激活素iib受體多肽的變異體及其用途的制作方法

專利名稱：激活素iib受體多肽的變異體及其用途的制作方法
技術領域：
本發明的技術領域涉及轉化生長因子-β (TGF-β)家族成員和性能改進的可溶性TGF-β受體，以及調節用于治療各種障礙的TGF-β家族成員活性的方法。
背景技術：
蛋白的轉化生長因子β (TGF-β)家族包括轉化生長因子-β (TGF-β)、激活素、 骨形態發生蛋白(BMP)、神經生長因子(NGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)和生長/分化因子(⑶F)。這些家庭成員都與包括細胞增殖、分化和其它功能的各種不同的生物進程有關。生長/分化因子8 (⑶F-8)，也稱為肌肉生長抑制素(myostatin)，是大部分在發育細胞和和成人骨骼肌組織中表達的TGF-β家族成員。肌肉生長抑制素似乎在負控制骨骼肌生長中的起著關鍵作用(McPherron et al. , Nature (London) 387,83-90 (1997), Zimmers et al. , Science 296 :1486-1488 (2002)) 0拮抗肌肉生長抑制素已被證明增加動物的瘦肌肉質量。蛋白的另一種TGF- β家族成員是一種相關的生長/分化因子，即生長/分化因子 11(⑶F-11)。⑶F-Il與肌肉生長抑制素的氨基酸序列具有約90%的序列同一性。⑶F-Il 在發育動物的軸向模式中發揮作用(Oh et al. ,Genes Dev 11 181246 (1997))，也似乎在骨骼肌發育和生長中發揮作用。激活素A、B和AB分別是兩種多肽鏈的同源二聚體和異源二聚體 (Vale et al. ， Nature 321,776-779(1986)， Ling et al. ， Nature 321,779-782(1986))。 最初發現激活素是在與促卵泡成熟激素刺激性腺合成有關的調控中作為性腺肽，而現在認為其與許多生物活性的調節有關。激活素A是激活素的主要形式。激活素、肌肉生長抑制素、⑶F-Il和TGF-β超家族的其它成員通過激活素II型和激活素IIB型受體的雙重作用結合和發送信號，這兩者都是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶 (Harrison et al. , J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)) 交聯研究已經確定肌肉生長抑制素能夠與激活素II型受體(ActRIIA和ActRIIB)在體外結合(Lee et al.，PNAS USA 98 :9306-11(2001)) ο 還有證據表明，GDF-Il 既與 ActRIIA 結合，又與 ActRIIB 結合(Oh et al.，Genes Dev 16 :2749-54(2002))。已知TGF-β蛋白表達與各種疾病和障礙有關。因此，一些能夠拮抗TGF-β蛋白的治療性分子可同時，特別是對治療這些疾病和障礙有效。治療性蛋白的大規模制備，需要在不破壞蛋白完整性的情況下可高效表達和純化的蛋白。可制備性，可以描述為以充分有效的方式表達和純化蛋白的能力，以便制備符合效率高成本低的蛋白。在大規模制備中，必須確定每個潛在治療性蛋白的可制備性。雖然蛋白表達和純化過程可使蛋白最優化，可制備性似乎也是蛋白固有性質的功能。本發明提供了可制備性改善的具有生物活性的治療性蛋白，能夠有效地拮抗TGF-β蛋白。發明概述本發明提供了包含能夠結合激活素、GDF-Il和肌肉生長抑制素并抑制其活性的穩定的人激活素受體IIB(指定svActRIIB)多肽的分離蛋白，其特征在于具有改善的可制備性。穩定的ActRIIB多肽的特征在于相對于SEQ ID NO :2在觀位和44位都具有氨基酸置換。在一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述分離蛋白包含具有SEQ ID N0:2所示序列的多肽，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸19至134所示的序列，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列，其中觀位的置換選自W或Y，44 位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸25至134所示的序列，其中觀位的置換選自W或 Y，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，所述多肽具有與上述任一多肽有至少80%、85%、 90 %、95 %、98 %或99 %同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的28位和44位具有單氨基酸置換，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、 激活素A或⑶F-Il結合。在一個實施例中，上述多肽的觀位的置換為W，44位的置換為Τ， 且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述分離蛋白包含穩定的激活素IIB受體多肽，其中所述多肽具有由SEQ ID N0:4、6、12和14組成的組所示的序列。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與SEQ ID N0:4、6、12或14至少80%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與SEQ ID N0:4、6、12或14至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il結合。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與SEQ ID N0:4、6、12或14 至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，所述觀位的置換為 W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在又一個實施例中，所述svActRIIB蛋白還包含異源蛋白。在一個實施例中，所述異源蛋白為Fc結構域。在又一個實施例中，所述Fc結構域為人IgG Fc結構域。在又一個實施例中，所述異源蛋白是通過連接子或鉸鏈連接肽結合。在一個實施例中，所述連接子或鉸鏈連接子選自由SEQ ID NO :25、27、38、40、42、44、45、46、48、49和50組成的組所示的氨基酸序列組成的組。在又一個實施例中，SEQ ID NO :27、38、40、42、44、45或46所示的鉸鏈連接子連接人IgG2Fc(SEQ ID NO :22)與svActRIIB多肽。在另一個實施例中，SEQ ID NO: 48、49或50所示的鉸鏈連接子連接人IgG2Fc(SEQ ID NO 23)或修飾IgGlFc (SEQ ID NO: 47)與 svActRIIB 多月太。
在又一個實施例中，所述蛋白包含具有由SEQ ID N0:8、10、16和18組成的組所示的序列的多肽。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與SEQ ID N0:8、10、16或18至少 80%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與 SEQ ID NO :8、10、16或18至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y， 44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述蛋白包含具有與SEQ ID N0:8、10、16或18至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-11結合。在又一個實施例中，上述多肽的觀位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在又一個實施例中，所述蛋白包含上述的多肽，其中64位的氨基酸殘基是丙氨酸。在另一方面，本發明提供了一種分離核酸分子，所述核酸分子包含編碼穩定的 ActRIIB多肽的多核苷酸。在一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO :2所示的多肽序列，其中觀位的置換選自W或Y， 44位的置換為T。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸19至134所示序列的多肽，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為T。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44 位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示序列的多肽，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為T。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸 25至134所示序列的多肽，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，所述多核苷酸編碼與上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的28位具有單氨基酸置換，44位具有單氨基酸置換，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、 激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，上述多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，所述核酸分子包含編碼具有由SEQ ID NO :4、6、12和14組成的組所示序列的多肽的多核苷酸。在另一個實施例中，所述核酸分子包含編碼與SEQ ID NO 4、6、12或14具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或 Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述核酸分子包含編碼與SEQ ID N0:4、6、12或14具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il結合。在另一個實施例中，所述核酸分子包含編碼與SEQ ID NO :4,6,12或14具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，上述多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中，所述核酸分子包含具有選自由SEQ ID N0:3、5、ll和13或其互補序列組成的組的序列的多核苷酸。在另一個實施例中，所述分離核酸分子包含以上所示的多核苷酸，進一步包含編碼至少一種異源蛋白的多核苷酸。在一個實施例中，所述核酸分子包含編碼具有由SEQ ID N0:8、10、16和18組成的組所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一個實施例中，所述核酸分子包含編碼與SEQ ID NO :8、10、16或18具有至少80%序列同一性的多肽的多核苷酸， 其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il結合。在另一個實施例中，所述核酸分子包含編碼與SEQ ID NO :8、10、16或 18具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在另一個實施例中， 所述核酸分子包含編碼與SEQ ID N0:8、10、16或18具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，上述多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-11結合。 在又一個實施例中，所述核酸分子包含具有選自由SEQ ID N0:7、9、15和17或其互補序列組成的組的序列的多核苷酸。在另一個實施例中，所述核酸分子進一步包含編碼由SEQ ID NO :25、27、38、40、 42、44、45、46、48、49和50組成的組所示的連接子和鉸鏈連接子的多核苷酸。在又一個實施例中，所述核酸分子進一步包含一種轉錄或翻譯調控序列。在另一方面，本發明提供了一種包含編碼穩定的ActRIIB蛋白或多肽的多核苷酸的重組載體。在另一方面，本發明提供了包含重組載體的宿主細胞，還提供了在促進蛋白或多肽表達條件下通過培養宿主細胞制備穩定的ActRIIB蛋白和多肽的方法。本發明進一步提供了一種含有至少一種穩定的ActRIIB多肽或蛋白的組合物。在一個實施例中，所述組合物是一種含有混合藥學上可接受的載體的穩定的ActRIIB多肽或蛋白的藥物組合物。在另一方面，本發明提供了一種通過向需要治療的受試者給予svActRIIB蛋白和多肽或含有這些的藥物組合物來降低或阻斷肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il的活性的方法。在另一方面，本發明提供了一種通過向需要治療的受試者給予有效量的含有 svActRIIB蛋白或多肽的組合物或藥物組合物來增加瘦肌肉質量或增加瘦肌肉質量與脂肪質量之比的方法。在另一方面，本發明提供了一種通過向受試者給予含有svActRIIB多肽或蛋白的治療性組合物治療或預防治療患有肌肉萎縮疾病(muscle wasting disease)的受試者的方法。所述肌肉萎縮疾病包括，但不限于以下病癥癌癥惡病質、肌肉萎縮癥、肌萎縮側索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、化學惡病質、HIV/AIDS惡病質、腎衰竭、尿毒癥、類風濕性關節炎、年齡相關少肌癥(age-related sarcopenia)、老年性衰弱、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪(androgen deprivation)及由于長期臥床休養、脊髓損傷、中風、骨折、 燒傷、老化、抗胰島素性和其它障礙引起的肌肉萎縮。所述肌肉萎縮還可能是由太空飛行失重導致的。在另一方面，本發明提供了一種通過向受試者給予有效量的含有svActRIIB蛋白或多肽的治療性組合物治療激活素在需要這種治療的受試者中過表達的病癥的方法。在一個實施例中，所述疾病是癌癥。在另一方面，本發明提供一種治療代謝障礙的方法，所述方法包括向需要這種治療的受試者給予含有svActRIIB蛋白或多肽的治療性組合物，其中所述代謝障礙選自骨丟失、糖尿病、肥胖癥、糖耐量減低、高血糖癥和代謝綜合癥。在另一方面，本發明提供了一種用于治療肌肉萎縮或代謝或激活素相關病癥的基因治療方法，所述方法包括向需要治療的受試者給予編碼本發明的svActRIIB蛋白或多肽的載體，其中所述載體能夠在受試者中表達svActRIIB蛋白或多肽。在另一方面，本發明提供了一種通過在許多實驗中使用任何svActRIIB蛋白或多肽作為為捕捉劑或結合劑來檢測并量化肌肉生長抑制素、激活素或GDF-Il的方法。附圖
簡要說明圖 1 顯示了 SEC 柱上 ActRIIB-Fc (E28W)與 svActRIIB-Fc (E28W, S44T)之間的對比。與顯示 3 個峰的 ActRIIB-Fc (E^W)相比，svActRIIB-Fc (E28W，S44T)顯示了 1 個單峰。圖2顯示了相比于施用10mg/kg PBS的10只小鼠，施用單劑量為10mg/kg svActRIIB-Fc (E28W, S44T)的10只C57B1/6小鼠在14日期間體重有所增加。圖3 顯示了接受單劑量為 0. ;3mg/kg、3mg/kg、10mg/kg 和 30mg/kg 的 svActRIIB-Fc (E28W, S44T)的C57BL/6的瘦體重隨時間的劑量相關性變化。發明詳述本發明提供了一種包含穩定的人激活素IIB受體(svActRIIB)多肽的分離蛋白。 本發明的蛋白和多肽是以它們與至少三種TGF-β蛋白(肌肉生長抑制素(GDF-8)、激活素 A或⑶F-11)結合的能力為特征，以抑制這些蛋白中至少一種的活性，并比其它ActRIIB可溶性受體具有改善的可制備性。穩定的人激活素IIB受體多肽的特點是SEQ ID N0:2所示的關于ActRIIB胞外域的E^位和S44位的氨基酸置換。在一個實施例中，穩定的人激活素IIB受體多肽進一步可以相對于SEQ ID NO 2在64位具有丙氨酸置換。本文所用的術語“TGF-β家族成員”或“TGF-β蛋白”是指轉化生長因子家族的結構相關生長因子，所述轉化生長因子家族包括激活素、生長和分化因子(GDF)蛋白 (Kingsley et al. Genes Dev. 8 133-146(1994),McPherron et al·,Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. IB,D. LeRoith禾口C. Bondy. ed. , JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA :pp 357-393)。⑶F-8，也被稱為肌肉生長抑制素，是骨骼肌組織的負調控因子(McPherron et al. PNAS USA 94 1M57-1M61 (1997))。生長抑制素是以約為375個氨基酸長、具有人基因庫登錄號AAB86694(SEQ ID NO 35)的失活蛋白合成的。所述前體蛋白是通過四元加工位點的蛋白酶裂解得到激活，以制備N-末端失活的前域和約109個氨基酸的C-端蛋白，其中所述C-端蛋白二聚化形成約25kDa的同源二聚體。這種同源二聚體是成熟的生物活性蛋白(Zimmers et al.，Science 296,1486 (2002)) 本文所用的術語“前域”或“前肽”是指失活的N-末端蛋白，其裂解以釋放活性 C-末端蛋白。本文中所用的術語“肌肉生長抑制素”或“成熟的肌肉生長抑制素”是指成熟的生物活性C-端多肽，以單體、二聚體或其它形式，以及生物活性片段或包括等位基因變異體、剪接變異體、融合肽和多肽的相關多肽形式存在。據報道，成熟的肌肉生長抑制素已在括人、小鼠、雞、豬、火雞和大鼠的許多物種間具有100%的序列同一性(Lee et al.，PNAS98,9306(2001)) ο本文所用的⑶F-Il是指具有Swissprot登錄號為095390 (SEQ ID NO 36)的 BMP (骨形態發生蛋白)，以及該蛋白的變異體和物種同源。GDF-Il與中軸骨的前/后模式的調節有關(McPherron et al,Nature Genet. 22(93) :260-264(1999) ；Gamer et al,Dev. Biol. 208 (1)，222-232 (1999))，但出生后的功能未知。激活素A是多肽鏈β A的同源二聚體。本文中所用的術語“激活素Α”是指具有基因庫登錄號NM_002192 (SEQ ID NO :34)的激活蛋白。激活素A、B和AB分別是兩條多肽鏈 (βΑ和βΒ)的同源二聚體和異源二聚體。本文中所用的“激活素”是指激活素Α、Β和ΑΒ， 以及該蛋白的變異體和物種同源。受體多肽本文所用的術語激活素IIB型受體(ActRIIB)是指具有登錄號ΝΡ_001097的人激活素受體或其變異體，如64位使用丙氨酸取代精氨酸的那些受體。術語可溶性ActRIIB (野生型)是指ActRIIB的胞外域，1位至134位的氨基酸(有信號序列)，或SEQ ID NO 2中 19位至134位的氨基酸(無信號序列)。穩定的受體多肽本發明提供了一種分離蛋白，所述分離蛋白包含穩定的ActIIB受體多肽(本文稱為“svActRIIB多肽”)。本文所用的術語“svActRIIB蛋白”是指包含穩定的ActRIIB多肽的蛋白。本文所用的術語“分離的”是指從內源性物質純化到一定程度的蛋白或多肽分子。 這些多肽和蛋白的特點是除了改善可制備性外，具有結合并抑制激活素A、肌肉生長抑制素或⑶F-Il中任何一種的能力。穩定的ActRIIB多肽的特點是SEQ ID NO 2的28位和44位具有氨基酸置換。為了保持一致性，無論多肽是否成熟或截短，穩定的ActRIIB多肽和蛋白的氨基酸位置通常被稱為關于SEQ ID NO :2的位置。本文所用的術語“成熟”是指沒有信號序列的多肽或肽。 本文所用的術語“截短”是指具有刪除N末端或C末端氨基酸的多肽。在一個實施例中，除了 28位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述分離的穩定激活素IIB受體激活多肽(svActRIIB)具有SEQ ID NO :2所示的多肽序列，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為T。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示的序列，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多肽具有SEQ ID NO 2的氨基酸25至 Π4所示的序列，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，所述多肽具有與上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的28位具有單氨基酸置換，44位具有單氨基酸置換，其中28位的置換選自W或Y，44位的置換為Τ，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il結合。在一個實施例中，上述多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為Τ， 其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，所述svActRIIB多肽包括信號序列，例如，SEQ ID NO :4,8,12和16。然而，各種信號肽可用于即時應用的多肽制備中。所述信號肽可以具有SEQ ID NO 4中1至19位氨基酸所示的序列(例如)或SEQ ID NO 31和32所示的信號序列。用于表達svActRIIB多肽的任何其它信號肽可能用到。在其它實施例中，所述信號序列被刪除， 留下成熟肽。缺乏信號序列的svActRIIB多肽的實例包括(例如)SEQ ID N0:6、10、14和 18。在一個實施例中，所述蛋白包含穩定的激活素IIB受體多肽，其中所述多肽選自由具有SEQ ID N0:4、6、12和14組成的組所示的序列的多肽組成的組。這些多肽表示SEQ ID NO :2中25位至134位的氨基酸，其中所述多肽的28位具有單氨基酸置換，44位具有單氨基酸置換，其中觀位的置換選自W或Y，44位的置換為T，且其中所述多肽能夠與含有或不含有不同于SEQ ID NO :2所示的信號序列的肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。 在另一個實施例中，所述蛋白包含與SEQ ID NO :4、6、12或14具有至少80%、85%、90%、 95 %、98 %或99 %序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中二8位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在又一個實施例中，所述svActRIIB蛋白進一步包含異源蛋白。在一個實施例中， 所述異源蛋白為Fc結構域。在又一個實施例中，所述Fc結構域為人IgG Fc結構域。在一個實施例中，所述蛋白包含具有由SEQ ID N0:8、10、16和18組成的組所示的序列的多肽。 在另一個實施例中，所述蛋白包含與SEQ ID而8、10、16或18具有至少80%、85%、90%、 95^^98%或99%序列同一性的多肽，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中二8位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在又一個實施例中，所述蛋白包含上述任何一種多肽，其中64位的氨基酸殘基為丙氨酸。在另一個實施例中，術語svActRIIB多肽和蛋白包括包含SEQ ID N0:2、4、6、12和 14片段的蛋白，其中包括N和C末端截斷，其中28位為W或Y，44位為T，且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。本文所用的術語svActRIIB多肽的“衍生物”是指至少一種其它化學基團或至少一種其它多肽結合，以形成共價或聚集共軛物，如糖基、脂質、乙酰基，或者C-末端或N-末端融合多肽，PEG分子共軛物，以及以下詳細說明的其它修飾物。穩定的ActRIIB受體多肽還可以包括其它修飾物和衍生物，其中包括由于在各種細胞類型(如哺乳動物細胞、大腸桿菌、酵母和其它重組宿主細胞)中表達而加工產生的C和N末端修飾。本發明的svActRI IB蛋白可進一步包含直接或通過連接子序列與svActRI IB多肽結合以形成融合蛋白的異源多肽。本文所用的術語“融合蛋白”是指具有通過重組DNA技術結合的異源多肽的蛋白。異源多肽包括但不限于Fc多肽，其標簽和亮氨酸拉鏈域，以促進寡聚化和使本文所述的穩定的ActRIIB多肽進一步穩定化，例如，WO 00Λ9581，它們的全部內容通過引用并入本文。在一個實施例中，異源多肽是Fc多肽或結構域。在一個實施例中，Fc 結構域選自人 IgGl Fc (SEQ ID NO :23)、修飾的 IgGl Fc (SEQ ID NO :47)、IgG2 Fc (SEQ ID NO :22)和 IgG4 Fc (SEQ ID NO :24)結構域。svActRIIB 蛋白可以進一步包含 IgGl (SEQ ID NO :29)、IgG2(SEQID NO :28)或 IgG4 (SEQ ID NO :30)的鉸鏈序列的全部或部CN 102245634 A
說明書
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分。典型的svActRIIB多肽選自由SEQ ID NO :8、10、16和18所示的序列組成的多肽以及與這些序列具有基本上相似的多肽，其中觀位和44位的置換被保留。本文所用的術語“基本上相似”是指與任何SEQ ID N0:8、10、16和18具有至少80%同一性、85%同一性、90% 同一性、95%同一性、96%同一性、97%同一性、98%同一性、99%同一性的序列，其中所述多肽的28位保留了 W或Y，44位保留了 T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A 或⑶F-Il結合。在一個實施例中，觀位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il結合。svActRIIB多肽可以選擇地進一步包含“連接子”序列。連接子主要作為一個多肽和又一個異源多肽之間或其它類型的融合或兩種或多種穩定的ActRIIB多肽之間的間隔基團。在一個實施例中，所述連接子是由氨基酸通過肽鍵連接在一起構成，優選為1至 20個氨基酸通過肽鍵連接，其中所述氨基酸選自20個天然氨基酸。本領域的普通技術人員認為一個或多個氨基酸可能是糖基化的。在一個實施例中，1至20個氨基酸可以選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。在一個實施例中，連接子是由立體不受阻礙的大多數氨基酸(如甘氨酸和丙氨酸)構成。典型的連接子是聚甘氨酸(特別是(Gly)5、(Gly)8、聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸)。以下實例所示的一個典型的合適連接子是(Gly)4Ser (SEQ ID NO :25)。在又一個實施例中，svActRIIB可以包含“鉸鏈連接子”，以 SEQ ID NO :27為例，這是IgG的鉸鏈區或部分鉸鏈區附近提供的連接子序列。鉸鏈序列包括 IgG2Fc(SEQ ID NO :28)、IgGlFc(SEQ ID NO :29)和 IgG4Fc(SEQ ID NO :30)。鉸鏈連接子序列的目的還可能是改善svActRIIB-Fc蛋白的可制備性和穩定性。 在一個實施例中，當與svActRIIB多肽結合時，SEQ ID NO :27、38、40、42、44、45和46的鉸鏈連接子的目的是使用IgG2 Fc (SEQ ID NO :22)改善可制備性。在一個實施例中，當 svActRIIB 多肽與人 IgGl Fc (SEQ ID NO :23)或修飾的人 IgGl Fc (SEQ ID NO 47)結合時， 所述鉸鏈連接子序列的目的是改善可制備性，例如，具有SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :49和 SEQ ID :50的鉸鏈連接子。以下例4描述了這些多肽的改善的可制備性。連接子還可能是非肽類連接子。例如可以使用烷基連接子，如NH-(CH2)S-C(O)-, 其中S = 2-20。這些連接子可能還會被任何非立體位阻基團(如低級烷基(例如C1-C6)低級酰基、鹵素(例如氯，溴)CN、NH2、苯基等)取代。就給予所需特性(如減少降解和/或增加半衰期、降低毒性、降低免疫原性和/或增加svActRIIB多肽的生物活性)的目的而言，本文公開的svActRIIB多肽還可以與非多肽分子結合。典型的分子包括但不限于線性高分子，如聚乙二醇(PEG)、聚賴氨酸、葡聚糖； 脂質；膽固醇基團(如類固醇)；碳水化合物或寡糖分子。與其它ActRIIB可溶性多肽相比，svActRIIB蛋白和多肽具有改善的可制備性。本文所用的術語“可制備性”是指一種特定的蛋白在其重組表達和純化過程中的穩定性。可制備性被認為是由于該分子在表達和純化條件下的固有性質。改善的可制備性實例如以下實例所示，包括蛋白(例幻的均勻糖基化、蛋白重組制備過程中細胞滴定度、生長和蛋白表達的提高(例1)、純化性能的提高(例2)和低pH值下穩定性的提高(例2)。相比于其它可溶性ActRIIB多肽，本發明的svActRIIB蛋白和多肽顯示了改善的可制備性，以及體外和體內活性的保留(例2和幻。此外，其它鉸鏈連接子序列可能賦予其它的可制備性收益，如以下例4所示。
本文所用的術語“svActRIIB多肽活性”或“可溶性ActRIIB多肽生物活性”是指一種或多種svActRIIB多肽在體外或體內的活性，包括但不限于以下實例所示的那些活性。svActRIIB多肽的活性包括，但不限于，結合肌肉生長抑制素或激活素A或⑶F-Il活性的能力，以及抑制或消除肌肉生長抑制素或激活素A或GDF-Il活性的能力。本文所用的術語“能夠結合”肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il是指通過本領域公知方法測量的結合， 如以下實例所示的KinExA 方法。肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il的體外抑制，可以使用(例如)以下實例所述的pMARE C2C12細胞實驗測量。以下例3所示的體內活性，通過在小鼠模型中增加肌肉質量顯示。svActRIIB多肽和蛋白的體內活性，包括但不限于增加體重、增加肌肉質量以及增加肌肉質量與脂肪質量之比。治療活性進一步包括減少或預防某些類型的腫瘤引起的惡病質、防止某些類型的腫瘤生長以及增加某些動物模型的存活率。以下還提供了 svActRIIB蛋白和多肽活性的進一步討論。在另一方面，本發明提供了包含編碼本發明svActRIIB多肽的多核苷酸的分離核酸分子。本文所用的術語“分離的”是指從內源性物質純化至一定程度的核酸分子。在一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID N0:2所示序列的多肽，其中觀位的置換選自從W或Y，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示的序列的多肽，其中觀位的置換選自從W或Y，44位的置換為T。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸23至134所示的序列的多肽，其中觀位的置換選自從W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2的氨基酸 25至134所示的序列的多肽，其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ。在另一個實施例中，所述多核苷酸編碼與上述任一多肽具有至少80%、85%、90%、95%、98%或99% 同一性的氨基酸序列，其中所述多肽的觀位具有單氨基酸置換，44位具有單氨基酸置換， 其中觀位的置換選自W或Υ，44位的置換為Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。在一個實施例中，上述實施例的多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為T。在一個實施例中，本發明的分離核酸分子包含編碼具有由SEQ ID Ν0:4、6、12和 14組成的組所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一個實施例中，所述核酸包含編碼具有與 SEQ ID NO :4、6、12 或 14有至少 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能夠與激活素Α、 GDF-Il或肌肉生長抑制素結合。在一個實施例中，上述實施例的多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為Τ，其中所述多肽能夠與激活素A、GDF-11或肌肉生長抑制素結合。在另一個實施例中，所述分離核酸分子進一步包含編碼至少一種異源蛋白的多核苷酸。在一個實施例中，所述異源蛋白為Fc結構域，在又一個實施例中，所述Fc結構域為人IgG Fc結構域。在另一個實施例中，所述核酸分子進一步包含編碼SEQ ID NO :25、27、 38、40、42、44、45、46、48、49或50所示的連接子和鉸鏈連接子的多核苷酸。在又一個實施例中，這些多核苷酸具有選自由SEQ ID N0:26、37、39、41和43組成的組的序列。
在一個實施例中，所述核酸分子包含編碼由SEQ ID NO :8、10、16和18組成的組所示的序列組成的多肽的多核苷酸。在另一個實施例中，所述核酸包含編碼具有與SEQ ID NO :8、10、16或18有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的28位具有W或Y，44位具有T，其中所述多肽能夠與激活素A、GDF-11 或肌肉生長抑制素結合。在一個實施例中，上述實施例的多核苷酸編碼一種多肽，其中觀位的置換為W，44位的置換為T，其中所述多肽能夠與激活素A、GDF-Il或肌肉生長抑制素
纟口口。在一個實施例中，所述分離核酸分子包含具有選自由SEQ ID NO :3、5、11或13或者其互補序列組成的組的序列的多核苷酸。在另一個實施例中，所述分離核酸分子包含具有選自由SEQ ID NO :7、9、11或13或者其互補序列組成的組的序列的多核苷酸。在又一個實施例中，所述分離核酸分子在嚴格或適度條件下與SEQ ID NO :3、5、7、9、11、13、15或17 雜交，其中所述編碼的多肽與SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16或18基本上相似，其中所述多肽包含28位具有W或Y和44位具有T的氨基酸序列，其中所述編碼的多肽能夠與激活素A、⑶F-Il或肌肉生長抑制素結合。本發明的核酸分子包括DNA單鏈和DNA雙鏈形式兩種，以及其RNA互補序列。DNA 包括(例如)cDNA、基因組DNA、合成DNA、PCR擴增的DNA及其組合。基因組DNA可通過常規技術得到分離，如采用SEQ ID N0:3、5、ll或13的DNA，或其合適的片段作為探針。編碼 ActRIIB多肽的基因組DNA來自對許多物種有用的基因庫。合成DNA是從重疊寡核苷酸片段的化學合成中得到，隨后組裝片段，以重新構建編碼區和側翼序列的部分或全部。RNA可來自mRNA直接高水平合成的原核表達載體，如采用T7啟動子和RNA聚合酶的載體。cDNA 來自表達ActRIIB的各種組織分離的mRNA制得的庫。本發明的DNA分子包括全長基因以及多核苷酸和其片段。全長基因編碼序列還可包括編碼N末端信號序列的序列。本發明還提供了上述的核酸分子，其中所述多核苷酸與轉錄或翻譯調控序列可操作地連接。典型的多核苷酸和多肽序列svActRIIB (E28W, S44T)，含有信號序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtgg tgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcagga caagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctag atgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgag ggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgac agcccccacc(SEQ ID NO 3)svActRIIB(E28ff, S44T)，含有信號序列mefglswvfIvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO :4)svActRIIB (E28W, S44T)，不含有信號序列gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccacc(SEQ ID NO 5)svActRIIB(E28W, S44T)，不含有信號序列etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO 6)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，含有信號序列的多核苷酸序列atggagtttgggctgagetgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtg gtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcag gacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctgg ctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgc tgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcca cccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccg tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtg gtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactgg ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa accaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag aacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag aagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO :7)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，含有信號序列的多核苷酸序列mefglswvfIvallrgvqcetrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappva gpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdw lngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsispgk(SEQ ID NO :8)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，不含有信號序列的多核苷酸序列gagacacggtggtgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgt ggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgt gcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccagga ctggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca aaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO 9)svActRIIB-Fc (E28W, S44T)，不含有信號序列的多核苷酸序列etrwciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvfIfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapi ektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO :10)svActRIIB(E28Y, S44T)，含有信號序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggtac tgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcagga caagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctggctag atgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgctgtgag ggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagccacccccgac agcccccacc(SEQ ID NO :11)svActRIIB(E28Y, S44T)，含有信號序列mefglswvflvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt(SEQ ID NO :12)svActRIIB(E28Y, S44T)，不含有信號序列gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccacc(SEQ ID NO :13)svActRIIB(E28Y, S44T)，不含有信號序列etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptapt (SEQ ID NO 14)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，含有信號序列的多核苷酸序列atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtgagacacggta ctgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggagcgctgcgaaggcgagcag gacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgtgaagaagggctgctgg ctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccaggtgtacttctgctgc tgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtcacgtacgagcca cccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccg tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtg gtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactgg ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaa
16accaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag aacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcag aagagcctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO 15)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，含有信號序列的多核苷酸序列mefglswvfIvallrgvqcetryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtielvk kgcwlddfncydrqecvateenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappva gpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdw lngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsispgk(SEQ ID NO :16)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，不含有信號序列的多核苷酸序列gagacacggtactgcatctactacaacgccaactgggagctggagcgcaccaaccagaccggcctggag cgctgcgaaggcgagcaggacaagcggctgcactgctacgcctcctggcgcaacagctctggcaccatcgagctcgt gaagaagggctgctggctagatgacttcaactgctacgataggcaggagtgtgtggccactgaggagaacccccagg tgtacttctgctgctgtgagggcaacttctgcaacgagcgcttcactcatttgccagaggctgggggcccggaagtc acgtacgagccacccccgacagcccccaccggagggggaggatctgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgt ggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgt gcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataat gccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccagga ctggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctcca aaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtc agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaa caactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaaga gcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa(SEQ ID NO :17)svActRIIB-Fc (E28Y, S44T)，不含有信號序列的多核苷酸序列etryciyynanwelertnqtglercegeqdkrlhcyaswrnssgtieIvkkgcwlddfncydrqecvat eenpqvyfcccegnfcnerfthlpeaggpevtyeppptaptggggsvecppcpappvagpsvfIfppkpkdtlmisr tpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapi ektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsItclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflysk ltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(SEQ ID NO :18)在本發明的另一方面，提供了含有本發明的核酸分子和多核苷酸的表達載體，還提供了使用這種載體轉化宿主細胞以及制備SVActRIIB多肽的方法。術語“表達載體”是指得自多核苷酸序列表達多肽的質粒、噬菌體、病毒或載體。svActRIIB多肽表達的載體含有克隆插入表達載體增殖所需的最小量序列。表達載體包含轉錄單位，所述轉錄單位包含 (1)在基因表達中具有調控作用的遺傳因子或因子的組裝，例如，啟動子或增強子( 編碼 svActRIIB多肽的序列和被轉錄為mRNA并被翻譯成蛋白的蛋白，以及(3)適當的轉錄起始和終止序列。這些序列可進一步包括選擇標記。適合于在宿主細胞中表達的載體是現成的，采用標準的重組DNA技術將核酸分子插入到載體中。這些載體可以包括特定的組織中發揮功能的啟動子，以及用于人或動物靶向細胞中svActRIIB多肽表達的病毒載體。適合于svActRIIB表達的典型表達載體是含有svActRIIB多核苷酸的pDSRa (如WO 90/14363所述，通過引用并入全文中)及其衍生物，以及以下所述本領域公知的任何其它合適的載體。本發明還提供了制備svActRIIB多肽的方法。其它各種表達/宿主系統可加以利用。這些系統包括但不限于微生物，如重組噬菌體轉化的細菌，質粒或粘粒DNA表達載體； 酵母表達載體轉化的酵母；病毒表達載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉染或細菌表達載體(例如，Ti 或PBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或動物細胞系統。用于重組蛋白制備的哺乳動物細胞包括但不限于VERO細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系或其衍生物，如生長于無血清培養基的 Veggie CHO 和相關細胞系(見 Rasmussen et al. , 1998, Cytotechnology 28 31)或缺乏DHFR COS細胞(如猴腎細胞的C0S-7細胞系(ATCC CRL 1651)(見Gluzman et al.，1981，Cell23 :175)，W138、BHK、H印G2、3T3(ATCC CCL 163)、RIN、MDCK、A549、PC12、 K562、L細胞、C127細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞系、來源于非洲綠猴腎細胞系CVl的CVl/ EBNA 細胞系(ATCC CCL 70)(見 McMahan et al.，1991，EMBO J. 10 J821)，人胚胎腎細胞， 如^3J93EBNA或MSR四3、人表皮A431細胞、人Colo205細胞、其它轉化靈長類動物細胞系、正常二倍體細胞、來自體外組織培養的細胞株、主要移植組織、HL-60、U937、HaK或淋巴細胞)的 CHO 細胞系 DX-Bll (見 Urlaub et al. , 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20)。哺乳動物表達允許可從生長培養基中回收的分泌或可溶性多肽的制備。采用適當的宿主載體系統，svActRIIB多肽是通過在允許制備的條件下培養含有本發明核酸分子的表達載體轉染的宿主細胞進行制備。轉化細胞可以用于長期、高收益的多肽制備。一旦這些細胞被含有選擇標記以及所需表達試劑盒的載體轉染，(例如)在它們被切換到選擇性培養基之前，細胞可以被允許生長于富集培養基中。選擇標記的目的是允許成功地表達介入序列的細胞的生長和回收。可以采用適合于所用細胞系的組織培養技術使穩定轉化細胞的抗團塊增殖。重組蛋白表達的概述在Methods of Enzymology, v. 185, Goeddel 1，D. V.，ed.，Academic Press (1990)中找到。在某些情況下，如利用原核系統表達，本發明所表達的多肽可能需要“重折疊”，并氧化為合適的三級結構和產生二硫鍵，以具有生物活性。重折疊可以通過使用本領域眾所周知的一些操作實現。這些方法包括，例如，使溶解的多肽在離液劑存在下接觸通常高于7 的PH值。該離液劑的選擇類似于包涵體增溶所使用的選擇，但離液劑通常是在低濃度下使用。典型的離液劑是胍和尿素。在大多數情況下，重折疊/氧化溶液還將含有還原劑附加其特定比例的氧化形式，以允許半胱氨酸橋形成出現的二硫鍵滑移的特定氧化還原電位的產生。一些常用的氧化還原對包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/ 二硫基GSH、氯化銅、二硫蘇糖醇DTT/ 二噻烷DTT和2-巰基乙醇(bME) / 二硫代-bME。在許多情況下，共溶劑可用于提高重折疊率。常用的夾帶劑包括丙三醇、不同分子量的聚乙二醇和精氨酸。此外，所述多肽可以根據常規技術在溶液中或載體上合成。各種自動合成器是市售的，而且可以根據已知的議定使用。見，例如，Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. Ed. , Pierce Chemical Co. (1984) ；Tam et al. , J Am Chem Soc, 105 6442，(1983) ；Merrifield, Science 232:341-347(1986) ；Barany and Merrifield, ThePeptides,Gross and Meienhofer,eds,Academic Press,New York, 1-284 ；Barany et al., Int J Pep Protein Res，30 :705-739 (1987)。本發明的多肽和蛋白可以根據本領域普通技術人員眾所周知的蛋白純化技術進行純化。這些技術包括，在一個層面上，對蛋白和非蛋白片段的粗分餾。從其它蛋白已分離的肽或多肽，目標肽或多肽可使用氣相色譜和電泳技術進一步純化，以實現部分或完全純化(或純化至同質)。本文所用的術語“分離多肽”或“純化多肽”，是指從其它成分分離的組合物，其中所述多肽被純化至相對于其天然獲得狀態的任何程度。因此，純化多肽還指一種不在其天然存在環境的多肽。一般而言，“純化”是指經分餾法已除去其它不同成分的多肽組合物，而且所述組合物保留其表達的生物活性。其中所用的術語“基本上純化”是指多肽或肽形成所述組合物的主要成分(例如)占所述組合物中蛋白的約50%、約60%、約 70 %、約80 %、約85 %或約90 %或以上的肽或多肽組合物。適用于純化的不同技術對本領域普通技術人員而言是公知的。這些技術包括，例如，使用硫酸銨、PEG、抗體(免疫沉淀反應)等進行沉淀或通過加熱變性，接著通過離心；色譜分析，如親和層析(蛋白-A柱)、離子交換、凝膠過濾、反相色譜法、羥基磷灰石、疏水層析、等電聚焦、凝膠電泳以及這些技術的組合。本領域眾所周知，據認為，進行不同純化步驟的順序可變化的，或者某些步驟可省略，但還是產生一種制備基本純化多肽的合適方法。以下實例提供了典型的純化步驟。根據本發明，用于定量多肽純化純度的各種方法將是本領域普通技術人員的公知的。這些方法包括，例如，測定活性成分的特異性結合活性，或通過SDS/PAGE分析評價成分內肽或多肽的量。一種評價多肽成分純度的優選方法是計算所述成分的結合活性，比較最初提取的結合活性，從而計算純度，通過“折疊純化數”在此進行評價。用于表示結合活性量的實際單位將(當然)取決于純化以及多肽或肽是否表現出可檢測的結合活性后所選的特定檢測技術。穩定的激活素IIB型多肽與使肌肉降解級聯活化的配體結合。svActRIIB多肽能夠結合配體激活素A、肌肉生長抑制素和/或GDF-11并抑制其活性，而且具有治療涉及肌肉萎縮的疾病以及某些癌癥和其它疾病的能力。以下實例顯示了具有本文所述的氨基酸置換的svActRIIB多肽和蛋白的改善性能，而保留了在體外檢測中結合和消除肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il的能力，以及保留了體內活性。相比于其它可溶性受體，這些性能導致蛋白和多肽具有改善的可制備性。抗體本發明進一步包括與穩定的ActRIIB多肽結合的抗體，其中包括特異性結合本發明svActRIIB多肽的那些抗體。本文所用的術語“特異性結合”是指抗體對svActRIIB 多肽結合親和力(Ka)具有IO6M-1或以上。本文所用的術語“抗體”，是指完整的抗體，其中包括多克隆抗體(見例如，Antibodies :A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988))和單克隆抗體(見例如，美國專利 No. RE 32,011， 4，902，614，4，543，439 和 4，411，993 以及單克隆抗體A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett,McKearn and Bechtol (eds. ) (1980))。本文所用的術語 “抗體”也指抗體片段，如F(ab)、F(ab，)、F(ab，)2、Fv、Fc和通過重組DNA技術或通過酶或完整抗體的化學裂解產生的單鏈抗體。術語“抗體”也指雙特異性或雙功能性抗體，其是具有兩個不同的重/輕鏈對和兩個不同的結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可通過包括雜交瘤細胞融合或Fab'片段連接的各種方法進行制備(見Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol. 79 :315-321 (1990)，Kostelny et al.，J. Immunol. 148 1547-1553(1992))。本文所用的術語“抗體”也指嵌合抗體，S卩，具有人恒定抗體免疫球蛋白結構域共軛到一種或多種非人類可變抗體免疫球蛋白結構域的抗體，或其片段(見，例如，第 55/95898號美國專利和第56/93493號美國專利)。抗體也指“人性化”抗體(見，例如，美國專利第48/16567號和WO 94/10332)、微型抗體(W0 94/09817)、巨型抗體以及通過轉基因動物制備的抗體，其中轉基因動物含有一部分人類抗體產生基因，但缺乏能夠制備人類抗體的內源性抗體(見例如，Mendez et al. ,Nature Genetics 15:146-156(1997)和美國專利No. 6，300, 129)。術語“抗體”還包括多聚抗體或蛋白的較高級復合物，如異質二聚抗體、抗獨特型抗體。“抗體”還包括抗獨特型抗體。可以使用針對ActRIIB多肽的抗體(例如)體外和體內鑒定和定量svActRIIB。還包括來自任何哺乳動物的多克隆抗體，例如，與本文所述的svActRIIB多肽特異性結合的小鼠和大鼠抗體，以及兔抗體。發現這些抗體作為研究工具和用于檢測和分析本文所公開的多肽的定量分析。這些抗體是采用上述以及本領域公知的方法制得。藥物組合物還提供了含有本發明的svActRIIB蛋白和多肽的藥物組合物。這些組合物包含治療上或預防上有效量的多肽或蛋白與藥學上可接受的材料，以及生理上可接受的配方材料形成的混合物。所述藥物組合物可包含用于改變、保持或保存(例如，組合物的PH值、滲透壓、粘度、清晰度、顏色、等滲性、氣味、無菌、穩定性、溶解率或釋放率、吸附或滲透)的配方材料。合適的配方材料包括，但不限于，氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸)；抗菌劑；抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩沖劑(如硼酸鹽、 碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其它有機酸類)；填充劑(如甘露醇或甘氨酸)，螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))；絡合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精和羥丙基-β-環糊精)；填充料；單糖；雙糖和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物 (如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；鹽形式抗衡離子(如鈉)；防腐劑(如苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、洗必泰、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；懸浮劑；表面活性劑或潤濕劑(如ρluronics、PEG、山梨醇酯，聚山梨酯，如聚山梨酯20、聚山梨酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal)；穩定性增強劑(蔗糖或山梨醇)；彈性增強劑(如堿金屬鹵化物(優選為氯化鈉或氯化鉀，甘露醇山梨醇))；遞送載體；稀釋劑；輔料和/或藥物佐劑(Remington’ s Pharmaceutical Sciences，18th Edition，A. R. Gennaro, ed.，Mack Publishing Company，1990)。最佳的藥物組合物將由本領域的普通技術人員確定，取決于(例如)給藥的預定路徑、傳送形式以及所需的劑量。見，例如，Remington’ s Pharmaceutical Sciences，上文。 這些組合物可影響物理形態、穩定性、體內釋放率以及體內多肽清除率。例如，合適的組合物可以是非消化道給藥的注射水、生理鹽溶液。
藥物組合物中的主要載體或載體人可能實際是含水或無水的。例如，合適的載體或載體可能是注射液、生理鹽溶液或人工腦脊液中的水，可能補充有非腸道給藥的組合物中的其它常見材料。中性緩沖生理鹽水或生理鹽水與血清白蛋白形成的混合物還是典型的載體。其它典型的藥物組合物包含Tris緩沖劑或醋酸緩沖劑，其可能進一步包括山梨醇或其合適的替代物。在本發明的一個實施例中，組合物可通過混合具有所需純度的選定組合物與以凍干塊狀或水溶液形式存在的可選的制劑(Remington，s Pharmaceutical kiences，上文)為儲存作好準備。此外，治療組合物可使用適當的賦形劑(如蔗糖)配制為冷凍干產物。所述配方可以通過多種方法傳送，例如，通過吸入療法、口服或注射。當考慮非腸道給藥時，用于本發明的治療組合物，可能是在包含藥學上可接受的載體中所需多肽的無熱原質、非腸道可接受的水溶液中。一種特別合適的非腸道注射載體是無菌蒸餾水，其中多肽制成適當保存的無菌等滲溶液。又一種制劑可以涉及所需分子與試劑(如可注射微球、 生物可侵蝕顆粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、小球或脂質體)的配方，所述試劑然后提供可通過積存注射傳送的產物的控釋或緩釋。還可使用透明質酸分子，這可能具有增加血液循環持續時間的效果。介入所需分子引入的其它合適方法包括植入式給藥裝置。在另一方面，適合于注射給藥的藥物配方可在水溶液中制成，優選為在生理兼容性緩沖劑中，如漢克斯液、林格氏液或生理緩沖鹽水。水相注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡萄聚糖。此外，活性化合物的懸浮液，可制成適當的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、三酸甘油脂或脂質體。非脂質陽離子型氨基聚合物還可用于傳送。或者，懸浮液還可含有合適的穩定劑或增加化合物溶解度的試劑，并允許高濃縮液的制備。在另一個實施例中，藥物組合物可制成吸入試劑。吸入試劑溶液還可使用氣溶膠傳送的推進劑制成。在再一個實施例中，溶液可能是霧化的。肺部給藥還在PCT專利申請NO.PCT/US94/001875中有所描述，其描述了化學修飾蛋白的肺部給藥。還需考慮的是，某些配方可能是口服給藥。在本發明的一個實施例中，以這種方式給藥的分子可以制成含有或不含有通常用于固體劑型(如片劑和膠囊劑)的配料的那些載體。例如，膠囊劑的可能被設計為當生物利用度最大化和預系統退化減至最低時在接近胃腸道內的活動部分釋放。其它試劑可以包括在內是為了促進治療性分子的吸收。還可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑油、懸浮劑、藥片崩解劑和粘合劑。口服藥物組合物還可使用本領域眾所周知的藥學上可接受的載體制成適合于口服的劑量。這些載體使藥物組合物被制成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊劑、液體、凝膠劑、糖漿劑、料漿和懸浮液等，以供病人服用。口服藥物制劑可通過活性化合物與固體賦形劑結合以及加工顆粒劑(可選地，在研磨后)的所得混合物，以獲得藥片或糖衣丸核心。可以添加合適的助劑，如果需要的話。 合適的賦形劑包括碳水化合物或蛋白填充料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白，如明膠和膠原蛋白。如果需要，可添加崩解劑或增溶劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。核心可配合合適的包衣材料使用，如濃縮糖溶液，其還可含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液和合適的有機溶劑或溶劑混合物。可向產品鑒定或表征活性化合物量(即，劑量)的藥片或糖衣丸包衣中加入染料或顏料。 可以口服的藥物制劑還包括明膠制成的壓接式膠囊，以及明膠和包衣制成的軟密封膠囊，如丙三醇或山梨醇。壓接式膠囊可以含有活性成分與填充料或粘合劑(如乳糖或淀粉、潤滑劑，如滑石粉或或硬脂酸鎂)的混合物，以及可選的穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于合適的液體中，如脂肪油、液體或含有或不含有穩定劑的液體聚乙二包括涉及緩釋或控釋傳送配方中多肽的配方的其它的藥物組合物對本領域的普通技術人員而言將是將是顯而易見的。制成其它緩釋或控釋傳送工具的技術，如脂質體載體、生物可侵蝕微粒或多孔小球和藥性持久注射，也是本領域的普通技術人員公知的。見，例如，PCT/US93/00^9描述了傳送藥物組合物的多孔聚合物微粒的控釋。緩釋制劑的其它實例包括特型制品形式的半透型聚合物，例如膜、微膠囊。緩釋基質可包括聚酯、水凝膠、聚乳酸(U. S. 3，773，919，EP 58，481)，L-谷氨酸和γ乙基_L_谷氨酸的共聚物(Sidman et al. , Biopolymers, 22 :547-556 (1983), M (2_ 羥乙基-丙烯酸甲酯) (Langer et al. , J. Biomed. Mater. Res. ,15 167-277, (1981) ；Langer et al. , Chem. Tech. , 12 :98-105 (198 )，乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al.，上文)或聚-D (-)-3-羥丁酸 (EP 133，988)。緩釋組合物還包括脂質體，可以通過本領域公知的幾種方法制得。見，例如 Eppstein et al.，PNAS(USA)，82 :3688(1985) ；EP 36, 676 ；EP 88, 046 ；EP 143,949。用于體內局部給藥的藥物組合物通常必須是無菌的。這可能是通過無菌過濾膜的過濾實現的。其中所述組合物是凍干的，采用這種方法的殺菌可以在冷凍干燥和重建之前或之后進行。用于非腸道給藥的組合物可能以凍干形式或溶液形式儲存。此外，非腸道組合物通通常置于有無菌接入端口的容器中，例如，具有通過皮下注射針頭刺破的輸液袋或塞小瓶。一旦藥物組合物已制成，可能以溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體或無水或凍干粉末形式儲存于無菌小管中。這些配方可能以隨時可用形式或以在給藥前需要重建的形式(例如，凍干的)儲存。在一個特定實施例中，本發明涉及到制備單劑量給藥單位的試劑盒。所述試劑盒各自可含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水相配方的第二容器。本發明的范圍還包括含有單或多腔預填充注射器的試劑盒(例如，液體注射器和凍干注射器)。治療所用的藥物組合物的有效量將取決于(例如)治療范圍和目標。因此，本領域的普通技術人員將會領會治療的適當劑量水平是變化的，部分取決于傳送的分子、所使用多肽的顯示、給藥路徑、患者的大小(體重、體表面積或器官大小)和情況(年齡和基本健康)。因此，臨床醫生可修改滴度劑量和給藥途徑，以獲得最佳的治療效果。一個典型的劑量范圍為約0. lmg/kg至約100mg/kg或以上，這取決于上述的因素。多肽組合物可優選為靜脈注射或給藥。長效藥物組合物可能是每3至4天、每周或每兩周給藥，這取決于特定配方的半衰期和清除率。劑量的頻率將取決于所用配方中多肽的藥代動力學參數。通常情況下，使用組合物進行給藥直至達到實現所需效果的劑量。因此，所述組合物可作為一定時期內的單劑量或多劑量(以相同或不同的濃度/劑量)，或作為連續灌注進行給藥。適當劑量的進一步提純是經常進行的。適當劑量可通過使用劑量效應數據得到確定。所述藥物組合物的給藥路徑對應于已知的方法，例如，通過靜脈內、腹腔內、腦內 (腦實質內)、腦室內、肌肉內、眼內、動脈內、門靜脈內、病灶內路徑、髓內、鞘內、心室內、透皮、皮下或腹腔注射；以及鼻腔、腸道、外用、舌下、尿道、陰道或直腸的方法，通過持續釋放系統或植入裝置。其中需要的是，所述組合物可通過彈丸注射、連續不斷地灌注或植入裝置進行給藥。二者擇一地或另外地，所述組合物可通過膜、海綿或其它適當的材料植入已吸附或裝入的所需分子上進行給藥。其中使用了植入裝置，所述裝置可植入任何合適的組織或器官，所需分子可通過擴散、定時釋放藥丸或連續不斷地給藥進行傳送。在一些情況下，本發明的svActRIIB多肽可以使用本文所述的方法植入某些基因工程細胞傳送，以表達和分泌多肽。這些細胞可能是動物或人類細胞，而且可能是自體同源，異源或異種的。或者，所述細胞可能是永生化的。為了降低免疫反應的可能性，可封裝所述細胞以避免周圍組織的浸潤。封裝材料通常是生物可相容性的半透型聚合物外殼或膜，以允許多肽產物釋放，但防止患者免疫系統或其它周圍組織的其它不利因素對細胞的破壞。svActRIIB基因治療也是預想的，其中編碼svActRIIB或svActRIIB衍生物的核酸分子被直接介入受試者。例如，編碼svActRIIB的核酸序列通過含有或不含有適當的傳送載體(如腺相關病毒載體)的核酸構建的局部注射被介入靶細胞。替代的病毒載體包括、 但不限于，逆轉錄酶病毒、腺病毒、單純性皰疹病毒和乳頭狀瘤病毒載體。病毒載體的物理轉移可通過所需核酸分子構建或含有所需核酸分子序列的適當傳送載體的局部注射、脂質體介導轉移、直接噴射(裸DNA)或微粒轟擊(基因槍)在體內實現。本發明的組合物可單獨或與其它治療劑組合使用，以提高其治療效果或降低潛在的副作用。svActRIIB組合物的用途本發明提供了降低或壓制肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il在體內和體外的量或活性的方法和藥物組合物。svActRIIB多肽對肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il具有高親和力，并且能夠降低和抑制和抑制肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il中至少一種的生物活性。一方面，本發明提供了通過向需要治療的受試者給予有效劑量的svActRIIB組合物治療所述受試者的肌肉生長抑制素相關和/或激活素A相關障礙的方法和試劑。本文所用的術語“受試者”是指任何包括動物，如包括人類的哺乳動物。本發明的組合物對增加受試者的瘦肌肉質量有用。所述組合物還可對增加受試者的瘦肌肉質量與脂肪質量之比有用，從而降低受試者體重的脂肪質量百分比。實施例3表明，本發明的svActRIIB多肽和蛋白可以增加動物的肌瘦肉質量。可以通過svActRIIB組合物治療的障礙包括但不限于各種形式的肌肉萎縮，以及代謝障礙，如糖尿病及相關障礙，和骨質退化病如骨質疏松癥。肌肉萎縮癥還包括營養障礙，如杜興肌營養不良、進行性肌營養不良、貝克型肌營養不良、代-蘭二氏肌營養不良、歐勃肌營養不良和幼兒神經軸索性營養不良。其它肌肉萎縮癥是由慢性疾病或障礙引起的，如肌萎縮性脊髓側索硬化、充血性阻塞性肺疾病、癌癥、 AIDS、腎衰竭、器官萎縮、雄激素剝奪和類風濕性關節炎。
肌肉生長抑制素和/或激活素的過度表達可能有助于惡病質(一種嚴重的肌肉萎縮綜合癥)。惡病質起因于癌癥，還由于類風濕性關節炎、糖尿病腎病、腎衰竭、化學療法、燒傷以及其它原因而產生。在另一個實例中，肌肉生長抑制素免疫蛋白的血清和肌肉注射濃度被認為在顯示AIDS相關肌肉萎縮的男性中增加，并與不含脂肪質量呈負相關(Gonzalez-Cadavid et al.，PNAS USA 95:14938-14943(1998))。肌肉生長抑制素水平也已經被證明在燒傷后增加，造成肌肉異化作用(Lang et al, FASEB J 15， 1807-1809(2001))。其它病癥導致的肌肉萎縮可能由于殘疾(如輪椅限制，因中風、疾病、 脊髓損傷、骨折或外傷導致的長期臥床休養，以及微重力環境下(太空飛行)的肌肉萎縮)造成的靜止產生。例如，血漿肌肉生長抑制素免疫蛋白被發現在長期臥床休養后增加(Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2) :11(1999)。還發現，在航天飛機飛行過程中大鼠肌肉暴露于微重力環境下與未暴露的大鼠肌肉相比表達的肌肉生長抑制素量增加 (Lalani et al. , J. Endocrin 167(3) :417-28 U000))。此外，脂肪與肌肉之比的年齡相關性增加，以及年齡相關性肌肉萎縮似乎與肌肉生長抑制素有關。例如，平均血清肌肉生長抑制素免疫蛋白在年青組(19-35歲)、中年組 (36-75歲)和老年組(76-92歲)的男性和女性中隨年齡的增加而增加，而平均肌肉質量和不含脂肪質量，在這些組中隨年齡的增加而下降(Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5) 343-8(2002))。此外，現在肌肉生長抑制素現已被發現在心肌中表達水平低，且表達在梗塞后的心肌細胞中上調(Sharma et al.，J Cell Physiol. 180(1) :1-9(1999)) 因此，降低心肌中的肌肉生長抑制素水平可改善梗塞后心肌的恢復。肌肉生長抑制素似乎還影響著代謝障礙，其中包括2型糖尿病、非胰島素依賴型糖尿病、高血糖癥和肥胖癥。例如，缺乏肌肉生長抑制素被證明能改善兩種小鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen et al. FASEB J. 8 :479 (1994)。本發明的svActRIIB多肽適合于治療這些代謝障礙。因此，本發明組合物的施用將改善合適受試者中的糖尿病、肥胖癥和高血糖病癥。此外，含有svActRIIB多肽的組合物可降低肥胖受試者的食物攝入量。本發明穩定的ActRIIB多肽的施用可提高骨骼強度，并降低骨質疏松癥和其它退化性骨疾病。據發現，例如，肌肉生長抑制素缺陷型小鼠顯示了其肱骨的礦物含量和密度的增加，小梁及皮質骨與肌肉結合的區域的礦物含量的增加，以及肌肉質量的增加(Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1) :63-8 Q002))。此外，本發明的 svActRIIB 組合物可以用于治療雄激素剝奪，例如，在雄激素剝奪情況下用于治療前列腺癌。本發明還提供了通過向所述動物施用效劑量的svActRIIB蛋白增加食用動物中肌肉質量的方法和組合物。由于成熟的C-末端肌肉生長抑制素多肽與所有測試的物種類似或相同，預計svActRIIB多肽將有效增加肌肉質量，并降低任何重要農業物種(包括牛、 雞、火雞和豬)的脂肪。本發明的svActRIIB多肽和組合物還拮抗激活素A的活性，如以下的體外檢測所示。已知激活素A通過某些類型的癌癥表達，特別是性腺腫瘤，如卵巢癌，導致嚴重惡病質。(Ciprano et al. Endocrinol 141 (7) :2319-27 (2000), Shou et al. , Endocrinol 138(11) :5000-5(1997) ；Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5) :534-43(1996) ；Ito et al.British J Cancer 82(8) 1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7(1999)。因此，本發明的組合物可用于治療與激活素A過表達以及肌肉生長抑制素表達相關的病癥，如某些癌癥導致的惡病質和某些性腺型腫瘤的治療。此外，本發明的svActRIIB多肽對檢測和定量許多實驗中的肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il非常有用。一般而言，本發明的穩定的ActRIIB可用作結合和固定許多實驗中肌肉生長抑制素、激活素A或⑶F-Il的捕捉劑，類似于(例如)ASai，ed. ,Methods in Cell Biology,37,Antibodies in Cell Biology,Academic Press, Inc. , New York(1993) 所述。多肽可能以某種方式標記或可能與第三分子(如標記的抗體)發生反應，使得肌肉生長抑制素被檢測和定量。例如，多肽或第三分子可以使用檢測基團(如生物素)修飾，然后可以通過第四分子(如酶標記的抗生蛋白鏈菌素或其它蛋白)結合(AkerstronuJ Immunol 135 :2589(1985) ；Chaubert, Mod Pathol 10:585(1997))。本發明已被描述，以下實例是通過說明方式，而不是限制方式提供。實施例1svActRIIB多肽的表達和純化以下方法是用于表達和純化穩定的ActRIIB多肽。人類激活素IIB型受體是從人類睪丸源(Clontech，Inc.)的cDNA庫中分離得到， 并如第11/590962號美國專利申請和第2007/0117130號美國專利申請公布所述進行了克隆，此處通過引用并入本文。以下方法被用來制備svActRIIB-Fc (E28W, S44T)多肽(SEQ ID NO 10)和 ActRIIB-Fc (E28W) (SEQ ID NO :21)。編碼 svActRIIB (E^W，S44T) (SEQ ID NO:5)的多核苷酸或編碼ActRIIB (E28W) (SEQ ID NO 19)的多核苷酸通過編碼鉸鏈連接序列(SEQ ID NO 26)的多核苷酸采用含有突變導致觀位E至W和44位S至T的氨基酸置換引物的 PCR重疊延伸融合到編碼人類IgG2Fc(SEQ ID NO :22)的核苷酸上。完整的多核苷酸序列是svActRIIB-IgG Fc 的 SEQ ID NO 9 (E28W,S44T)和 ActRIIB-ActRIIB-IgG Fc 的 SEQ ID NO :20 (E^W)。將雙鏈 DNA 片段亞克隆到載體 pTT5 (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada(NRCC),6100 Avenue Royalmount,Montreal(Quebec) Canada H4P 2R2)，W0/9014363 中所述的 pDSRa )和 / 或 pDSRa 衍生物。穩定的ActRIIB-Fc多肽進行了瞬時表達如下。svActRIIB-IgG Fc(E28W, S44T) (SEQ ID NO 10)和 ActRIIB-IgG Fc(E28W)(SEQ ID NO 21)多肽在保持于 FreeStyle 培養基(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)并補充有 250 μ g/ml 遺傳霉素(Invitrogen)和 0. Pluronic F68 (Invitrogen)的無血清 IcSiSlS 293-6E MM (National Research Council of Canada, Ottawa, Canada) ψ ^Τ 了瞬時表達。對IL培養物進行了轉染。簡單地說，細胞接種量在費氏搖瓶(Corning，Inc.) 中增長到1. IXlO6細胞/ml。將搖瓶培養物保持在一個置于保持37°C、5% 二氧化碳、轉速為 65rpm 的培養箱的 Innova 2150 搖床平臺上(News Brunswick Scientif ic，Edison，NJ)。 在轉染時，將細胞稀釋至1.0X 106細胞/ml。轉染復合物形成于100ml FreeStyle 四3介質中Qnvitrogen)。先將Img 質粒DNA加入培養基中，隨后加入3ml FuGene HD轉染試劑(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)。轉染復合物在室溫下共培養約15分鐘，然后加入搖瓶的細胞中。在轉染后 24 小時，將 20% (w/v)的蛋白胨 Tm (OrganoiTechnie S. A. , TeknieScience, QC, Canada)加入，以達到0.5% (w/v)的終濃度。轉染/表達進行了 4_7天，之后通過在4000rpm、4°C下離心60分鐘收獲條件培養基。穩定的轉染和表達進行如下。采用標準電穿孔操作，svActRIIB-IgG-Fc細胞系通過含有編碼 svActRIIB-IgG Fc (E28W, S44T) (SEQ ID NO 9)或 ActRIIB-IgG Fc (E28W) (SEQ ID NO 20)的多核苷酸的表達質粒轉染穩定的CHO宿主細胞而產生。在表達質粒轉染宿主細胞系后，細胞在不含GHT的無血清選擇培養基中生長2-3周，以允許質粒的選擇和細胞的回收。選擇細胞，直到它們達到85%以上的存活率。然后，對這種轉染細胞池在含有150nM 甲氨蝶呤的介質中進行培養。在為期六天的表達檢測中，svActRI IB-Fc (E28W, S44T)表達細胞池相比于 ActRIIB-Fc (E28W)表達細胞池顯示出較高的細胞滴定度、生長性能和所制備蛋白的改善特異性制備率(皮克/細胞/天)。例如，相比于ActRIIB-Fc (E28W)的0. 9g/l，選擇池制備約 1.2g/l svActRIIB-Fc(E28W, S44T)。使用典型的補料分批工藝將svActRI IB-Fc (E28W, S44T)和 ActRI IB-Fc (E28W)表達細胞系都按比例放大。將細胞接種到Wave生物反應器(Wave Biotech LLC)中。使用藥丸飼料對培養物進行三次喂食。在第10天收獲10L，第11天收獲剩余物，兩種收獲都進行深度過濾，隨后進行無菌過濾。通過一個10英寸的0. 45/0. 2微米預過濾器對條件培養基進行過濾，隨后通過一個6英寸0. 2微米過濾器進行過濾。蛋白純化將約5L的條件培養基直接裝到220mL MabSelect 系列蛋白A柱(GE Healthcare)上。該柱在PBS (磷酸鹽緩沖劑2. 67mM氯化鉀、138mM氯化鈉、1. 47mM磷酸二氫鉀、8. ImM磷酸氫二鈉，pH值7. 4)中達到預平衡。使用平衡緩沖劑洗滌該柱，直到在 0D280的讀數約為0，然后使用0. IM的醋酸對蛋白進行洗脫。將Mabselect 池應用于一個 300mL SP-HP 柱(GE Healthcare) (5x15cm)。使用 IOmM NaOAC(pH 5)使該柱達到預平衡。然后使用平衡緩沖劑洗滌該柱，直到在0擬80的讀數約為0。使用從IOmM NaOAC(pH 5)中的0_150mM NaCl得到的20柱體積梯度緩沖劑對該柱進行洗脫。對SP-HP池進行濃縮，并使用0.2 μ M醋酸纖維素(Corning)過濾器進行過
濾。所用蛋白的序列如下表所示。
權利要求
1.一種包含穩定的激活素IIB受體多肽的分離蛋白，其中所述多肽選自(a)由SEQID NO :4、6、12和14所示的序列組成的多肽；(b)具有與(a)至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合；以及(c)具有與(a)至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。
2.權利要求1的蛋白，其中所述多肽與至少一種異源蛋白連接。
3.權利要求2的蛋白，其中所述異源多肽是IgGFc結構域。
4.權利要求2的蛋白，其中所述異源多肽通過連接子序列與所述多肽連接。
5.權利要求4的蛋白，其中所述連接子選自SEQID NO 25, SEQ ID NO 27、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 49 和 SEQ ID NO :50。
6.權利要求3的蛋白，其中所述蛋白包含選自以下的多肽(a)由SEQID NO :8、10、16和18所示的序列組成的多肽；(b)具有與(a)至少90%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合；以及(c)具有與(a)至少95%序列同一性的多肽，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有Τ，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。
7.權利要求1的蛋白，其中64位的氨基酸殘基是丙氨酸。
8.一種包含穩定的激活素IIB受體多肽(svActRIIB)的分離蛋白，其中所述多肽選自(a)除了28位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，由SEQ ID NO 2所示的序列組成的多肽，其中所述觀位的置換選自W和Y，并且所述44位的置換為T ；(b)除了28位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸19至134所示序列組成的多肽，其中所述觀位的置換選自W和Y，并且所述44位的置換為T;(c)除了28位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸23至134所示序列組成的多肽，其中所述觀位的置換選自W和Y，并且所述44位的置換為T;(d)除了28位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，由SEQ ID NO 2的氨基酸25至134所示序列組成的多肽，其中所述28位的置換選自W和Y，并且所述44位的置換為T;(e)除了觀位的單氨基酸置換和44位的單氨基酸置換之外，具有與(a)至(d)中的任一者至少80%序列同一性的多肽，其中所述觀位的置換選自W和Y，并且所述44位的置換為T，其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-Il結合。
9.一種分離核酸分子，包含編碼權利要求8所述多肽的多核苷酸。
10.一種包含多核苷酸的分離核酸分子，所述多核苷酸選自(a)編碼由SEQID NO :4、6、12和14所示序列組成的多肽的多核苷酸；(b)編碼與(a)具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-11結合； 以及(c)編碼與(a)具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-11結合。
11.權利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸具有選自SEQID NO :3、5、11和13或其互補序列的序列。
12.權利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸還包含編碼至少一種異源蛋白的多核苷酸。
13.權利要求12的核酸分子，包含選自以下的多核苷酸(a)編碼由SEQID NO :8、10、16和18所示序列組成的多肽的多核苷酸；(b)編碼與(a)具有至少90%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-11結合； 以及(c)編碼與(a)具有至少95%序列同一性的多肽的多核苷酸，其中所述多肽的觀位具有W或Y，44位具有T，并且其中所述多肽能夠與肌肉生長抑制素、激活素A或GDF-11結合。
14.權利要求13的核酸分子，其中所述多核苷酸具有選自SEQID NO :7、9、15和17或其互補序列的序列。
15.權利要求10的核酸分子，其中所述多核苷酸與轉錄或翻譯調控序列可操作地連接。
16.一種包含權利要求10所述的核酸分子的重組載體。
17.一種包含權利要求16所述的重組載體的宿主細胞。
18.權利要求17的宿主細胞，其中所述宿主細胞為哺乳動物細胞。
19.一種svActRIIB蛋白的制備方法，包括在促進所述蛋白表達的條件下培養權利要求17所述的宿主細胞，以及回收所述蛋白。
20.一種藥物組合物，包含混合藥學上可接受的載體的有效量的權利要求1所述蛋白。
21.一種在需要這種治療的受試者中抑制肌肉生長抑制素活性或激活素活性的方法， 包括向所述受試者給予治療有效量的權利要求20所述的組合物。
22.—種在需要這種治療的受試者中增加瘦肌肉質量或增加瘦肌肉質量與脂肪質量之比的方法，包括向所述受試者給予治療有效量的權利要求20所述的組合物。
23.一種在需要這種治療的受試者中治療肌肉萎縮疾病或代謝障礙的方法，包括向所述受試者給予治療有效量的權利要求20所述的組合物。
24.權利要求23的方法，其中所述肌肉萎縮疾病選自肌肉萎縮癥、肌萎縮側索硬化、 充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、癌癥惡病質、AIDS、腎衰竭、尿毒癥、類風濕性關節炎、 年齡相關少肌癥、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、燒傷、糖尿病、以及由于長期臥床休養、脊髓損傷、中風、骨折、老化或接觸微重力引起的肌肉萎縮。
25.權利要求23的方法，其中所述代謝障礙選自糖尿病、肥胖癥、高血糖癥和骨丟失。
26.一種在需要這種治療的受試者中治療其中激活素過表達的疾病的方法，包括向所述受試者給予治療有效量的權利要求20所述的組合物。
27.權利要求沈的方法，其中所述疾病為癌癥。
28. 一種在需要這種治療的受試者中治療肌肉萎縮或代謝或激活素相關病癥的方法， 包括向所述受試者給予權利要求16所述的載體，其中所述載體能夠在所述受試者中指導 svActRIIB多肽的表達。
全文摘要
本發明提供能夠與激活素A、肌肉生長抑制素或GDF-11結合并抑制其活性的穩定的激活素IIB受體多肽和蛋白。本發明還提供能夠制備穩定的多肽和蛋白的多核苷酸、載體和宿主細胞。還提供用于治療肌肉萎縮疾病和代謝障礙的組合物和方法。
文檔編號C07K14/705GK102245634SQ200980147945
公開日2011年11月16日 申請日期2009年11月24日 優先權日2008年11月26日
發明者H·韓, J·孫, L-T·T·譚, M·L·邁克爾斯, R·德什潘德, T·C·布恩, Y-S·李 申請人:安姆根有限公司