端結構域。
(6)(1)或(2)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括選自FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI、FSN-FSI-FSI-FSIII的任一結構域結構，其中，FSI表示促濾泡素抑制素結構域I，FSIII表示促濾泡素抑制素結構域III，FSN表示N端結構域，各結構域間可直接相連，或通過連接肽連接。
(7)(1)～(6)任一項中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結構域I是包含序列號1中氨基酸序列的多肽。
(8)(7)中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括序列號4中30～166位的氨基酸序列。
(9)(1)～(8)任一項中描述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結構域的氨基酸序列的N端或C端融合了其它多肽。
(10) 一種多肽，它包含序列號6、8或10中的氨基酸序列。
(11) 一種多聚核苷酸，它編碼(1)～(10)任一項中的多肽。
(12) (11)中描述的多聚核苷酸，它包含序列號5、7或9所示的堿基序列。
(13) 一種載體，它包括(11)或(12)中描述的多聚核苷酸。
(14) 一種轉化體，它是將(13)中的載體導入宿主細胞而得的。
(15) 一種多肽的制備方法，其特征在于，在培養基中培養(14)中的轉化細胞，使該細胞中表達的(1)～(10)任一項中的多肽在培養基或該細胞中蓄積，從培養基或該細胞中收集該多肽。
(16) 一種GDF-8的選擇性抑制劑，它含有(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體，且其不抑制激活蛋白。
(17) 一種醫藥組合物，它含有(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(18) 一種骨骼肌增加劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(19) 一種脂肪減少劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(20) 一種肌肉萎縮癥的治療劑或預防劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(21) 一種伴隨有惡液質、肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預防劑，它含有作為有效成分的(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(22) (21)中描述的治療劑或預防劑，其中伴隨有肌肉萎縮的疾病是遺傳性的肌營養不良、肌肉萎縮性側索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病。
(23) 一種轉基因非人哺乳動物，它導入了含(11)或(12)中多聚核苷酸的外來基因。
(24) 一種增加非人動物肌肉的方法，它向非人動物中施用了(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(25) 一種減少非人動物脂肪的方法，它向非人動物中施用了(1)～(10)任一項中的多肽，(11)或(12)中描述的多聚核苷酸或者(13)中描述的載體。
(26) 一種驗證待檢物質的抑制激活蛋白及GDF-8功能的方法，它包括在激活蛋白、GDF-8、激活蛋白和待檢物質，或GDF-8和待檢物質存在的條件下培養具有報告基因質粒的細胞，檢測報告基因。
(27) (26)描述的方法，其中使用熒光素酶作為報告基因。
(28) (26)或(27)描述的方法，其中使用促濾泡素抑制素突變體多肽作為待檢物質，所述促濾泡素抑制素突變體多肽(a)包含促濾泡素抑制素結構域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號2或序列號29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數；。
附圖簡述

圖1表示人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞各促濾泡素抑制素氨基酸序列的比較，以及FSI和FSII的共有序列。在相當于FSN、FSI、FSII和FSIII各結構域的區域上面劃線，各促濾泡素抑制素結構域中的半胱氨酸殘基處用點表示。
圖2表示質粒pGEM-T Easy(A)的制備過程。
圖3表示質粒pGEM-T Easy(B)的制備過程。
圖4表示質粒pBluescript SK(-)(B)的制備過程。
圖5表示質粒pBluescript SK(-)(A+B)的制備過程。
圖6表示質粒pcDNA3(A+B)的制備過程。
圖7表示質粒pcDNA3(B)的制備過程。
圖8表示質粒pBluescript SK(-)/FS的制備過程。
圖9表示質粒pBluescript SK(-)(A+B+C)的制備過程。
圖10表示質粒pcDNA3(A+B+C)的制備過程。
圖11表示質粒pBluescript SK(-)(D)的制備過程。
圖12表示質粒pcDNA3(A+B+D)的制備過程。
圖13表示質粒pcDNA3(A+B+D)的制備過程。
圖14表示小鼠促濾泡素抑制素的FSII與小鼠FLRG的FSII樣結構域的氨基酸序列的比較。一致的氨基酸用|表示。
圖15表示通過Western Blotting檢測FS1-1。
圖16表示測定FS1-1對激活蛋白及GDF-8的活性抑制的報告基因檢驗的結果。
圖17表示測定各促濾泡素抑制素突變體的激活蛋白活性抑制的報告基因檢驗的結果。分別添加用+表示的多肽。
圖18表示測定各促濾泡素抑制素突變體抑制GDF-8活性的報告基因檢驗的結果。分別添加用+表示的多肽。
圖19表示導入了FS1-1基因的轉基因小鼠的各種骨骼肌的重量增大。
圖20表示導入了FS1-1基因的轉基因小鼠皮下脂肪和腎臟的內在脂肪與體重的重量比減少。
圖21表示測定FS1-Fc抑制激活蛋白及GDF-8的活性的報告基因檢驗的結果。
圖22表示測定FS1-1-Fc抑制激活蛋白及GDF-8的活性的報告基因檢驗的結果。
發明的最佳實施方式1.本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽制備本發明的突變體時可使用任何動物種類作為促濾泡素抑制素的來源，優選哺乳類或鳥類的促濾泡素抑制素，例如人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞等的促濾泡素抑制素，特別優選人促濾泡素抑制素。此外，由于mRNA剪切的不同或翻譯后的加工，產生C末端氨基酸序列不同的分子，任何一種均可。具體而言，包括由序列號4的30～344位氨基酸序列構成的人促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為P47931的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的小鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為NP_032072的氨基酸序列的30～343位氨基酸序列構成的小鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為P21674的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的大鼠促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為P50291的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的牛促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為P10669的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的豬促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為P31514的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的羊促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為062650的氨基酸序列的30～344位氨基酸序列構成的馬促濾泡素抑制素、由NCBI的蛋白質數據庫中登錄號為NP_990531的氨基酸序列的29～343位氨基酸序列構成的雞促濾泡素抑制素、由這些促濾泡素抑制素的C末端缺失了27位氨基酸或12位氨基酸的序列構成的多肽、或者天然存在的這些多肽基因的等位基因突變和單堿基多態基因編碼的多肽。
本發明中促濾泡素抑制素結構域是指在促濾泡素抑制素內重復3次、包括保守的10個半胱氨酸、由Cys-(Xaa)4-Cys-(Xaa)5-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)1-2-Cys-(Xaa)3-Cys-(Xaa)9-10-Cys-(Xaa)10-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)13-Cys表示的大約70個氨基酸序列(Xaa表示任意的氨基酸)構成的區域，從N末端開始分別是促濾泡素抑制素結構域I(以下略作FSI)、促濾泡素抑制素結構域II(以下略作FSII)及促濾泡素抑制素結構域III(以下略作FSIII)。例如，序列號4表示的促濾泡素抑制素前體氨基酸序列(編碼該氨基酸序列的堿基序列示于序列號3中)中95～164位的區域為FSI、168～239位的區域為FSII、245～316位的區域為FSIII。此外，N端結構域(以下略作FSN)是指從促濾泡素抑制素的N末端到FSI之間的區域，例如序列號4表示的促濾泡素抑制素前體氨基酸序列中30～94位的區域。圖1表示人、小鼠、大鼠、牛、豬、羊、馬、雞各種促濾泡素抑制素氨基酸序列與FSN、FSI、FSII、FSIII各結構域的位置，FSI和FSII的共有序列。
與對激活蛋白活性的抑制相比，本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽選擇性抑制GDF-8的活性，其特征在于，它包含FSI，不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys(式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數)所示且與序列號2或序列號29中的氨基酸序列有50％以上、優選60％以上、更優選80％以上、再優選95％以上同源性(以下叫做FSII同源序列)的序列。這里“半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基”是指天冬酰胺、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、異亮氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸及亮氨酸中的任意氨基酸。序列號2中的氨基酸序列是哺乳類及雞促濾泡素抑制素FSII的共有氨基酸序列。序列號29中的氨基酸序列是小鼠促濾泡素抑制素相關基因(follistatin related gene，FLRG)編碼的FLRG蛋白質的2個促濾泡素抑制素結構域樣序列的第2個促濾泡素抑制素結構域樣序列，與序列號2中的序列有61％的同源性。FSII同源序列中包含序列號2的氨基酸序列、序列號29的氨基酸序列。作為FSII同源序列包括，例如上面式(I)代表的氨基酸序列中(X1)a為序列號2的2～5位氨基酸序列或序列號29的2～5位氨基酸序列、(X2)b為序列號2的7～11位氨基酸序列或序列號29的7～11位氨基酸序列、(X3)c為序列號2的13～21位氨基酸序列或序列號29的13～21位氨基酸序列、(X4)d為序列號2的23～24位氨基酸序列或序列號29的23～24位氨基酸序列、(X5)e為序列號2的26～28位氨基酸序列或序列號29的26～29位氨基酸序列、(X6)f為序列號2的30～39位氨基酸序列或序列號29的31～40位氨基酸序列、(X7)g為序列號2的41～50位氨基酸序列或序列號29的42～51位氨基酸序列、(X8)h為序列號2的52～57位氨基酸序列或序列號29的53～58位氨基酸序列、(X9)i為序列號2的59～71位氨基酸序列或序列號29的60～72位氨基酸序列。
不包含FSII同源序列的促濾泡素抑制素突變體包括，例如缺失全部FSII的突變體、缺失FSII的包含1個以上半胱氨酸殘基的部分區域的突變體、缺失FSII的1個以上的半胱氨酸殘基或置換成其它氨基酸的突變體、FSII內部插入了不包括FSII同源序列的10以上氨基酸的氨基酸序列的突變體等。只要是包含FSI不包含FSII同源序列的序列，FSI及FSII以外區域的氨基酸序列中氨基酸缺失、附加、置換的位置、數目不限。氨基酸突變(即氨基酸的缺失、附加或置換)的數目優選為1～50個，更優選1～30個，更優選1～20個，更優選1～10個，特別優選1～5個。此外，促濾泡素抑制素突變體多肽，其FSI的氨基酸序列中也可存在氨基酸的缺失、附加或置換，只要與抑制激活蛋白的活性相比，它能選擇性抑制GDF-8的活性即可。其FSI的氨基酸序列中氨基酸突變的數目優選1～10個，更優選1～8個，更優選1～5個。作為本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽，更優選也缺失了FSIII的多肽。此外，FSI的數目可以是1個，優選含2個以上。也可含FSN。
作為本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽包括具有FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI、FSN-FSI-FSI-FSIII等結構域的多肽，這些多肽的N末端或C末端融合了其它多肽的多肽。各結構域間直接相連，或者連接了由1～50個、優選1～10個、更優選1～5個氨基酸構成的接頭多肽。接頭多肽的氨基酸序列也可以是不包含半胱氨酸的任意序列。融合到N末端或C末端的多肽的序列，可以是不包含上述FSII同源序列的任意序列，也可是1個氨基酸。作為融合到N末端或C末端的多肽，包括免疫球蛋白的恒定區域、Protein A、Protein G、綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基轉移酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱苷肽-S-轉移酶、硫氧還蛋白、多聚組氨酸、S肽、FLAG肽、HA表位肽、myc表位肽等。
FSI序列包括序列號4的95～164位的氨基酸序列，作為各哺乳類和雞的促濾泡素抑制素的FSI的共有序列的序列號1的氨基酸序列。FSII序列包括序列號4的168～239位的氨基酸序列，及作為各哺乳類和雞的促濾泡素抑制素的FSII的共有序列的序列號2的氨基酸序列。FSN序列是，例如序列號4的1～94位的氨基酸序列。FSIII序列是，例如序列號4的245～316位的氨基酸序列。
作為本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的具體例如，包含序列號6、8或10的氨基酸序列的多肽。
本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽也可是經過修飾的多肽。本發明中所說的“修飾”是包含化學修飾及生物學修飾的最廣義解釋。修飾的例子包括，例如烷基化、酯化、鹵化、或氨基化等功能團導入，氧化、還原、添加或脫離等功能團變化、糖化合物(單糖、二糖、寡糖、或多糖)或脂質化合物導入、磷酸化、生物素化、或聚乙二醇修飾等，但并不限定于此。
上述本發明的多肽即可以游離形式提供，也可以酸附加鹽或堿附加鹽形式提供。酸附加鹽包括，例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等，或者p-甲苯磺酸鹽、甲烷磺酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽等有機酸鹽。堿基附加鹽包括，例如鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等金屬鹽，銨鹽，甲基銨鹽、三乙銨鹽等有機銨鹽。有時與甘氨酸等氨基酸形成鹽，有時在分子內形成平衡離子。
有時這些肽或其鹽以水合物或溶劑和物形式存在。本發明的多肽有多個不對稱碳原子，但這些不對稱碳原子的立體結構無特殊限定，但優選氨基酸殘基為L-氨基酸。基于這些不對稱碳原子的光學活性體、非對映異構體等立體異構體、立體異構體的任意混合物、消旋體等均包括在本發明的范疇內。
以下對本發明的促濾泡素抑制素突變體的制備方法、活性評價方法及其使用方法進行說明。
2.促濾泡素抑制素突變體多肽的制備方法(1)編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的構建根據1.中描述的條件，設計與對激活蛋白活性的抑制相比能選擇性抑制GDF-8的促濾泡素抑制素突變體多肽的結構，如下構建編碼該多肽的DNA。
首先，獲得編碼促濾泡素抑制素全長的DNA，或者獲得部分片段的DNA，該片段編碼包含對構成所設計的促濾泡素抑制素突變體多肽必要的促濾泡素抑制素區域。各哺乳類以及雞的促濾泡素抑制素cDNA或基因組DNA的堿基序列是公知的，所以可依據這些序列信息設計引物，以從各哺乳類或雞的精巢分離出的cDNA為模板進行PCR，可獲得該哺乳類或雞的促濾泡素抑制素cDNA的任意部分片段。此外，也可通過篩選精巢cDNA文庫克隆促濾泡素抑制素cDNA，以該cDNA為模板。各哺乳類以及雞的促濾泡素抑制素cDNA或基因組DNA的堿基序列包括NCBI的核苷酸數據庫中登錄號為NM_013409(人促濾泡素抑制素cDNA)、NM_008046(小鼠促濾泡素抑制素cDNA)、NM_012561(大鼠促濾泡素抑制素cDNA)、NM_175801(牛促濾泡素抑制素cDNA)、M63123(羊促濾泡素抑制素cDNA)、AB010829(牛促濾泡素抑制素cDNA)、M19529(豬促濾泡素抑制素cDNA)、NM_205200(雞促濾泡素抑制素cDNA)等中描述的堿基序列。合成包含與獲得的區域的5’端15～30堿基序列、及3’端15～30堿基序列互補的DNA，作為引物。優選在PCR的兩個引物的5’端添加適當的限制性酶識別的序列，用于部分片段的連接和載體的插入。參照Sambrook，J.and Russel，D.W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)等書中描述的方法進行cDNA的制備和PCR。必要時，可以所得DNA作模板進行同樣的操作，獲得編碼對構成所設計的促濾泡素抑制素突變體多肽必要的區域的DNA的部分片段。
根據所設計的促濾泡素抑制素突變體多肽的結構，以符合讀框的方式連接所得部分片段，必要時，可連接編碼其它多肽的DNA，將編碼終止密碼子的區域添加到3’端，通過導入突變而構建成編碼該促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
如(3)中所述，在培養轉化細胞時，當促濾泡素抑制素突變體多肽分泌到細胞外時，要將存在于分泌蛋白前體N端的信號肽添加到設計的促濾泡素抑制素突變體多肽的N端，構建編碼這樣多肽的DNA。信號肽可應用，例如促濾泡素抑制素的信號肽。編碼促濾泡素抑制素信號肽的DNA，可在獲得上述編碼包含促濾泡素抑制素突變體多肽所必需的FSI的促濾泡素抑制素片段DNA時，通過擴增包含促濾泡素抑制素信號肽的片段而獲得。
不分泌時，對于所設計的促濾泡素抑制素突變體多肽的N末端非甲硫氨酸的情況下，在編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的區域前添加起始密碼子(atg)。
例如，分泌具有FSN-FSI-FSI這樣結構域結構的促濾泡素抑制素突變體多肽時，首先通過PCR分別獲得編碼包含信號肽-FSN-FSI區域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段A，以及編碼包含FSI區域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段B。將所得cDNA片段B連接到所得cDNA片段A的下游，制備成編碼具有信號肽-FSN-FSI-FSI這樣結構域結構的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
此外，分泌具有FSN-FSI-FSI-FSIII這樣結構域結構的促濾泡素抑制素突變體多肽時，通過PCR獲得編碼包含FSIII區域的促濾泡素抑制素cDNA的部分片段C，將cDNA片段B連接到上述cDNA片段A的下游，再將cDNA片段C連接到其下游，由此制備成編碼具有信號肽-FSN-FSI-FSI-FSIII這樣結構域結構的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA。
(2)促濾泡素抑制素突變體表達載體的制備與宿主細胞的導入將(1)中制備的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到適于宿主細胞表達用的載體中，制備成促濾泡素抑制素突變體表達載體。
可應用細菌等原核生物、酵母等真核生物、動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等任何一種作為宿主細胞，只要是能表達促濾泡素抑制素突變體多肽即可。但為了使導入了促濾泡素抑制素突變體表達載體的細胞(以下稱做轉化細胞)表達的促濾泡素抑制素突變體多肽保持正確的高級結構、保持GDF-8特異的抑制活性，優選用動物細胞和昆蟲細胞等進行表達。
也可應用在上述宿主細胞中能自主復制、或者可能整合到染色體中、含有在宿主細胞中發揮作用的啟動子的載體作為插入了編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的表達載體。此外，為了制備應用大腸桿菌的載體，優選含有具備大腸桿菌用的內源性啟動子的耐藥基因、在大腸桿菌內復制所必需的復制起點的載體。大腸桿菌用的耐藥基因包括大腸桿菌來源的氨芐青霉素抗性基因(β-內酰胺酶基因)、四環素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。在大腸桿菌內復制所必需的復制起點包括pBR322的復制起點、colE1的復制起點等。
使用動物細胞作為宿主細胞時，可應用具有在動物細胞中發揮作用的啟動子和多腺苷酸化信號的質粒作為插入了編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的表達載體。
作為啟動子可應用在動物細胞中發揮作用的任何啟動子，例如，人巨細胞病毒(CMV)IE(immediate early)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、莫洛尼小鼠白血病病毒的長末端重復(LTR)、Rous肉瘤病毒的LTR、單純皰疹病毒(HSV)的胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(TK)基因的啟動子、逆轉錄病毒的啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、金屬硫蛋白的啟動子等。也可與上述啟動子一起應用人CMV IE基因的增強子等。優選能將編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到其下游的、具有適當的限制性酶位點的啟動子。
可應用任何多腺苷酸化信號作為多腺苷酸化信號，例如應用SV40早期基因的多腺苷酸化信號、羊β珠蛋白基因的多腺苷酸化信號、牛生長激素基因的多腺苷酸化信號等。
此外還可含有動物細胞用的耐藥基因的表達單元(在啟動子下游順次連接耐藥基因和多腺苷酸化信號的結構)。動物細胞用的耐藥基因包括新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、殺稻瘟素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、零霉素抗性基因等。可應用上述的啟動子和多腺苷酸化信號。應用具有耐藥基因的表達單元的表達質粒時，可通過在藥物存在的條件下培養轉化細胞而獲得瞬時穩定表達的轉化細胞。
應用包含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的表達單元的表達質粒，以缺失dhfr基因的動物細胞作為宿主細胞，在氨甲喋呤存在下培養轉化細胞，通過階段性提高氨甲喋呤的濃度，使與dhfr基因一起導入的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的拷貝數擴增，獲得促濾泡素抑制素突變體多肽的表達量高的轉化細胞。
此外，也可具有動物細胞內復制所必需的復制起點。可應用SV40的復制起點和EB病毒的復制起點oriP作為復制起點。由于具有SV40復制起點的質粒載體在表達SV40大T抗原的宿主細胞中拷貝數增加，所以適于高表達目的基因。包含oriP的載體在表達EB病毒EBNA-1(Epsin-Barr virus nuclear antigen-1)的宿主細胞中不整合到宿主的染色體上，維持在染色體以外。
如上作為動物細胞的表達載體包括pcDNA3(Invitrogen制)、pcDNA3.1(+)(Invitrogen制)、pSI(QIAGEN)、pSI-neo(QIAGEN)、pAGE107、pAGE103、pAMo[J.Biol.Chem.，268，22782(1993)]等。
將(1)中制備的編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到上述動物細胞表達用載體的啟動子下游，構建成促濾泡素抑制素突變體多肽表達載體。
可應用猴腎臟細胞株COS-1(ATCC號CRL-1650)和COS-7(ATCC號CRL-1651)、中國倉鼠卵巢細胞株CHO-K1(ATCC號CCL-61)和CHO/dhFr-(ATCC號CRL-9096)、人B淋巴細胞細胞株Namalwa(ATCC號CRL-1432)、人腎臟細胞株HEK293(ATCC號CRL-1573)、人子宮頸上皮細胞株HeLa(ATCC號CCL-2)、小鼠胎兒細胞株NIH/3T3(ATCC號CRL-1658)等作為宿主細胞。
作為重組載體的導入方法可應用將DNA導入動物細胞的任意方法，例如電穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]、Virology，52，456(1973)中記載的方法等。此外，也可使用商品化的DNA導入試劑。DNA導入試劑有TransFast(Promega)、Lipofectamine 2000(Invitrogen制)、SuperFect(QIAGEN)、PolyFect(QIAGEN)等。
應用昆蟲細胞作宿主時，可根據例如桿狀病毒表達載體，ALaboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rded.，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)、Bio/Technology，6，47(1988)等描述的方法，獲得表達促濾泡素抑制素突變體多肽的昆蟲細胞。
也就是說，將重組的基因導入載體與桿狀病毒一起導入昆蟲細胞，在昆蟲細胞培養上清中獲得重組病毒后，再用重組病毒感染昆蟲細胞，獲得表達多肽的昆蟲細胞。
該方法中所應用的基因導入載體有，例如pVL1392和pVL1393(均為Pharmingen制)、pBlueBac4.5(Invitrogen制)等。
可應用例如感染夜蛾科(Noctuidea)昆蟲的病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒等作為桿狀病毒。
作為昆蟲細胞，包括草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)來源的Sf9和Sf21(Invitrogen制)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)來源的High5(Invitrogen制)、家蠶(Bombyx mori)來源的Bm5(Invitrogen制)及N4等細胞株。
制備重組病毒時作為轉移載體與上述桿狀病毒共導入的方法包括，例如磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
使用細菌等原核生物作為宿主細胞時，表達載體要應用在宿主原核生物中能自主復制、在啟動子及其下游有插入核糖體結合序列，和可插入編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的克隆位點。雖不必要，但優選在該克隆位點之后隨即配置轉錄終止序列的方法。此外，為了篩選轉化體，要包含表達耐藥基因等標志基因的序列。將編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA插入到核糖體結合序列下游的克隆位點。優選核糖體結合序列與起始密碼子之間調整成適當的距離(例如，大腸桿菌為宿主的載體中6～18個堿基)。
作為啟動子只要能在宿主細胞中表達即可。例如，大腸桿菌作宿主時，可應用trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子、T7啟動子、PR啟動子等大腸桿菌和噬菌體來源的啟動子等。此外，還可應用trp啟動子2個串聯的啟動子、tac啟動子、T7lac啟動子、letI啟動子等人為設計改造過的啟動子等。枯草桿菌作宿主時，可使用枯草桿菌的噬菌體SP01和SP02的啟動子、penP啟動子等。
作為表達載體的例子有，例如pGEMEX-1(Promega)、pQE-30(QIAGEN)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pTrS30[從大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制備]、pGEX5X-3(Amersham BioScience制)、pET14(Novagen制)、pPROTet.E(Clontech制)、pRSET A(Invitrogen制)等。
作為宿主細胞可應用屬于大腸桿菌屬、沙雷菌屬、桿菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬等菌屬的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌BL21(DE3)pLysS、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘質沙雷菌(Serratia marcescens)、枯草桿菌(Bacillus substilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、產氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)、Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、解糖短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌ATCC14067、谷氨酸棒桿菌棒狀桿菌ATCC13869、嗜乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC13870、嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)ATCC15354、假單胞菌某種(Pseudomonas sp.)D-0110等。
作為重組載體的導入方法可應用上述將DNA導入宿主細胞的任意方法，例如電穿孔法[Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]、應用鈣離子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、原生質體法(特開昭63-248394；Mol.Gen.Genet.，168，111(1979))等。
使用酵母作為宿主細胞時，表達載體可應用含有可在酵母中進行轉錄的啟動子、轉錄終止序列和能表達酵母中作為轉化標記的基因、例如耐藥基因和TRP1、HIS3、LEU2等氨基酸合成體系的基因的序列。此外，為使表達載體的制備和維持容易，優選能在大腸桿菌內自主復制并能表達成為基因導入標記的耐藥基因的載體。
作為啟動子只要能在酵母中進行轉錄即可，例如釀酒酵母的醇脫氫酶基因ADH1、半乳糖代謝體系基因GAL1和Gal10等的啟動子、酸性磷酸酶基因PH05啟動子、磷酸甘油酸激酶PGK啟動子、甘油醛3磷酸脫氫酶GAP啟動子、熱休克蛋白基因啟動子、α結合因子基因MF α1啟動子、銅金屬硫蛋白基因CUP1啟動子、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的醇脫氫酶基因AOX1的啟動子等。
作為宿主細胞可應用屬于酵母屬、裂殖酵母屬、畢赤屬的酵母菌株，具體而言，包括釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等。
作為重組載體的導入方法可應用將DNA導入酵母的任意方法，例如電穿孔法[Methods Enzymol.，194，182(1991)、原生質球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，4889(1984)]、醋酸鋰法[J.Bacteriol.，153，163(1983)]等。
(3)轉化細胞的培養及促濾泡素抑制素突變體多肽的純化(2)中制備的轉化細胞為大腸桿菌等原核生物或酵母等真核生物時，培養該細胞的培養基含有營養細胞的碳源、氮源、無機鹽類等，只要是能有效進行轉化體的培養，無論是天然培養基還是合成培養基均可應用。作為碳源可應用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖類的糖蜜，淀粉或淀粉水解物等碳水化合物，醋酸、丙酸等有機酸，乙醇、丙醇等醇類。作為氮源可應用銨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽、其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆糟及大豆糟水解物、各種發酵菌體及其消化物等。作為無機鹽可應用磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
通常培養在振蕩培養或深部通氣攪拌培養的條件下進行。培養溫度為15～40℃，培養時間為16～96小時。培養過程中pH保持3.0～9.0。用無機酸或有機酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、銨等調節pH。必要時，培養過程中向培養基中添加氨芐青霉素和四環素等抗生素。當培養用應用誘導性啟動子的表達載體轉化的微生物時，必要時向培養基中添加誘導劑。例如，當培養用應用lac啟動子的表達載體轉化的微生物時向培養基中添加IPTG等，當培養用應用trp啟動子的表達載體轉化的微生物時向培養基中添加吲哚丙烯酸等。
(2)中制備的轉化細胞為動物細胞時，培養該細胞的培養基可使用常規使用的RPMI1640培養基[J.Am.Med.Assoc.，199，519(1967)]、Eagle的MEM培養基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco’s改良Eagle培養基[virology，8，396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，73，1(1950)]、MEM培養基、EX-CELL 301培養基(JRH BioScience)，或者應用向這些培養基中添加了胎牛血清的培養基。通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等條件下進行1～7天的培養。培養過程中，必要時向培養基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
(2)中制備的轉化細胞為昆蟲細胞時，培養該細胞的培養基可使用常規使用的TNM-FH培養基(Pharmingen制)、Sf-900II SFM培養基(Invitrogen制)、EX-CELL 400、EX-CELL 405培養基(JRHBioScience)、Grace的昆蟲培養基[Nature，195，788(1962)]等。培養條件是pH6～7、培養溫度25～30℃、培養時間通常1～5天。培養過程中，必要時向培養基中添加慶大霉素等抗生素。
促濾泡素抑制素突變體多肽既可分泌到細胞外也可不分泌而在細胞內表達，但優選分泌到細胞外。分泌到細胞外時，(2)中制備編碼促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA時，要用編碼在設計的促濾泡素抑制素突變體多肽N末端添加信號肽的DNA構建表達載體，然后獲得轉化細胞。分泌時，由于信號肽被剪切，所以培養基中蓄積的是除去了信號肽的促濾泡素抑制素突變體多肽。
通過如上的培養，表達的促濾泡素抑制素突變體多肽在培養了轉化細胞的培養基中或轉化細胞中蓄積。如下，從該培養基或轉化細胞中分離、純化促濾泡素抑制素突變體多肽。
促濾泡素抑制素突變體多肽分泌到細胞外時，回收培養基。當轉化細胞懸浮存在時，通過離心和過濾分開培養基和細胞，獲得培養基。可通過應用硫酸化cellulofine柱的親和層析，從回收的培養基中進行高效純化。此外，也可組合應用其它蛋白質純化中常規使用的純化方法，例如凝膠過濾、離子交換色譜、逆相色譜及超濾等進行純化。此外，也可應用特異性識別促濾泡素抑制素FSI的抗體，通過親和層析進行純化。
當促濾泡素抑制素突變體多肽與其它多肽以融合蛋白存在時，可通過利用特異性結合所融合的其它多肽的物質進行親和層析進行純化。例如，與IgG的恒定區域融合的蛋白質時，利用固化了Protein A和抗IgG抗體的柱進行親和層析；當與Protein A融合時，應用固化了IgG的柱進行親和層析；當與FLAG肽、S肽、HA表位肽、myc表位肽融合時，應用固化了針對這些肽的抗體的柱進行親和層析；當與多聚組氨酸融合時，應用固化了鎳離子的柱進行親和層析；當與谷胱苷肽-S-轉移酶融合時，應用固化了谷胱苷肽的柱進行親和層析，進行純化。
當促濾泡素抑制素突變體多肽在細胞內表達時，回收轉化細胞。在含蛋白酶抑制劑的適當的緩沖液中，通過勻漿和超聲等手段使回收的細胞破碎，通過離心回收上清，獲得細胞溶解液。用與從培養基進行分離、純化同樣的手段進行促濾泡素抑制素突變體多肽的分離、純化。
此外，也可按照公知的方法[J.Biomolecular NMR，6，129；Science，242，1162(1988)；J.Biochem.，110，166(1991)]，應用體外轉錄、翻譯體系進行促濾泡素抑制素突變體多肽的生產。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[SDS-PAGE，Nature，227，680(1970)]和Western Blotting法(Antibodies，Molecular CloningALaboratory Manual，3rded.，Cold Spring Harbor Laboratory，Chapter12(1988)；Monoclonal Antibodies，Principales and Practice，AcademicPress Limited(1996))等測定純化的促濾泡素抑制素突變體的分子量。
3.本發明的促濾泡素抑制素突變體GDF-8選擇性抑制的驗證本發明的促濾泡素抑制素突變體“選擇性抑制GDF-8的活性”是指“與對激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性”。“與對激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性”是指用權利要求3中描述的方法，相同濃度的促濾泡素抑制素突變體多肽，測定其對激活蛋白活性的抑制與GDF-8活性的抑制時，其對GDF-8活性的抑制達50％以上，優選60％以上，更優選70％以上，更優選80％以上，與此相對，其對激活蛋白活性的抑制不到50％，優選在30％以下，更優選10％以下，更優選不抑制，與對激活蛋白活性的抑制相比，更強烈抑制GDF-8的活性。
本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽是與對激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8活性的促濾泡素抑制素突變體多肽，優選不抑制激活蛋白的活性，只選擇性抑制GDF-8活性。如下確認本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的活性(與對激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8活性的活性)，例如通過報告基因檢驗測定激活蛋白和GDF-8具有的轉錄促進活性。
制備導入了報告基因質粒(CAGA)12-MLP-Luc[EMBO J.，17，3091(1998)]的動物細胞。(CAGA)12-MLP-Luc的結構包含其上游插入了12個叫做CAGA box的激活蛋白和GDF-8應答序列(AGCCAGACA)的腺病毒的主要后期啟動子、該啟動子下游連接了作為報告基因熒光素酶基因。報告基因的導入按2中描述的方法進行。對所得轉化細胞測定其分別添加(a)GDF-8，(b)激活蛋白，(c)促濾泡素抑制素突變體多肽，(d)GDF-8及促濾泡素抑制素突變體多肽，(e)激活蛋白及促濾泡素抑制素突變體多肽，(f)不添加任何物質時的熒光素酶活性。與(f)不添加任何物質時相比，分別添加(a)GDF-8及(b)激活蛋白時，轉錄活性活化，熒光素酶活性增加。此外，添加(c)促濾泡素抑制素突變體多肽時熒光素酶活性未增加。本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽選擇性抑制GDF-8活性可通過如下進行驗證(I)與添加(a)GDF-8時相比，添加(d)GDF-8及促濾泡素抑制素突變體多肽時熒光素酶活性降低，只添加(c)促濾泡素抑制素突變體多肽時或者(e)不添加任何物質時熒光素酶活性相近，與此相反，(II)與添加(a)激活蛋白時相比，添加(d)激活蛋白及促濾泡素抑制素突變體多肽時未見到熒光素酶活性降低，熒光素酶活性的降低比添加GDF-8時的活性降低明顯的弱。
4.含本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的醫藥組成物由于本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽、施用該多肽的生物體內表達的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，與對激活蛋白活性的抑制相比，選擇性抑制GDF-8的活性，所以可用于治療和預防其發病或進展與GDF-8相關的癥狀和疾病，且預期可減少因激活蛋白受抑制而產生的副作用。這樣的癥狀和疾病包括，例如伴隨疾病、老化、臥床等的骨骼肌減少和萎縮、皮下脂肪和內臟脂肪等脂肪的增加、惡液質、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥等。伴隨肌肉萎縮的疾病包括Duchenne肌營養障礙等遺傳性肌營養不良、肌肉萎縮性側索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病等因神經病變而呈現出的繼發肌肉萎縮等疾病。
本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽、施用該多肽的生物體內表達的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，可作為GDF-8的選擇性抑制劑、骨骼肌增加劑、脂肪降低劑、肌肉萎縮癥的治療劑或預防劑，以及惡液質、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預防劑單獨使用，也可以常規的各種藥劑形式提供。此外，這些藥劑可用于動物或人。
本發明的藥劑可單獨含有上述活性成分或其藥理學上可接受的鹽，或者與任何其它用于治療的有效成分以混合物形式存在。此外，可將活性成分與藥理學上可接受的一種或一種以上的載體一起混和，通過制藥學技術領域中熟知的任意方法制備這些藥劑。
作為使用途徑，期望預防或治療時使用最有效的途徑，包括經口或靜脈內等非經口途徑，但優選非經口途徑。
使用形式包括例如片劑、注射劑等。
適于經口施用的片劑等，可應用乳糖、甘露醇等賦形劑，淀粉等蓬松劑，硬脂酸鎂等潤滑劑，羥丙基纖維素等結合劑，脂肪酸酯等表面活性劑，甘油等可塑劑等添加劑進行制備。
適于非經口施用的制劑優選包含與接受者血液等滲的活性化合物的無菌水性劑。例如，注射劑時，應用由鹽溶液、葡萄糖溶液或者鹽水與葡萄糖溶液的混合物構成的載體等制備注射用的溶液。此外，這些非經口藥劑中也可添加1種或1種以上選自經口劑中示例的賦形劑、蓬松劑、潤滑劑、結合劑、表面活性劑、可塑劑及稀釋劑、防腐劑、香料類等的輔助成分。
再者，通過適當選擇添加脂質、透明質酸、溫度敏感性多聚體、水難溶性高分子、或表面活性劑等，達到肽吸收的持續化。
上述活性成分或其藥理學上可接受的鹽，用于上述目的時，通常全身或局部，以經口或非經口形式施用。施用量及施用次數根據施用的形式、患者的年齡、體重、治療中癥狀的性質或嚴重程度等而不同，通常，經口施用時，成人每人每次0.01～1000mg，優選0.05～500mg，1日施用1次～數次。靜脈內施用等非經口施用時，通常成人每人0.001～1000mg，優選0.01～300mg，1日施用1次～數次，或者1日1～24小時范圍內靜脈內持續施用。但是這些施用量及施用次數根據前述的各種條件而變動。
此外，作為GDF-8的選擇性抑制劑、骨骼肌增加劑、脂肪降低劑、肌肉萎縮癥的治療劑或預防劑，惡液質、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖和獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預防劑的有效成分，利用DNA和RNA等核酸進行基因治療時，可單獨使用該DNA或RNA，或者將其插入到逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體等適當載體后，按上面描述的常規方法制劑化，處方和施用；或者通過非病毒基因移入法施用。
按以下方法制備重組病毒載體。
制備作為有效成分使用的DNA(以下稱作目的DNA)片段。將該DNA片段插入到病毒載體內的啟動子的下游，構建成重組病毒載體。
制備RNA病毒載體時，制備與目的DNA同源的RNA片段，將其插入到病毒載體內的啟動子下游，構建成重組病毒。RNA片段除雙鏈外，可根據病毒載體的種類選擇有義鏈或反義鏈中的任一鏈。例如，應用逆轉錄病毒時，選擇與有義鏈同源的RNA；應用有義病毒載體時選擇反義鏈同源的RNA。
將該重組病毒載體導入到與之相適應的包裝細胞內。重組病毒載體至少缺失一個編碼病毒包裝所必要的蛋白質的基因。作為包裝細胞，只要能補充重組病毒載體所缺失的蛋白質，可使用任何一種細胞。例如，可使用人腎臟來源的HEK293細胞、小鼠成纖維細胞NIH3T3等。包裝細胞所補充的蛋白質包括逆轉錄病毒時，可以是小鼠逆轉錄病毒來源的gag、pol、env等；慢病毒時，可以是HIV來源的gag、pol、env、vpr、vpu、vif、tat、rev、nef等；腺病毒時，可以是腺病毒來源的E1A、E1B等；腺相關病毒時，Rep(p5、p19、p40)、Vp(Cap)等蛋白質。
作為病毒載體，可應用在上述包裝細胞中能生產重組病毒、并包含一種啟動子使目的DNA可在靶細胞中轉錄的病毒載體。作為質粒載體可應用MFG[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，6733(1995)]、pBabePuro[Nucleic Acids Res.，18，3587(1990)]、LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG[J.Virol.，72，8150(1998)]、pAedxI[Nucleic Acids Res.，23，3816(1995)]等。至于啟動子，可使用任何一種，只要其能在人組織中發揮功能即可。例如人巨細胞病毒(CMV)IE(immediate early)基因的啟動子、SV40的早期啟動子、逆轉錄病毒的啟動子、金屬硫蛋白的啟動子、熱休克蛋白啟動子、SRα啟動子等。此外，人CMV IE基因的增強子可與啟動子一起使用。
將重組病毒載體導入包裝細胞的方法有，例如磷酸鈣法(特開平2-227075)、脂質轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等。
上述重組病毒載體的施用方法，上述方法聯合應用脂質體遞送的直接體內(in vivo)基因導入的方法，可將病毒載體指向患者的癌組織。也就是說，將適當大小的目的DNA與腺病毒殼蛋白特異的多聚賴氨酸偶聯抗體一起制備復合體，通過將所得復合體與腺病毒載體結合，制備出病毒載體。該病毒載體能穩定到達靶細胞，通過胞內體攝取到細胞內，在細胞內分解，有效表達目的基因。
本發明中表達目的DNA的載體通過非病毒基因移入方法也能輸送到病灶。
該領域內公知的非病毒基因移入方法包括磷酸鈣共沉淀法[Virology，52，456(1973)；Science，209，1414(1980)]、顯微注射法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，5399(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，7380(1980)；Cell，27，223(1981)；Nature，294，92(1981)]、借助脂質體的膜融合介導的移入法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)；Biochemistry，28，9508(1989)；J.Biol.Chem.，264，12126(1989)；Hum.Gene Ther.，3，267(1992)Science，249，1285(1990)；Circulation，83，2007(1992)]、或者直接攝取DNA及受體介導的DNA移入法[Science，247，1465(1990)；J.Biol.Chem.，266，14338(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，36559(1991)J.Biol.Chem.，264，16985(1989)；BioTechniques，11，474(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3410(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，4255(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，4033(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，8850(1991)；Hum.Gene Ther.，3，147(1991)]等。
借助脂質體的膜融合介導的移入法通過將脂質體制備物直接施用給目的組織，可在該組織的局部進行基因的攝取及表達。將DNA直接靶向患者癌組織時，優選直接DNA攝取技術。受體介導的DNA移入法，例如借助多聚賴氨酸，通過將DNA(通常，共有的閉環超螺旋質粒的形式)偶聯到蛋白質配體上進行。基于靶細胞或組織細胞表面上存在的對應的配體受體選擇配體。該配體-DNA軛合物可預期直接注射到血管內，通過受體結合及DNA-蛋白質復合體的內化而靶向靶細胞。為了防止DNA的細胞內破壞，可同時感染腺病毒，破壞胞內體的功能。
5.導入了包含編碼本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的多聚核苷酸的外源基因的轉基因非人哺乳動物通過將包含編碼本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的多聚核苷酸的外源基因導入非人哺乳動物，可制備出轉基因非人哺乳動物。上述轉基因非人哺乳動物中，過量表達本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽，明顯的特征是骨骼肌重量增加。該轉基因非人哺乳動物可用作骨骼肌形成結構的研究、伴隨骨骼肌異常的疾病的研究時使用的模型動物。
本說明書中所言“非人哺乳動物”的具體例包括小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、狗、貓、羊、豬、山羊、牛或猴等，優選小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、綿羊等嚙齒類動物，最優選小鼠。
以下對本發明的轉基因非人哺乳動物的制備方法進行說明。
(1)導入基因的制備將編碼本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA導入到目標動物時，一般應用將該DNA連接到在導入的目標動物細胞內能表達該DNA的啟動子下游的基因構建物。按照常規方法，例如如下制備要導入的基因。
以導入的基因全長互補的DNA為基礎，必要時，制備包含編碼該多肽部分的適當長度的DNA片段，然后將該DNA片段或全長互補DNA插入到適當表達載體的啟動子下游，構建重組載體。
作為導入到動物的基因的表達載體，可應用大腸桿菌來源的質粒、枯草桿菌來源的質粒、酵母來源的質粒、λ噬菌體等噬菌體、莫洛尼白血病小鼠等的逆轉錄病毒、痘苗病毒或桿狀病毒等動物病毒等。這些載體中優選枯草桿菌來源的質粒或酵母來源的質粒，特別優選大腸桿菌來源的質粒。
本發明中應用的啟動子的具體例如本說明書中上面描述的。本發明中應用的表達載體優選含有終止轉基因哺乳動物中目標信使RNA轉錄的序列(通常叫做終止子)。例如，應用病毒來源、各種哺乳動物和鳥類來源的各基因中包含的具有相同功能的序列，調控基因表達。優選應用猿病毒的SV40終止子等。此外，想更高表達目的基因時，可根據需要，將各基因的剪切信號、增強子區域、真核生物基因的內含子部分連接到啟動子區域的5’上游、啟動子區域和翻譯區域之間或翻譯區的3’下游。
(2)轉基因非人哺乳動物的制備本發明的轉基因非人哺乳動物可通過將編碼本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA導入到目標動物而進行制備。具體而言，通過將該基因導入到成為目標的非人哺乳動物的受精卵、胚胎干細胞、體細胞、精子、未受精卵，可獲得編碼本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽的目的DNA整合到包括生發細胞在內的所有細胞的染色體上的轉基因非人哺乳動物。該基因向受精卵、胚胎干細胞、體細胞、精子、未受精卵的導入，優選能確保存在于包括目標非人哺乳動物的生發細胞和體細胞在內的所有細胞的染色體上。基因導入后生產的動物的生發細胞中存在該導入的基因是指，生產的動物的后代其生發細胞及體細胞均含有該導入基因。
個體的選擇可通過在蛋白質或mRNA水平的確認導入基因產物的表達進行。所述動物的子孫繼承篩選出的個體的基因，具有該導入基因產物。獲得同源染色體雙方保持該導入基因的純合子，通過雌雄動物交配，所有的后代均穩定保持該基因。另外確認具有該基因，可在常規的飼養環境下繁殖傳代。
通過將基因導入到受精卵或胚胎干細胞的轉基因動物的制備，可應用Manipulating Mouse Embryo 2nd；Gene Targeting，A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press(1993)；BioManualSeries 8；Gene Targeting；應用ES細胞的突變小鼠的制作，羊土社(1995)；発生工學実験マニユアル，轉基因小鼠的制作方法，講談社(1987)等中描述的方法。通過哺乳類動物細胞的基因導入和核移植制備轉基因動物，可應用Cibelli等(Science，280，1256，1998)、Schnieke等(Science，278，2130，1997)、Baguisi等(Nature Biotechnology，17，456，1999)等中報導的方法。通過將基因導入精子制備轉基因動物，可應用Perry等(Science，284，1180，1999)、Wakayama等(NatureBiotechnology，16，639，1998)中報導的方法。通過將基因導入未受精卵和體外受精制作轉基因動物，可應用Chan等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，14028，1998)中報導的方法。
6.家畜改良方面的應用本發明的促濾泡素抑制素突變體多肽、用于施用該多肽的生物體內表達的編碼該多肽的多聚核苷酸及包含該多聚核苷酸的載體，可通過施用給牛、豬、羊、雞等非人動物，增加非人動物的骨骼肌，降低脂肪。此外，與5中描述的方法同樣，通過制備導入了編碼本發明促濾泡素抑制素突變體多肽的DNA的轉基因非人動物，可增加非人動物的骨骼肌，降低脂肪。尤其是非人動物為家畜時，可如上制作肉量多、脂肪少的家畜，所以可增加肉的產量，或生產出脂肪少的優質肉。此外，由于骨骼肌的增加，可改善家畜的勞動力。
以下為本發明的實施例，但本發明的范疇并不限定于這些實施例。
實施例實施例1促濾泡素抑制素突變體多肽表達載體的制備用豬促濾泡素抑制素前體cDNA作探針，通過雜交從人精巢cDNA文庫[Clontech]克隆出人促濾泡素抑制素前體cDNA，將該促濾泡素抑制素前體cDNA[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，4218，(1988)]插入到質粒pUC19(寶酒造)中的EcoRI位點和XbaI位點之間，構建成促濾泡素抑制素突變體用的模板pUC19/FS。
向含0.2mmol/l dNTPs、1mmol/l氯化鎂的反應液中添加100ng促濾泡素抑制素突變體用的模板，用具有序列號11和序列號12中所示堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，向反應液中添加各10pmol的引物，再添加2.5單位的Taq聚合酶(TaKaRa Ex Taq，寶酒造)，共25μl，進行PCR。反應條件是94℃30秒、74℃15秒、72℃30秒3個循環，94℃30秒、70℃15秒、72℃30秒3個循環，94℃30秒、66℃15秒、72℃30秒3個循環，94℃30秒、62℃15秒、72℃30秒3個循環，94℃30秒、58℃15秒、72℃30秒3個循環，94℃30秒、54℃15秒、72℃30秒12個循環，其后，進行72℃10分鐘的1個循環。將該反應液進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.25kb的基因擴增片段A(圖2)。基因擴增片段A編碼的氨基酸序列中包含序列號4的95～168位序列，包含人促濾泡素抑制素的FSI。
用具有序列號13和序列號14中堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，向反應液中分別添加10pmol，用與上述基因擴增片段A同樣的條件進行PCR，將反應液進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.6kb的基因擴增片段B(圖3)。基因擴增片段B編碼的氨基酸序列中包含序列號4的1～166位序列，包含人促濾泡素抑制素的FSN和FSI。
應用pGEM-T Easy TA克隆試劑盒(Promega)，按照所附說明書，分別將所得基因擴增片段A和B連接到pGEM-T Easy載體中，獲得圖2和圖3中所示的質粒pGEM-T Easy(A)和pGEM-T Easy(B)。
接下來，連接用限制性酶EcoRI(寶酒造)和HindIII(寶酒造)酶切質粒pGEM-T Easy(B)獲得的含擴增片段(B)的大約0.59kb的EcoRI-HindIII片段(B)，和用EcoRI和HindIII酶切質粒pBluescript SK(-)(Stratagene)，獲得的大約2.95kb的EcoRI-HindIII片段。制備成圖4所示的質粒pBluescript SK(-)(B)。
接下來，將用限制性酶SalI(寶酒造)和HindIII(寶酒造)酶切質粒pGEM-T Easy(A)獲得的含擴增片段(A)的大約0.27kb的HindIII-SalI片段(A)，和用SalI和HindIII酶切質粒pBluescript SK(-)(B)，獲得的大約3.54kb的HindIII-SalI片段相連接。制備成圖5所示的質粒pBluescript SK(-)(A+B)。
然后，連接用限制性酶EcoRI和Spel(寶酒造)酶切質粒pBluescriptSK(-)(A+B)獲得的含擴增片段A和B的大約0.84kb的EcoRI-Spel片段(A+B)，及用EcoRI和Xbal(寶酒造)酶切動物細胞表達用質粒pcDNA3(Invitrogen)，獲得的大約5.4kb的EcoRI-Xbal片段。獲得圖6所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達質粒pcDNA3(A+B)。pcDNA3(A+B)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區域的堿基序列示于序列號15中，該多肽的氨基酸序列示于序列號16中。序列號16中的1～29位的氨基酸序列為信號肽，多肽分泌時被剪切。因此，導入了pcDNA3(A+B)的動物細胞分泌包含序列號6的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1)。FS1-1是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個FSI，但FSII和FSIII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
此外，連接用限制性酶EcoRI和XhoI(寶酒造)酶切質粒pBluescript SK(-)(B)獲得的含擴增片段B的大約0.6kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動物細胞表達用質粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖7所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達質粒pcDNA3(B)。pcDNA3(B)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區域的堿基序列示于序列號17中，該多肽的氨基酸序列示于序列號18中。序列號18中的1～29位的氨基酸序列為信號肽，多肽分泌時被剪切。因此，導入了pcDNA3(B)的動物細胞分泌包含序列號8的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1)。FS1是包含人促濾泡素抑制素的FSN和1個FSI，但FSII和FSIII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
將用EcoRI酶切促濾泡素抑制素突變體用模板所得含促濾泡素抑制素前體cDNA的大約1.1kb的EcoRI片段插入到質粒pBluescriptSK(-)的EcoRI位點，獲得如圖8所示的pBluescript SK(-)/FS。連接用EcoRV和XhoI酶切所得質粒pBluescript SK(-)/FS獲得的大約0.4kb的EcoRV-XhoI片段C，和用EcoRV和XhoI酶切質粒pBluescriptSK(-)(A+B)所得大約3.8kb的EcoRV-XhoI片段，構建成如圖9所示的質粒pBluescript SK(-)(A+B+C)。
接下來連接用限制性酶EcoRI和XhoI酶切質粒pBluescript SK(-)(A+B+C)獲得的大約1.2kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動物細胞表達用質粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖10所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達質粒pcDNA3(A+B+C)。pcDNA3(A+B+C)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區域的堿基序列示于序列號19中，該多肽的氨基酸序列示于序列號20中。序列號20中的1～29位的氨基酸序列為信號肽，多肽分泌時被剪切。因此，導入了pcDNA3(A+B+C)的動物細胞分泌包含序列號10的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1-3)。FS1-1-3是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個FSI和幾乎全部FS3，但FSII缺失的促濾泡素抑制素突變體多肽。
另外，以小鼠FLRG cDNA[J.Biol.Chem.，275，40788(2000)]為模板，用具有序列號21和序列號22中所示堿基序列的合成DNA[Genset]作引物，分別用10pmol，在與上述基因擴增片段A同樣的條件下進行PCR，將反應液進行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大約0.3kb的基因擴增片段D(圖11)。該基因擴增片段編碼的氨基酸序列中包含小鼠FLRG的(NCBI蛋白質數據庫登錄號BAB32663)的165～256位的氨基酸序列，包含小鼠FLRG的FSII樣結構域(NCBI蛋白質數據庫登錄號BAB32663的169～241區域)。如圖14所示，小鼠FLRG的FSII樣結構域與小鼠促濾泡素抑制素的FSII的氨基酸序列有56％(41/73)的同源性，與序列號2的氨基酸序列有61.6％(45/73)的同源性。
用EcoRI酶切所得基因擴增片段D，插入到pBluescript SK(-)的EcoRI位點，獲得圖11所示的pBluescript SK(-)(D)。連接用EcoRV和XhoI酶切所得質粒pBluescript SK(-)(D)獲得的大約0.3kb的EcoRV-XhoI片段，和用EcoRV和XhoI酶切質粒pBluescript SK(-)(A+B)所得大約3.8kb的EcoRV-XhoI片段，構建成如圖12所示的質粒pBluescript SK(-)(A+B+D)。
接下來連接用限制性酶EcoRI和XhoI酶切質粒pBluescript SK(-)(A+B+D)獲得的大約1.1kb的EcoRI-XhoI片段，及用EcoRI和XhoI酶切動物細胞表達用質粒pcDNA3獲得的大約5.4kb的EcoRI-XhoI片段。獲得圖13所示的促濾泡素抑制素突變體多肽表達質粒pcDNA3(A+B+D)。pcDNA3(A+B+D)中所含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽區域的堿基序列示于序列號23中，該多肽的氨基酸序列示于序列號24中。序列號24中的1～29位的氨基酸序列為信號肽，多肽分泌時被剪切。因此，導入了pcDNA3(A+B+D)的動物細胞分泌包含序列號25的氨基酸序列的促濾泡素抑制素突變體多肽(以下叫做FS1-1-2’)。FS1-1-2’是包含人促濾泡素抑制素的FSN和2個FSI，以小鼠FLRG的FSII樣結構域取代FSII的促濾泡素抑制素突變體多肽。
實施例2應用動物細胞表達、純化促濾泡素抑制素突變體多肽(1)COS-7細胞內表達載體的導入和培養應用實施例1中所得促濾泡素抑制素突變體多肽表達載體pcDNA3(A+B)、pcDNA3(B)、pcDNA3(A+B+C)、pcDNA3(A+B+D)，如下進行動物細胞內促濾泡素抑制素突變體多肽的表達。
通過電穿孔法(Cytotechnology，3，133(1990))將質粒pcDNA3(A+B)導入COS-7(ATCC CRL-1651)細胞中，每1×106細胞應用20μg的質粒。然后懸浮到10ml添加了10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco’s改良Eagle培養基[DMEM，Sigma-Aldrich]中，接種到直徑10cm的細胞培養皿(Corning)中。在5％CO2培養箱內37℃、培養24小時后，換10ml的DMEM培養基，培養3天。在6個細胞培養皿中進行上述培養，回收約60ml的培養上清。同樣將pcDNA3(B)、pcDNA3(A+B+C)及pcDNA3(A+B+D)導入COS-7細胞內，分別回收約60ml的培養上清。
(2)促濾泡素抑制素突變體多肽的純化和檢測將(1)中所得分別表達4種促濾泡素抑制素突變體多肽的COS-7細胞的約60ml的培養上清，過用20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.3mol/L NaCl，0.03％3-[(3-膽酰胺丙基)二乙氨]-1-丙磺酸(CHAPS)平衡過的2ml硫酸化cellulofine柱(生化學工業社)。其后，用共20ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.3mol/L NaCl，0.03％CHAPS洗柱，接著用6ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，0.5mol/L NaCl，0.03％CHAPS洗柱洗滌。其后，用共10ml的20mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，1.0mol/LNaCl，0.03％CHAPS從柱上洗脫吸附的蛋白質。應用Ultrafree-15超濾器(裝著BioMax-10膜的單元，Millipore)按照說明書濃縮該洗脫液，獲得200μl的促濾泡素抑制素突變體多肽溶液。
化學合成人促濾泡素抑制素FSI的部分序列-包含序列號26的氨基酸序列的肽，以該肽作為抗原，按照常規方法[AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)]免疫兔，從抗體效價升高的兔子采集血清，作為兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體。該抗體的類型為IgG。
按照公知的方法[Nature，227，680(1970)]對所得各促濾泡素抑制素突變體多肽進行SDS-PAGE。將電泳的蛋白質轉移到膜(ImmobilonP，Millipore)，用5％脫脂牛奶(Nacalai Tesque)封閉膜，然后與兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體進行反應。用辣根酶標記的大鼠抗兔IgG抗體(Chemicon)和化學發光試劑(ECL檢測試劑，AmershamBioScience)進行檢測。各促濾泡素抑制素突變體多肽均用兔抗促濾泡素抑制素多克隆抗體進行檢測。
圖15中顯示FS1-1的Western Blotting結果。FS1-1包含254個氨基酸構成，推測的分子量約27kD。另一方面，用Western Blotting所得分子量為31kD、33kD、37kD。由于FS1-1有糖基化位點，所以認為因附加了糖鏈而使分子量加大。
實施例3應用報告基因檢驗方法測定促濾泡素抑制素突變體多肽的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性將HEK293細胞(ATCCCRL-1573)接種到24孔培養板中，5×104細胞/孔。在1mL添加了10％FCS、青霉素(100U/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的高葡萄糖型DMEM培養基(Sigma-Aldrich)(以下稱作含血清DMEM培養基)中培養24小時。用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌，轉染報告基因質粒(CAGA)12-MLP-Luc[EMBO J.，17，3091(1998)])(3μg/孔)和內標質粒CMV-β-gal(1g/孔)。轉染在添加了質粒和陽離子脂質體(Transfast，Promega)的混和液的無血清的DMEM培養基(200μl)中進行，細胞在37℃培養2小時。再添加含血清DMEM培養基(1ml)，37℃培養24小時。
用PBS洗滌細胞后，分別添加含(a)激活蛋白(10ng/ml)、(b)GDF-8(15ng/ml)、(c)激活蛋白(10ng/ml)和促濾泡素抑制素(100ng/ml)、(d)GDF-8(15ng/ml)及促濾泡素抑制素(100ng/ml)、(e)激活蛋白(10ng/ml)及促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1溶液5μl、或(f)GDF-8(15ng/ml)及促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1溶液5μl的無血清DMEM培養基200μl/孔，37℃培養24小時。用PBS洗滌后，添加細胞裂解緩沖液[1％9v/v]Triton X-100、15mmol/l MgSO4、4mmol/l乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-4醋酸、1mmol/l DL-二硫蘇糖醇、25mmol/l甘氨酰甘氨酸、pH7.0]100μl/孔，0℃放置15分鐘，制備細胞裂解液。將50μl細胞裂解液與105μl熒光素酶檢測用緩沖液
混合，用熒光分光光度計[MicroLumatLP989，BERTHOLD]測定熒光量。計算從反應開始20秒間的相對光度(RLU)，作為熒光素酶活性。接下來，將35μl細胞裂解液與235μlβ-半乳糖苷酶用緩沖液[1.6mg/ml鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷、60mmol/l Na2HPO4、40mmol/l NaH2PO4、10mmol/l KCl、1mmol/l MgCL2、50mmol/l β-巰基乙醇]混合，用分光光度計[Microplate Reader Benchmark，BIO-RAD]測定吸光度(OD)。根據以下公式，將所給值作為標準化熒光素酶活性，作為轉錄促進活性的指標。
標準化熒光素酶活性＝RLU/OD測定結果如圖16所示。促濾泡素抑制素100％抑制由激活蛋白和GDF-8引起的標準化熒光素酶活性的上升。另一方面，促濾泡素抑制素突變體多肽抑制由GDF-8引起的標準化熒光素酶活性上升的86％，與此相對，抑制因激活蛋白引起的標準化熒光素酶活性上升的僅17％。
對促濾泡素抑制素突變體多肽FS1、FS1-1-3及FS1-1-2’也進行與上述FS1-1同樣的檢驗。其結果示于圖17和圖18，FS1、FS1-1-3與FS1-1同樣，幾乎完全抑制由GDF-8引起的標準化熒光素酶活性的上升，與此相對，幾乎不抑制因激活蛋白引起的標準化熒光素酶活性的上升。但是，FS1比FS1-1、或者FS1-1-3比FS1抑制標準化熒光素酶活性上升的程度更強，3種中FS1-1最能選擇性抑制GDF-8的活性。因此，為了選擇性抑制GDF-8的活性，促濾泡素抑制素突變體多肽中FSI的數目可達2個以上，優選不僅FSII而且FSIII也缺失。此外，FS1-1-2’不僅抑制GDF-8引起的標準化熒光素酶活性的上升，而且抑制因激活蛋白引起的標準化熒光素酶活性的上升。因此，為了選擇性抑制GDF-8的活性，促濾泡素抑制素突變體多肽中優選不含有FSII和FSIII樣結構域。
實施例4過量表達促濾泡素抑制素突變體多肽的小鼠的骨骼肌重量的增加和脂肪量的減少將實施例1中制備的用EcoRI和SacI酶切pcDNA3(A+B)而得的包含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1的DNA的EcoRI-SacI片段，插入到載體pSP72(Promega)的EcoRI位點和SacI位點之間。用EcoRI和SmaI酶切所得質粒，獲得含編碼促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1的DNA的EcoRI-SacI片段，將其插入到存在于MDAF2載體[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，9306(2001)]肌球蛋白輕鏈啟動子的下游的EcoRI位點和SacI位點之間，獲得質粒MDAF2-FS1-1。
分離MDAF2-FS1-1的大約3.7kbp的ClaI片段，顯微注射到221個BDF1小鼠的受精卵中。將狀況良好的受精卵移植到接受小鼠中，自然生產，獲得33只仔鼠。維持確認其基因組DNA中導入了MDAF2-FS1-1來源的DNA的轉基因小鼠的系統。由于肌球蛋白輕鏈啟動子的作用，在轉基因小鼠中促濾泡素抑制素突變體多肽FS1-1在骨骼肌特異高表達。可以觀察到，如此所得轉基因小鼠，其骨骼肌顯著增加。例如，采集14周雄性轉基因小鼠與野生型小鼠的胸大肌、大殿肌、上腕二頭肌，測定其重量，結果如圖19所示。與野生型小鼠相比，轉基因小鼠中，測定的所有骨骼肌的重量均增加。
再測定所得轉基因小鼠的皮下脂肪和內臟脂肪，檢測促濾泡素抑制素突變體多肽對這些脂肪量的影響。分別測定其重量，以占體重的比率(％)為指標。結果，轉基因小鼠，其皮下脂肪和內臟脂肪的量均比野生型小鼠顯著降低。作為示例，圖20中分別顯示了12周齡雌雄轉基因小鼠與12周齡雌性野生型小鼠其與體重相比的皮下脂肪量(％)和內臟脂肪量(％)。野生型小鼠是3只的平均值。與雄性轉基因小鼠同樣，可見其皮下脂肪量和內臟脂肪量顯著減少。需要指出的是，除骨骼肌增加和脂肪減少以外未觀察到其它異常。
實施例5促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區的融合蛋白質對GDF-8特異的功能抑制(1)促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區的融合蛋白質表達載體的制備分別如下制備促濾泡素抑制素突變體多肽FS1和FS1-1與免疫球蛋白恒定區的融合蛋白質的表達載體。
以實施例1中制備的pGEM-T Easy(B)為模板，用含有序列號27和28所示堿基序列的合成DNA(Genset)作引物，各引物分別用10pmol，用與實施例1的基因擴增片段A同樣的條件進行PCR。反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收5’端附加了KpnI位點、3’端附加了BamHI位點、編碼FS1的擴增片段。用KpnI和BamHI酶切所得擴增片段，與用KpnI和BamHI酶切CD5-IgG1載體[Cell，61，1303(1990)]所得包含編碼人IgG1恒定區的基因組序列的KpnI-BamHI片段連接，構建成FS1的C末端融合了人IgG1恒定區的融合蛋白質(以下叫做FS1-Fc)表達質粒pcDNA3FS1-Fc。由于CD5-IgG1載體中，將編碼人IgG1恒定區的序列插入到載體pcDNA3的啟動子下游的XhoI位點-XbaI位點之間，所以pcDNA3FS1-Fc具有插入到pcDNA3的啟動子下游的編碼FS1-Fc的序列的結構。
將實施例1中制備的用EcoRI和EcoRV酶切pBluescript(A+B)所得包含編碼FS1-1序列的片段，插入到載體pSP72(Promega)的EcoRI位點-SmaI位點間。將用EcoRI和BamHI酶切所得質粒得到包含編碼FS1-1序列的片段插入到pBluescriptSK(-)的EcoRI位點-BamHI位點間。用KpnIKpnI和BamHI酶切所得質粒，獲得含編碼FS1-1序列的片段，將該片段與用KpnI和BamHI酶切CD5-IgG1載體所得的包含編碼人IgG1恒定區的基因組序列的KpnI-BamHI片段相連，構建成FS1的C末端融合了人IgG1恒定區的融合蛋白質(以下叫做FS1-1-Fc)表達質粒pcDNA3FS1-1-Fc。pcDNA3FS1-1-Fc具有插入到pcDNA3的啟動子下游的編碼FS1-1-Fc的序列的結構。
(2)表達載體向CHO-K1細胞的導入和培養用脂質體試劑Transfast(Promega)分別將pcDNA3FS1-Fc或pcDNA3FS1-1-Fc導入CHO-K1(ATCCCCL-61)細胞中后，獲得穩定整合了所導入基因的單克隆。將各單克隆懸浮到10ml添加了10％FCS的αMEM培養基中，接種到直徑10cm的細胞培養皿中。5％CO2孵箱內37℃培養到匯合后，換成EX-CELL301培養基(JRHBioScience)，將6個培養皿培養1周，回收大約60ml的培養上清。
(3)FS1-Fc和FS1-1-Fc的純化向(2)中所得分別表達FS1-Fc和FS1-1-Fc的的CHO-K1細胞的培養上清中添加1/10量的肝素cellulofine(生化學工業社)，室溫混和2小時，使蛋白質吸附。用洗滌緩沖液[20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，0.15mol/L NaCl]洗滌肝素cellulofine后，用洗脫緩沖液[20mmol/LTris-HCl(pH 7.4)，1.5mol/L NaCl]洗脫下吸附的蛋白質。應用固化了與免疫球蛋白恒定區特異結合的Protein A的樹脂，按照常規方法，可分別獲得FS1-Fc溶液和FS1-1-Fc溶液。
(4)FS1-Fc和FS1-1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性的驗證分別在(a)僅緩沖液、(b)FS1-Fc(20μg/ml)、(c)激活蛋白(15ng/ml)、(d)激活蛋白(15ng/ml)和FS1-Fc(20μg/ml)、(e)GDF-8(15ng/ml)、(f)GDF-8(15ng/ml)及FS1-Fc(10μg/ml)、(g)GDF-8(15ng/ml)和FS1-Fc(20μg/ml)各條件下，通過進行與實施例3同樣的報告基因檢驗，驗證FS1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性。如圖21所示，FS1-Fc幾乎完全抑制GDF-8造成的標準化熒光素酶活性的上升，相反，幾乎不抑制激活蛋白造成的標準化熒光素酶活性的上升。
同樣，分別在(a)僅緩沖液、(b)FS1-1-Fc(20μg/ml)、(c)激活蛋白(15ng/ml)、(d)激活蛋白(15ng/ml)和FS1-1-Fc(20μg/ml)、(e)GDF-8(15ng/ml)、(f)GDF-8(15ng/ml)及FS1-1-Fc(20μg/ml)各條件下，驗證FS1-1-Fc的激活蛋白和GDF-8功能抑制活性。如圖22所示，FS1-1-Fc幾乎完全抑制GDF-8造成的標準化熒光素酶活性的上升，相反，幾乎不抑制激活蛋白造成的標準化熒光素酶活性的上升。
通過以上結果可以確認促濾泡素抑制素突變體多肽與免疫球蛋白恒定區的融合蛋白質FS1-Fc和FS1-1-Fc、與FS1和FS1-1同樣能選擇性抑制GDF-8的活性。
產業上利用的可能性本發明提供促濾泡素抑制素突變體多肽，與對激活蛋白活性的抑制相比，它能選擇性抑制GDF-8的活性。該促濾泡素抑制素突變體多肽可用于骨骼肌的增加和脂肪的減少。此外，可用于肌肉萎縮癥的治療、惡液質、伴隨肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療。
序列表<110>Techno Network Shikoku Co.，Ltd.
<110>Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd.
<120>促濾泡素抑制素突變體多肽<130>A51236A<150>JP 2004-120023<151>2004-04-15<150>JP 2004-355293<151>2004-12-08<160>29<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>70<212>PRT<213>人工的<220>
<223>促濾泡素抑制素結構域I共有序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa是Glu或Asp<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>Xaa是Arg或Lys<220>
<221>misc_feature
<222>(69)..(69)<223>Xaa是Lys或Arg<220>
<223>發明人Tsuchida，Kunihiro；Murakami，Tatsuya<400>1Cys Xaa Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Xaa Met Asn Lys1 5 10 15Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr20 25 30Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu35 40 45Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val50 55 60Gln Tyr Gln Gly Xaa Cys65 70<210>2<211>72<212>PRT<213>人工的<220>
<223>促濾泡素抑制素結構域II共有序列<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature
<222>(33)..(33)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(35)..(35)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(45)..(45)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<220>
<221>misc_feature<222>(48)..(48)<223>Xaa可以是除Cys外任何天然存在的氨基酸<400>2Cys Arg Asp Val Xaa Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val Asp Gln1 5 10 15Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro20 25 30Xaa Ser Xaa Glu Gln Xaa Leu Cys Gly Asn Asp Gly Xaa Thr Tyr Xaa35 40 45Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile50 55 60
Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys65 70<210>3<211>1035<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1035)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>3atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag act tgt cgg gat gtt ttc tgt cca ggc agc 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser165 170 175tcc aca tgt gtg gtg gac cag acc aat aat gcc tac tgt gtg acc tgt 576Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys180 185 190aat cgg att tgc cca gag cct gct tcc tct gag caa tat ctc tgt ggg 624Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly195 200 205aat gat gga gtc acc tac tcc agt gcc tgc cac ctg aga aag gct acc 672Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220tgc ctg ctg ggc aga tct att gga tta gcc tat gag gga aag tgt atc 720Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile225 230 235 240aaa gca aag tcc tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt 768Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys245 250 255tta tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag 816Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu260 265 270ctg tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat 864Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn275 280 285gcc act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca 912Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser290 295 300ggt gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg 960Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser305 310 315 320gaa gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt 1008Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe325 330 335cct ata tct tct att cta gag tgg taa 1035Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp340<210>4<211>344
<212>PRT<213>智人<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>4Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys180 185 190Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly195 200 205Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr210 215 220Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile225 230 235 240Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys245 250 255Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu260 265 270Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn275 280 285Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser290 295 300Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser305 310 315 320Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe325 330 335Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp340<210>5<211>678<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>FS-1-1<220>
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<223>FS-1-1-3<220>
<221>CDS<222>(1)..(936)<400>9ggg aac tgc tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg 48Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15tac aag acc gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg 96Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30agc acc tcg tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag 144Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45tgg atg att ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa 192Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60acg tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac 240Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc 288Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat 336Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa 384Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125
gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt 432Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc 480Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc 528Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca 576Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt 624Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205aaa aag act tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta 672Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu210 215 220tgg gat ttc aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg 720Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu225 230 235 240tgc cct gac agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc 768Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala245 250 255act tat gcc agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt 816Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly260 265 270
gtg cta ctg gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa 864Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu275 280 285gac acc gag gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct 912Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro290 295 300ata tct tct att cta gag tgg taa 936Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp305 310<210>10<211>311<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FS-1-1-3<400>10Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile
85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu210 215 220Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu225 230 235 240Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala245 250 255Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly260 265 270Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu275 280 285Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro290 295 300
Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp305 310<210>11<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段A的引物<400>11gcaagctttg tgagaacgtg gactgtg 27<210>12<211>37<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段A的引物<400>12gcctcgagat atcttcacaa gtctttttac atctgcc37<210>13<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段B的引物<400>13cggaattcat ggtccgcgcg aggcaccag 29<210>14
<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段B的引物<400>14cgaagctttt tacatctgcc ttgg 24<210>15<211>765<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(765)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>15atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576
Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc tcg agg caa tca cta gag ggc cct att cta tag 765Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu245 250<210>16<211>254<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>16Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240
Cys Glu Asp Ile Ser Arg Gln Ser Leu Glu Gly Pro Ile Leu245 250<210>17<211>567<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1<220>
<221>CDS<222>(1)..(567)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>17atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60
tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt atc gat acc gtc gac ctc gag cat gca 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala165 170 175tct aga ggg ccc tat tct ata gtg tca cct aaa tgc tag 567Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys180 185<210>18<211>188<212>PRT
<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>18Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Ile Asp Thr Val Asp Leu Glu His Ala165 170 175Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys180 185<210>19<211>1023<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1-3<220>
<221>CDS<222>(1)..(1023)<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>19atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624
Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc cag tgc act ggt ggg aaa aaa tgt tta tgg gat ttc 768Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe245 250 255aag gtt ggg aga ggc cgg tgt tcc ctc tgt gat gag ctg tgc cct gac 816Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp260 265 270agt aag tcg gat gag cct gtc tgt gcc agt gac aat gcc act tat gcc 864Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala275 280 285agc gag tgt gcc atg aag gaa gct gcc tgc tcc tca ggt gtg cta ctg 912Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu290 295 300gaa gta aag cac tcc gga tct tgc aac tcc att tcg gaa gac acc gag 960Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu305 310 315 320gaa gag gag gaa gat gaa gac cag gac tac agc ttt cct ata tct tct 1008Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser325 330 335att cta gag tgg taa 1023
Ile Leu Glu Trp340<210>20<211>340<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1-3<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>20Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser AsnIle Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys Leu Trp Asp Phe245 250 255Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu Leu Cys Pro Asp260 265 270Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn Ala Thr Tyr Ala275 280 285Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser Gly Val Leu Leu290 295 300Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser Glu Asp Thr Glu305 310 315 320Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe Pro Ile Ser Ser325 330 335
Ile Leu Glu Trp340<210>21<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段D的引物<400>21ccggaattct gtcaaaagtc ttgc 24<210>22<211>39<212>DNA<213>人工的<220>
<223>片段D的引物<400>22ccggaattcc tcgagtcaca cgaagttctc ttcctcctc 39<210>23<211>1017<212>DNA<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1-2’<220>
<221>CDS<222>(1)..(1017)
<220>
<221>sig_peptide<222>(1)..(87)<400>23atg gtc cgc gcg agg cac cag ccg ggt ggg ctt tgc ctc ctg ctg ctg 48Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu1 5 10 15ctg ctc tgc cag ttc atg gag gac cgc agt gcc cag gct ggg aac tgc 96Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30tgg ctc cgt caa gcg aag aac ggc cgc tgc cag gtc ctg tac aag acc 144Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45gaa ctg agc aag gag gag tgc tgc agc acc ggc cgg ctg agc acc tcg 192Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60tgg acc gag gag gac gtg aat gac aac aca ctc ttc aag tgg atg att 240Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80ttc aac ggg ggc gcc ccc aac tgc atc ccc tgt aaa gaa acg tgt gag 288Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95aac gtg gac tgt gga cct ggg aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac 336Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag 384Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125ggt cca gtc tgc ggg ctg gat ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca 432Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140ctc cta aag gca aga tgt aaa gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac 480Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160caa ggc aga tgt aaa aag ctt tgt gag aac gtg gac tgt gga cct ggg 528Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175aaa aaa tgc cga atg aac aag aag aac aaa ccc cgc tgc gtc tgc gcc 576Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190ccg gat tgt tcc aac atc acc tgg aag ggt cca gtc tgc ggg ctg gat 624Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205ggg aaa acc tac cgc aat gaa tgt gca ctc cta aag gca aga tgt aaa 672Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220gag cag cca gaa ctg gaa gtc cag tac caa ggc aga tgt aaa aag act 720Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240tgt gaa gat atc gaa ttc tgt caa aag tct tgc gct cag gta gtg tgc 768Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys245 250 255ccg cgt ccc cag tcg tgc ctt gtg gat cag acc ggc agc gca cac tgc 816Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys
260 265 270gtg gtg tgt cgc gct gcg ccc tgc cca gta cct tcc aac ccc ggc caa 864Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln275 280 285gaa ctc tgt ggc aac aac aac gtt acc tac atc tcg tcg tgt cac ctg 912Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu290 295 300cgc cag gcc act tgc ttc ctg ggc cgc tcc att ggg gtt cgg cac cca 960Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro305 310 315 320ggc atc tgc aca ggt ggc ccc aaa gta cca gca gag gag gaa gag aac 1008Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn325 330 335ttc gtg tga 1017Phe Val<210>24<211>338<212>PRT<213>人工的<220>
<223>帶有信號肽的FS-1-1-2’<220>
<221>SIGNAL<222>(1)..(29)<400>24Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys20 25 30Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr35 40 45Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser50 55 60Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile65 70 75 80Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu85 90 95Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn100 105 110Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys115 120 125Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala130 135 140Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr145 150 155 160Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly165 170 175Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala180 185 190Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp195 200 205Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys210 215 220
Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr225 230 235 240Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln Val Val Cys245 250 255Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys260 265 270Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn Pro Gly Gln275 280 285Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Leu290 295 300Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Pro305 310 315 320Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu Glu Glu Asn325 330 335Phe Val<210>25<211>309<212>PRT<213>人工的<220>
<223>FS-1-1-2’<400>25Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu1 5 10 15Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu20 25 30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys35 40 45Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu50 55 60Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn65 70 75 80Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile85 90 95Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn100 105 110Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu115 120 125Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys Lys Lys Leu Cys Glu Asn Val Asp Cys130 135 140Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys145 150 155 160Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys Gly Pro Val Cys165 170 175Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala Leu Leu Lys Ala180 185 190Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg Cys195 200 205Lys Lys Thr Cys Glu Asp Ile Glu Phe Cys Gln Lys Ser Cys Ala Gln210 215 220Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln Thr Gly Ser225 230 235 240Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Asn
245 250 255Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser260 265 270Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val275 280 285Arg His Pro Gly Ile Cys Thr Gly Gly Pro Lys Val Pro Ala Glu Glu290 295 300Glu Glu Asn Phe Val305<210>26<211>12<212>PRT<213>智人<400>26Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr Gln Gly Arg1 5 10<210>27<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>FS1-Fc的引物<400>27aagggtacca tggtccgcgc gaggcaccag30<210>28<211>26<212>DNA
<213>人工的<220>
<223>FS1-Fc的引物<400>28tcgggatcca cgcagcgggg tttgtt26<210>29<211>73<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<400>29Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Arg Pro Gln Ser Cys Leu Val Asp Gln1 5 10 15Thr Gly Ser Ala His Cys Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val20 25 30Pro Ser Asn Pro Gly Gln Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr35 40 45Ile Ser Ser Cys His Leu Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser50 55 60Ile Gly Val Arg His Pro Gly Ile Cys65 70
權利要求
1.一種促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)包含促濾泡素抑制素結構域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號2或序列號29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數；(c)與抑制激活蛋白的活性相比，它選擇性抑制GDF-8的活性。
2.權利要求1中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包含促濾泡素抑制素結構域I，缺失促濾泡素抑制素結構域II。
3.權利要求1或2中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它也不包括促濾泡素抑制素結構域III。
4.權利要求1～3任一項中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括2個以上的促濾泡素抑制素結構域I。
5.權利要求1～4任一項中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它還包括N端結構域。
6.權利要求1或2中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括選自FSI、FSI-FSI、FSI-FSI-FSIII、FSN-FSI、FSN-FSI-FSI或FSN-FSI-FSI-FSIII的任一結構域結構，其中FSI表示促濾泡素抑制素結構域I，FSIII表示促濾泡素抑制素結構域III，FSN表示N端結構域，各結構域間可直接相連，或通過連接肽連接。
7.權利要求1～6任一項中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結構域I是包含序列號1中氨基酸序列的多肽。
8.權利要求7中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，它包括序列號4中30～166位的氨基酸序列。
9.權利要求1～8任一項中所述的促濾泡素抑制素突變體多肽，其中促濾泡素抑制素結構域的氨基酸序列的N端或C端融合了其它多肽。
10.一種多肽，其包含序列號6、8或10中的氨基酸序列。
11.一種多聚核苷酸，它編碼權利要求1～10任一項中的多肽。
12.權利要求11中所述的多聚核苷酸，它包括序列號5、7或9中的堿基序列。
13.一種載體，它包括權利要求11或12中所述的多聚核苷酸。
14.一種轉化體，它是將權利要求13中的載體導入宿主細胞而得的。
15.一種多肽的制備方法，其特征在于，在培養基中培養權利要求14中的轉化細胞，使該細胞中表達的權利要求1～10任一項中的多肽在培養基或該細胞中蓄積，從培養基或該細胞中收集該多肽。
16.一種GDF-8的選擇性抑制劑，它含有權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體，且其不抑制激活蛋白。
17.一種醫藥組合物，它含有權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
18.一種骨骼肌增加劑，它含有作為有效成分的權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
19.一種脂肪減少劑，它含有作為有效成分的權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
20.一種肌肉萎縮癥的治療劑或預防劑，它含有作為有效成分的權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
21.一種伴隨有惡液質、肌肉萎縮的疾病、II型糖尿病、肥胖或獲得性免疫缺陷綜合癥的治療劑或預防劑，它含有作為有效成分的權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
22.權利要求21中所述的治療劑或預防劑，其中伴隨有肌肉萎縮的疾病是遺傳性的肌營養不良、肌肉萎縮性側索硬化癥、脊髓小腦變性癥或帕金森病。
23.一種轉基因非人哺乳動物，它導入了含權利要求11或12中多聚核苷酸的外來基因。
24.一種增加非人動物肌肉的方法，它向非人動物中施用了權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
25.一種減少非人動物脂肪的方法，它向非人動物中施用了權利要求1～10任一項中的多肽，權利要求11或12中所述的多聚核苷酸或者13中所述的載體。
26.一種驗證待檢物質對激活蛋白及GDF-8的功能抑制活性的方法，它包括在激活蛋白、GDF-8、激活蛋白和待檢物質或GDF-8和待檢物質存在的條件下培養具有報告基因質粒的細胞，并檢測報告基因。
27.權利要求26所述的方法，其中使用熒光素酶作為報告基因。
28.權利要求26或27所述的方法，其中使用促濾泡素抑制素突變體多肽作為待檢物質，所述促濾泡素抑制素突變體多肽(a)包含促濾泡素抑制素結構域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys-(X1)a-Cys-(X2)b-Cys-(X3)c-Cys-(X4)d-Cys-(X5)e-Cys-(X6)f-Cys-(X7)g-Cys-(X8)h-Cys-(X9)i-Cys所示且與序列號2或序列號29中的氨基酸序列有50％以上同源性，式中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8及X9各自獨立，相同或不同，代表半胱氨酸以外的天然存在的氨基酸殘基，a代表2～6、b代表3～7、c代表7～11、d代表0～4、e代表1～6、f和g代表8～12、h代表4～8、i代表11～15的整數。
全文摘要
本發明的目的是提供不抑制激活蛋白的活性而特異性抑制GDF－8活性的促濾泡素抑制素的突變體。本發明提供促濾泡素抑制素突變體多肽，其特征在于(a)包含促濾泡素抑制素結構域I；(b)不包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列如式(I)Cys－(X
文檔編號A61K48/00GK1993463SQ20058001986
公開日2007年7月4日 申請日期2005年4月15日 優先權日2004年4月15日
發明者土田邦博, 村上達也 申請人:四國技術網絡株式會社