專利名稱：用于獲得口服生物利用度的藥物載體的制作方法
用于獲得口服生物利用度的藥物載體
本發明涉及由至少一種血凝素和多肽-Hc-偶聯物(conjugate)組成的蛋白 質復合物，其中血凝素來源于肉毒梭菌(C7wW&力w ) A 、 B 、 C 、
D、 E、 F或G型中的至少一型，多肽-Hc-偶聯物由選擇的多肽連接于肉毒 毒素(botulinum toxin )的重鏈或其氨基末端片段而構成。
雖然多種藥物試劑都具有高度活性，但是由于這些物質不能夠被口服
給藥，而只能胃腸外給藥，即注射給藥，它們的治療實用性就^皮極大削弱 了。尤其，蛋白質試劑的口服給藥無法實現，因為這些物質無法通過口服 途徑到達它們的作用位點。口服蛋白質后會遇到兩個難以克服的障礙在 胃腸道中的變性環境導致蛋白質失活，大量的蛋白酶促使多肽降解，而且 即使蛋白質能抵抗這些狀況，高分子物質也不能逾越腸粘膜屏障進入血液 而到達作用位點。蛋白質分別在胃和小腸中被蛋白酶切割，切割產物氨基 酸和肽被吸收或排泄。因而，如果口服給藥，蛋白質藥物不能產生效果。
人們進行了許多努力以克服這些缺陷，并且使蛋白質試劑可以通過口 服為生物所利用。這里提到一些方法已有用蛋白酶抑制劑混合物保護試 劑避免蛋白水解的嘗試。在這一方面，采用蛋白酶抑制劑，如抑酶肽 (aprotinin)、苯丁抑制素(bestatin)、。票呤霉素、大豆胰蛋白酶抑制劑，與 蛋白質試劑同時給藥；意欲通過這樣做來防止降解并使蛋白質試劑可不被 破壞而吸收。
同時也有人嘗試了通過配方設計來調整胃/腸中的局部pH值。甚至還 涉及到蛋白質試劑本身，以通過對氨基酸的化學修飾來增加氨基酸的穩定 性及提高可吸收性。對于后者，人們意圖通過增強親脂性(lipophily)例如， 通過十六烷酰化)來實現。例如將胰島素與雙嗜性寡聚物偶聯(NOBEX Corporation公司的己基-胰島素單偶聯物(monoconjugates ))。另 一種手段在 于增強粘膜通透性，例如，通過分別施與螯合劑和表面活性劑，如十二烷 基硫酸鈉、去氧膽酸鈉。這個構思也包括同時施與濃縮的低分子載體分子 (例如，4-(4-2-羥基苯曱酰)-氨基苯基)-丁酸)。另一種手段嘗試在腸壁中使 用特異性的轉運機制。在這方面，存在著吸收維生素B12的轉運機制，人 們意圖通過將蛋白質試劑與維生素B12偶聯來將該機制用于蛋白質試劑。 到目前為止，所有這些不同的手段并非都能產生得到認可的、口服的生物 可利用的蛋白質藥物。
在WO 03/101484中描述了另一種提供口服的生物可利用的蛋白質的方 法。根據其描述，肉毒毒素重鏈的C-末端殘基與多肽聯接。C-末端殘基據 稱能介導穿過上皮膜的運輸。為了口服該雜合蛋白，可以將該雜合蛋白與 天然地圍繞肉毒毒素的輔助蛋白(auxiliary proteins )混合。
此外，WO 02/05844的描述提供了 口服生物可利用的蛋白質和低分子藥 物，它們被整合到復合物中，該復合物是肉毒梭菌的肉毒毒素復合物中的 至少一種血凝素與可能無毒的、非血細胞凝集性的(non-hemagglutinating ) 蛋白質(NTNH)的復合物。但是已經證明，整合分子量<50 kDa的多肽，其 有效性尚不足以滿足可盈利的商品化的要求。
因而,本發明要解決的問題就是提供一種使多肽口服生物可利用的方法。
該問題由定義在本專利權利要求書中的主題內容解決。 以下附解說明本發明。
圖1為大鼠葡萄糖耐受試驗的結果的示意圖。有4只大鼠口服給與(管 祠法)2 U的胰島素-Hc-偶聯物，并有4只大鼠(animals)給與2 U整合在復 合物中(胰島素復合物)的胰島素-Hc-偶聯物。60分鐘后用2 g/kg的葡萄 糖刺激(challenge)這些大鼠。另有3組腹腔注射0.1 U、 0.6 U、 2U胰島 素，同時也給與2g/kg葡萄糖。每隔大約30分鐘測定葡萄糖水平。
圖2的示意圖顯示，胰島素-Hc-偶聯物、整合到復合物(胰島素復合物) 中的胰島素-Hc-偶聯物和腹腔施用的胰島素的效果比較結果。該實驗條件與 圖l采用的條件一致。結果顯示的是葡萄糖濃度曲線下的面積(AUC)。
在本申請中，術語"蛋白質復合物"，是指這樣的載體，其它選擇的多肽 可以通過該載體被運輸到人和動物的血液系統中。所述蛋白質復合物由肉 毒梭菌毒素復合物的至少一種血凝素和可能無毒的、非血細胞凝集性的蛋 白質(NTNH)組成，該肉毒毒素復合物來源于至少一種A、 B、 C、 D、 E、 F 或G型肉毒梭菌。所述血凝素和NTNH指的是存在于梭菌(Clostridia)中存 在的、天然地與肉毒毒素形成復合物的蛋白質。然而，為了清晰起見，要 指出的是所述蛋白質復合物不包含肉毒毒素。
在本申請中，術語"肉毒毒素復合物"是指來自肉毒4炎菌的A、 B、 C、 D、 E、 F或G型的天然蛋白質聚集體，包括肉毒毒素、血凝素和無毒的、非血 細胞凝集性的蛋白質(NTNH)。
在本申請中,術語"多肽"或"選擇的多肽"是指由至少2個氨基酸組成的 肽。所述多肽可以是線性的、環狀的或者分枝的。此外，所述多肽可以由 超過一條的氨基酸鏈組成，其中這些鏈可以彼此連接，例如通過二硫鍵連 接。而且，所述多肽可以包含修飾的氨基酸和常見的翻譯后的修飾，如糖 基化作用。所述多肽可以是具有藥理學或免疫活性的多肽或者用于診斷目 的的多肽，例如抗體。
在本申請中，術語"載體"是指肉毒毒素完整的重鏈(Hc)或其重鏈的氨基 末端片段，該肉毒毒素選自A、 B、 C、 D、 E、 F或G型肉毒毒素復合物。
在本申請中,術語"多肽-Hc-偶聯物"、"Hc-偶聯物"或"偶聯物"是指以共 價鍵連接到選擇的多肽的載體。例如，胰島素-Hc-偶聯物是指由胰島素連接 到肉毒毒素的重鏈或其N-末端片段組成的分子。
在本申請中,術語"新復合物(neocomplex)"是指在其中整合有Hc-偶聯 物的蛋白質復合物的復合物。
肉毒梭菌(C/oWn'&Mw 6of油7wm)已經發展出有效的機制運送蛋白質經 口服途徑進入生物體，其中所述蛋白質隨后被靶細胞吸收。所述蛋白質指 的是至今為止所已知的最毒的物質肉毒梭菌毒素(C/oWnWwm 6of油'raw toxin),在下文中又稱肉毒毒素(botulinum toxin )。在自然條件下，肉毒毒 素和許多另外的由肉毒梭菌表達的蛋白質存在于肉毒毒素復合物中。如果 肉毒毒素復合物被口服施與，那么肉毒毒素這種高分子神經毒素將在腸中 被吸收，并隨后到達靶細胞，即運動終板的運動神經元。在它的作用位點， 該神經毒素阻止乙酰膽堿釋放，因而導致相關肌肉的麻痹。
肉毒梭菌根據它們的毒素被分成7個血清群A, B, C, D, E, F, G 型。所述毒素指的是分子量約為150，000道爾頓(Da)的蛋白質。通常肉毒 毒素復合物與被污染的食物一同攝入，經腸吸收，到達它的作用位點，即 運動終板。
肉毒毒素由兩個亞基組成。每個亞基履行各自的功能重鏈(分子量 100kDa)高度特異地結合到神經細胞，使輕鏈能夠轉移(translocation)進 入細胞的細胞質。在天然的肉毒毒素中重鏈(He)通過二硫橋連接到輕鏈
(Lc)。輕鏈充當蛋白酶，切割那些負責分泌小泡和神經細胞膜的融合作用
的蛋白質(SNARE蛋白質)。從而，導致分泌小泡不能釋;^文乙酰膽^ 威肌 肉的激活作用被阻斷。
兩條鏈都是蛋白酶切割原始合成的多肽而產生的。在一些類型的梭菌 中，切割已經通過梭菌自身的蛋白酶(A、 C型、部分B型)而發生；而在 其他類型中，切割則僅僅發生在受者的腸道中(胰蛋白酶)或組織中。以 分離形式存在并且沒有摻雜任何輕鏈或完整毒素的重鏈是完全無毒的；它 本身不能阻斷神經細胞中乙酰膽堿的釋放。
梭菌還合成許多其它蛋白質，它們與肉毒毒素形成復合物(肉毒毒素 復合物)，其在酸性環境中穩定并能防止該神經毒素變性及被蛋白酶降解， 此外能通過腸粘膜被攝取。
所述其它蛋白質，在下文中稱為復合物蛋白質，指的是一些血凝素和 具有大約120,000 Da的分子量的無毒的、非血細胞凝集性的蛋白質(NTNH)。 這些其它蛋白質形成蛋白質復合物。在A型肉毒梭菌毒素復合物中，描述 了下列血凝素具有大約16,900 Da分子量的Ha2，具有大約21,000 Da分 子量的Ha3a,具有大約52,000 Da分子量的Ha3b和具有大約35,000 Da分 子量的Hal。
B到G型肉毒毒素復合物是以類似的形式構造的。以B型肉毒毒素復 合物為例。在該型中，除NTNH之外還描述了大約70,000 Da的HA-70,大 約17,000 Da的Ha畫17和大約33,000 DaHa-33(參見Bhandari, M. et al. ( 1997) Cw簡w M/cra6/。/。gy 35, pp. 207-214 )。
jt匕夕卜，East, A. K. et al. (( 1994) 5y^em jpp/. ikf/cro6/o17, pp. 306 - 312) 描述了同A型和C型序列作比較的B型Ha-33序列。同樣還描述了 C型和 D型，除Ha33 (二Hal)之夕卜，與A型類似，還有大約33,000 Da的Ha3b， 或大約53,000 Da的Ha3b，大約22-24,000 Da的Ha3a,和大約17，000 Da 的Ha2 (參見I廳e, K. et al, ( 1999) Mz,c,油'o/柳145， pp, 2533 - 2542)。
令人驚奇的是，本發明人在重建(reconstitution)實驗中發現，僅有肉 毒毒素的重鏈，即意味著沒有輕鏈，被單獨地或以與多肽偶聯的形式定量 地整合到蛋白質復合物中。
多肽可以用化學方法偶聯到肉毒梭菌毒素的重鏈，并整合到由至少一 種復合物蛋白質組成的蛋白質復合物中。有多種化學方法可以用于將蛋白質偶聯到所述重鏈。有許多能使兩個不同蛋白質連接的雙功能試劑。優選
地使用與偶聯對象(coupling partner )的半胱氨酸形成二硫橋的試劑。隨后， 在后面的步驟進行與載體、重鏈的連結。適合用于所述結合的試劑如SPDP
(N- 琥 賴 酰 -3-[2- 聯 辟l 基。比 口定-]丙 酸 鹽)(N-succinimidy-3-[2-pyridyldithio]-propionate)或DTDP ( 4,4，-二碌b基二p比 咬)(4,4 ，-dithiodipyridine),其只在蛋白質之間形成二硫橋而沒有間隔物
(spacer )。所述的偶聯有下列優勢，即可以在體內在還原條件下被切割， 例如在細胞質中通過硫氧還蛋白系統被切割。在這種情況下，選擇這樣的 偶聯，使得重鏈整合進入蛋白質復合物干擾，并且多肽的生物活性得以保 持。或者，可以通過在合適的表達系統中將兩種肽作為重組融合蛋白合成， 來實現重鏈與多肽的偶聯。
所述的連接于載體的多肽優選的是有藥理學或免疫活性的多肽，其利 用根據本發明所述的的蛋白質復合物口服施用，其可能具有治療或預防活 性。所述的選擇的多肽可以是例如激素、細胞因子、酶、生長因子、抗原、 抗體、抑制齊'J 、受體激動劑或受體拮抗劑、或凝血因子(coagulation factors )。 在這點上，多肽是重組生產的或還是自它們的天然來源分離的并不是決定 性的。優選的多肽是胰島素，促紅細胞生成素，干擾素，白介素，HIV-蛋 白酶抑制劑，GM- CSF (粒細胞/巨噬細胞刺激因子),NGF (神經生長因子)， PDGF (血小板源性生長因子)，FGF (成纖維細胞生長因子)，纖維酶原激活 物，例如TPA (組織纖溶酶原激活物)，腎素抑制劑，人生長因子，IGF (胰 島素樣生長因子)，疫苗如破傷風疫苗、乙型肝炎疫苗、白喉疫苗，抗體例 如herceptin (抗Her2抗體)、抗TNF(腫瘤壞死因子)抗體、抗EGF受體抗 體、抗VEGF抗體、抗IgE抗體、抗CDlla抗體、降鈣素、尿激酶、鏈激 酶、血管發生抑制劑，因子VIII,因子Xa拮抗劑、金屬蛋白酶抑制劑。
用作診斷目的的多肽可以是例如抗體或配體，其中所述多肽可以帶有 標記物。對于標記物，任意的可以在人或動物體內被一企測到的標記物都可 以考慮。優選的標記物是同位素，例如C13,或方丈射性標記物。標記的抗體 可用于腫瘤的4全測；標記的配體可用于例如病理性(pathological)受體的 檢測。
連接于多肽的載體被整合到所述蛋白質復合物中。蛋白質復合物由至 少一種血凝素，以及需要的話，至少一種NTNH所組成。在這點上，所述
血凝素和NTNH選自天然存在的A、 B、 C、 D、 E、 F或G型肉毒梭菌的肉 毒毒素復合物。然而，所述蛋白質復合物可以含有不同于其天然組成的組 成，例如可以只由血凝素組成而沒有NTNH蛋白質。此外，所述蛋白質復 合物可以由比天然存在的肉毒毒素復合物少的血凝素種類組成，優選由三 種不同的血凝素種類組成，優選由兩種組成，尤其優選地由一種血凝素種 類組成，其中在所有情況下蛋白質復合物都可以含有或不含有NTNH蛋白 質。而且，所述蛋白質復合物可以由不同血清型一個或多個種類的血凝素 混合物和/或不同血清型的NTNH蛋白質所組成。
優選的蛋白質復合物與來自于肉毒梭菌A、 B、 C、 D、 E、 F或G型的 天然存在的蛋白質復合物(不含肉毒毒素)相一致，例如具有來自于肉毒 梭菌B型的Hal、 Ha2、 Ha3a、 Ha3b和NTNH的蛋白質復合物。而且，所 述蛋白質復合物可以由Hal 、 Ha2、 Ha3a和NTNH組成，由Hal 、 Ha2、 Ha3b 和NTNH組成，也可以由Hal 、 Ha3a、 Ha3b和NTNH組成,另外可以由Ha2、 Ha3a、 Ha3b和NTNH組成，由Hal 、 Ha2和NTNH纟且成，由Hal、 Ha3a 和NTNH組成，由Hal 、 Ha3b和NTNH組成，由Ha2、 Ha3a和NTNH組 成，由Ha2、 Ha3b和NTNH組成，由Ha3a、 Ha3b和NTNH組成，或者進 一步由所列復合物蛋白質的任意組合組成。此外，所述蛋白質復合物可以 由血凝素中的一種和NTNH組成；另外所述蛋白質復合物可以由所列的血 凝素的組合組成而不含有NTNH。根據例示的B型蛋白質復合物，進一步 優選A、 C、 D、 E、 F或G型的血凝素和/或NTNH的蛋白質復合物。
本發明的另 一 方面還涉及提供生產本發明所述的蛋白質復合物的方 法，該方法包括下列步驟a )在2.0到大約6.5的pH值范圍內分別分離來 自肉毒梭菌的至少一種A、 B、 C、 D、 E、 F或G型的肉毒毒素復合物，b) 提高pH值到大約7.0-大約IO.O的范圍內，c)通過層析法除去復合物蛋白 質中的各個肉毒梭菌毒素，d )把在步驟c )中獲得的復合物蛋白質與選擇的 多肽-Hc-偶聯物混合，或者e )分離在步驟c )中得到的復合物蛋白質并將至 少一種復合物蛋白質與多肽-Hc-偶聯物混合，f )將步驟d)或e)的混合物對 pH值為大約6.5-大約2.0,優選為大約4.0-大約6.0，特別優選pH值6.0 的緩沖液透析。
復合物蛋白質可以從天然的肉毒毒素復合物中分離。分離方法例舉如 下首先，在酸性pH值下從梭菌分離肉毒毒素復合物，優選在大約2.0到 大約6.5的pH值范圍內，特別優選在大約4.0到大約6.5的pH值范圍內， 尤其優選在pH值為6.0。 pH值提高到大約7.0到大約10.0,優選提高到大 約7.0到大約8.0后，通過蛋白質化學方法中常用的層析法除去肉毒毒素。 所述方法是可實行的，因為該復合物在pH值〈6.5時是穩定的，而分別在 中性和堿性條件下解體(disintegrate),并釋放毒素。接著不含毒素的復合 物蛋白質可以與多肽-Hc-偶聯物混合，可以通過在蛋白質化學方法中常用的 對緩沖液，特別優選對磷酸鹽、乙酸鹽或檸檬酸鹽緩沖液透析的方法將pH 值降低到大約2.0到大約6.5的范圍內，優選降低到大約4.0到大約6.0范 圍內，尤其優選降低到pH值為6.0。從而形成含有多肽-Hc-偶聯物的蛋白 質復合物，并由此為所選擇的多肽提供了 口服生物可利用性。
其它常用在蛋白質化學方法中的層析法、濃縮法和沉淀法也可以用于 復合物蛋白質的分離。
由于其DNA序列已知，所述復合物蛋白質也可以在特定宿主生物中通 過DNA重組技術進行重組生產。如此生產的復合物蛋白質還可以顯示修飾， 這意味著它們可以是復合物蛋白質的衍生物。在這點上，修飾并非只意謂 著缺失、添加、插入或取代，還意味著氨基酸的化學修飾，例如甲基化、 或乙酰化以及翻i,后的修飾，如糖基化或磷酸化。在不同宿主表達所需蛋 白質是本領域技術人員所熟知的，不需要在此分別闡述。在這點上，所述 蛋白質復合物所需的復合物蛋白質可以在宿主生物中分別或同時表達。優 選地，所述重組復合物蛋白質在細菌中，例如大腸桿菌(￡. co/0、枯草芽 孑包桿菌(Sacz7/w ra/)"to )或？艮難才炎菌(C/o frWwm &#"7e )中生產，或者 在真核細胞中，例如在CHO細胞、在昆蟲細胞中，如使用桿狀病毒 (Baculovirus )系統，或者在酵母中進行生產。根據上述的方法，所述復合 物蛋白質可以被分離并與選擇的多肽偶聯物混合。此外，可以將選擇的多 肽-Hc-偶聯物和所述的復合物蛋白質在宿主生物中作為融合蛋白同時表達。 特別優選的是所述各個復合物蛋白質同選擇的多肽-Hc-偶聯物在酵母菌中 通過YAC同時或分別生產。
此外,根據本發明所述的蛋白質復合物可以由重組生產的復合物蛋白質 和從天然肉毒毒素復合物分離的復合物蛋白質的混合物組成。
以下通過實施例是對本發明的舉例說明，不應理解為限制性的。 實施例1:分離A型肉毒梭菌毒素的重鏈
根據公開發表的方法培養A型肉毒梭菌毒素(菌株ATCC 3502),并進 4亍下歹'J變4匕(參見Das Gupta & Sathyamoorthy, 1984, 7bxz'cow 22, pp. 415 -424)。生長72h后，加入3 N碌u酸對毒素進行沉淀。l是耳又沉淀物并除去核 酸，而后用石克酸銨沉淀毒素。在溶解及透析之后，在pH 6.0進行 DEAE-sepharose離子交換層析(2.6 x 15 cm)。用150 mM NaCl洗脫結合 的毒素，將其對50 mM Tris/HCl透析并使用sepharose Q柱(2.6 x 10.0 cm) 進一步進行離子交換層析。用NaCl梯度(0-300 mM NaCl)洗脫該神經毒 素。合并含有該神經毒素的級分，對10mM磷酸鈉鹽(NaPhosphate) ， pH 7.0透析。將透析液上sepharose S-柱(1.6 x 11 cm)，用NaCl梯度(0-300 mM NaCl)洗脫。經離子交換層析得到高純度神經毒素。
按照出版文獻(參見Kozaki et al. 1981, J她d 5W.腸/. 34， pp. 61 - 68) 分離神經毒素重鏈，并進行下列變化。在這點上，將高純度的A型神經毒 素對硼酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 8.5透析，然后結合到填充了 QAE - Sephadex 的柱(1 x 5 cm)上。用另含有10 mM DTE的硼酸鹽/磷酸鹽緩沖液洗滌， 而后用另含有150 mM DTE和2 M尿素的3 ml硼酸鹽/磷酸鹽緩沖液與層析 柱溫育過夜。隨后用硼酸鹽/磷酸鹽緩沖液+10 mM DTE+2 N尿素洗脫輕鏈， 接著用200 mM NaCl洗脫與同樣的緩沖液混合的重鏈。為了除去殘余的除 去不完全的活性神經毒素，將合并的級分泵過親和層析柱四次。該親和層 析柱填充著偶聯了抗A型肉毒梭菌毒素輕鏈的抗體的sepharose。在所述層 析之后，可得到不混雜有任何輕鏈或其天然毒素的重鏈。即使在高濃度下， 活性試驗也沒有顯示其活性(小鼠膈測定(diaphragm assay ))。
實施例2:制備B型肉毒梭菌的復合物蛋白質
B型肉毒梭菌的復合物蛋白質是根據公開發表的方法(參見Evans et al., 1986; European Journal of Bioch. 154, pp. 409 - 416)用B型肉毒梭菌(Okra抹) 發酵后分離的，上述方法中一些步驟作了改變
如同實施例l,在提取酸沉淀的生物質之后，從提耳又物中沉淀出核酸， 用硫酸銨從上清液中沉淀出毒性的肉毒毒素復合物。將沉淀物重懸于pH 5.5 的0.05 M檸檬酸鈉+l mM EDTA,透析，而后使用DEAE-sephadex層析法 純化，其中高分子復合物不結合于層析柱(5 x 12 cm)而定量地流過層析柱。
將含有復合物的洗出液對50 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7.9透析后， 用sepharoseQ-層析柱進行層析，其中復合物蛋白質不結合于層析柱，而神 經毒素保持結合于層析柱，且僅被鹽梯度洗脫。在Q Hyper D柱(2.6 x 13 cm) 上對所述復合物蛋白質進行進一步的純化，其中層析柱用相同的緩沖液(50 mM Tris/HCl， 1 mM EDTA )平衡。用氯化鈉梯度(0-300 mM NaCl)洗脫不 含毒素的蛋白質復合物。
用親和層析法除去最后的微量神經毒素。為此目的，將含有復合物的 溶液泵過柱四次，其中層析柱含有與抗B型毒桿菌神經毒素抗體(IgG級 分)偶聯的sepharose作為親合性基質。接著，在活性試驗(小鼠偏側膈測 定)中不再測得到其生物活性(毒性)。
實施例3:把A型肉毒梭菌毒素的重鏈整合進B型肉毒梭菌的蛋白質 復合物
把lOO(ig (34pi)實施例2的來自B型的高度純化的復合物蛋白質與 200(ig (690|il)實施例1的從分離的A型重鏈混合。將混合物對含150 mM NaCl的1 1 50 mM磷酸鈉，pH 6.0鹽緩沖液，在2 - 8°C透析3天。接著， 取450fi1,加入150(il 4 M硫酸銨進行沉淀。在這樣的沉淀條件下，未整合 進蛋白質復合物的重鏈繼續存在于溶液中，而蛋白質復合物(整合或未整 合有重鏈)定量地沉淀出來。再孵育過夜后，離心沉淀，然后重懸于120^1 磷酸鈉鹽，mmNaCl，2mMEDTA, pH6.0。通過BioSep S-3000進行"凝膠過 濾，，檢測蛋白質復合物的形成。層析圖譜只顯示單個峰(在分子量為大約 500,000道爾頓處)。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示峰級分同時含有B型復 合物蛋白質和A型肉毒毒素的重鏈。
實施例4:把胰島素結合到A型肉毒毒素的重鏈 合成SPDP -胰島素
將12.5 mg的胰島素(Roche,重組)溶于6,3 ml的緩沖液(10 mM碳酸 鈉，pH = 6.9)。為此目的，用移液器注入3nlcitaconanhydride(Fluka)以封閉 a-氨基，將所述混合物在室溫下孵育，并觀測其pH值。通過加入1 MNaOH 保持pH值在6.8 - 7.0。接著，將反應混合物對50 mM磷酸鈉，100 mM氯 化鈉，pH = 7.3在4°C下透析過夜。
將6.2 mg的SPDP (N-琥珀酰-3-[2-聯硫基吡啶-]丙酸鹽，Pierce)溶于 50(^1的DMF。將274|il的所述溶液加入6.3 ml的胰島素衍生物(調節pH =8.3 )，室溫下在混合器上孵育該混合物P/2h。對50 mM磷酸鈉，100 mM NaCl, pH = 7.3透析除去仍殘留的SPDP。為了除去保護基團，對水透析(在 室溫下2 h )，再在室溫下對10 mM HC1透析51/2 h。最后，對50 mM磷酸鈉， lOOmM氯化鈉，4mMEDTA, pH = 7.3透析過夜(SPDP溶液的終體積7 ml )。
生產胰島素-Hc-偶聯物
將25 mg根據實施例l分離的來自A型肉毒毒素的重鏈與8mg胰島素 -SPDP(終體積41.5 mg )混合，在4。C孵育4天(翻轉式混合器(end-over-end mixer ))。為了除去未偶聯的胰島素-SPDP,對50 mM Tris/HCl, 250 mMNaCl, lmMEDTA進行透析，其中透析軟管(hose)排阻極限為50 kD。
用Western印跡分析該產物。用抗胰島素抗體鑒定了 100kD分子量的 蛋白質。從而，它代表重鏈和胰島素的偶聯物(一夷島素-Hc-偶聯物)。用 3T3細胞在體外檢測到了胰島素的活性。
實施例5:把胰島素-Hc-偶聯物整合到B型肉毒梭菌的蛋白質復合物中 將7.4 mg的胰島素-Hc-偶聯物(實施例4的)與21 mg的蛋白質復合物 (根據實施例2所純化的)在52ml中混合，在4。C下對50 mM磷酸鈉， 250 mM NaCl, 1 mM EDTA， pH 6.0透析4天。使用BioSep S-3000層析柱 (Phenomenex)通過凝月交過濾分析500(il的樣品。只在~ 600 kD分子量處顯 示一個高分子峰。通過Western印跡分析峰級分樣品。使用抗胰島素抗體顯 示，胰島素(作為胰島素-Hc-偶聯物)整合進了蛋白質復合物(由肉毒梭菌 的復合物蛋白質組成)。
實施例6:使用葡萄糖耐受性試驗在大鼠中測試胰島素新復合物
在大鼠中進行動物實驗，檢測整合進蛋白質復合物的胰島素-Hc-偶聯物
(在下文中稱為胰島素新復合物)口服后的有效性。
對4只大鼠的組給與胰島素新復合物或給與游離的胰島素-Hc-偶聯物
(沒有復合物蛋白質)處理。未經處理的動物作為對照。各組的胰島素劑 量是相同的，都是2U/每動物。溶液用管飼法給與。作為另外的對照，通
過月復腔注射給與0.1 U， 0.6 U和2.0 U的胰島素。在施用胰島素新復合物和 游離胰島素-Hc-偶聯物后1 h,用葡萄糖(2g/kg 口月良)刺激。在這個時間點， 陽性對照也進行注射(0.1 U， 0.6 U和2.0單位的胰島素)。在30, 60, 120和 180min后采血，測定葡萄糖水平。60min后，在對照動物中，達到了大約 140mg/ml的最大葡萄糖濃度，而在用胰島素新復合物處理了的動物組，濃 度只增加了很少(參見圖1)。如果注意葡萄糖濃度的進展變化(曲線下面 積，AUC),胰島素新復合物的效果與腹腔注射給藥的胰島素是可以比較的 (圖2 )。
在只用胰島素-Hc-偶聯物處理的動物中，葡萄糖濃度與對照組表現一 樣濃度強烈升高直到60 min的時間點。由此可以推斷單獨的胰島素-Hc-偶聯物對胰島素水平沒有影響；從而，施用未整合入蛋白質復合物的胰島 素-Hc-偶聯物不適于使胰島素口服生物可利用。
實施例7 :比較胰島素-Hc-偶聯物的整合體和連接于肉毒毒素重鏈C末 端的胰島素
在大腸桿菌中重組表達A型肉毒梭菌毒素重鏈的C-末端片段(Mr 50 kD;在下文中又稱H1片段)。為此目的，將連接于His標簽的A型肉毒毒 素的C-末端片段氨基酸871-1296 (N1INT...... ERPL)的DNA序列克隆到載
體pBN29 4772中；以該載體轉化大腸桿菌N15 [pREP4] ( Quiagen),使用 Ni-NTA-sepharose柱以親和層析法純化表達片段。
將100昭的來自B型肉毒梭菌的不含毒素的復合物蛋白質和200嗎 (340)il)的重組C-末端片段混合，在2-8。C對50mM磷酸鈉鹽，150 mM NaCl, pH 6.0透析3天。然后，用H20補充反應物到450^1,加入150^1的 4M硫酸銨沉淀。在這樣的沉淀條件下，未整合進蛋白質復合物的C-末端 片段繼續存在于溶液中，而蛋白質復合物(整合或未整合有C-末端片段) 定量沉淀。再溫育過夜后，離心沉淀，然后重懸于150|11的50 mM磷酸鈉 鹽，150 mM NaCl， 2 mM EDTA, pH 6.0。取100(il過Biosep S-3000凝膠過濾 柱分離成所述復合物和可能作為污染物存在的非結合C-末端片段。洗脫出 2個峰第一個峰(12.2min)代表所述蛋白質復合物。 一個很小的峰表示游離 的C-末端片段-片段。用SDS-PAGE檢驗第一個峰；只存在所述復合物蛋白 質；因而，在硫酸銨沉淀時，C-末端片段沒有整合進所述復合物而是以非
結合的狀態保持在溶液中。總之，肉毒毒素的C-末端片段不能整合到所述 復合物中。
實施例8:比較胰島素-Hl-偶聯物和胰島素-Hc-偶聯物的生物活性 按照實施例7所述的方法生產A型肉毒毒素重鏈的C-末端片段(H1片 段)。在衍生化后，將13 mg Hl片段與8mg胰島素-SPDP混合。以類似實 施例4的方法生產胰島素-SPDP。在4。C保溫24小時后，對50 mM Tris/HCl, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA透析除去非偶聯的胰島素-SPDP。
同在復合物中整合重鏈(實施例5 )—樣，在4°C對50 mM磷酸鈉鹽，250 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 6.0透析3.8 mg ( Hl-胰島素-偶聯物)和21 mg不 含毒素的蛋白質復合物(根據實施例2純化所得)5天。利用動物實驗檢驗 這些混合物。
對4只大鼠組成的組，用胰島素-Hc-偶聯物(實施例5),或用胰島素-H1-偶聯物+復合物蛋白質，或用鹽水溶液處理。前兩組的劑量是每只動物2 U 胰島素。給藥后lh,用葡萄糖進行刺激(0.5 g/kg腹腔注射)。30min后測 量血糖水平，顯示接受鹽處理的動物組血糖水平為170士12 mg/dl，而給與 HC-偶聯物新復合物的動物組只上升到115±14mg/dl。在葡萄糖注射的時間 點的初始值為85±14mg/dl。最后，帶有復合物蛋白質的HI-胰島素-偶聯物 沒有在動物實驗中顯示任何影響。
實施例9:使用具有C-末端縮短的重鏈的胰島素-偶聯物 為了獲得C-末端縮短30個氨基酸的鏈，從A型肉毒梭菌(ATCC 3502 ) 的培養物制備染色體DNA。通過PCR擴增，將編碼輕鏈的基因片段克隆到 質粒pQEM ( pQE-BoNT (A )-L)中，其中該片段在環狀區域另含有凝血酶切 割位點。通過PCR擴增從染色體的DNA生成編碼C-末端縮短30個氨基酸 的鏈的基因片段。將所述基因片段克隆到表達質粒pQE-BoNT (A)-L中 BoNT(A)-L編碼基因片段的3'末端(pQE-BoNT( A) A)-LH30min)。以所 述質粒轉化大腸桿菌表達株M15 [pREP4](Qiagen)。用500)_iM IPTG ( 25°C 過夜)誘導，而后裂解細胞，用Ni-NTA-瓊脂糖柱層析。從這樣獲得的縮短 了 30個氨基酸的毒素中，如實施例1所述分離重鏈H30min。將重鏈H30min 與實施例4類似地與胰島素偶聯，并與實施例5類似地整合到來自B型肉 毒梭菌的不含毒素的復合物中。
用葡萄糖耐受試驗測試如此合成的新復合物，測試使用4只動物，與
沒有復合物的對照比較(如實施例8所述)。給與相當于2U胰島素的劑量 時，30min后血糖水平升至110±18mg/dl,而對照動物中升至168±14 mg/dl (初始值為90±5 mg/dl)。
權利要求
1.蛋白質復合物，由至少一種來源于肉毒梭菌A、B、C、D、E、F或G型中至少一型的血凝素和多肽-Hc-偶聯物組成，其中多肽-Hc-偶聯物由選擇的多肽連接于肉毒毒素的重鏈或其N-末端片段而構成。
2. 根據權利要求1的蛋白質復合物，其中血凝素是來源于A、 B、 C、 D、 E、 F或G型肉毒才炎菌中至少一型的血凝素的混合物。
3. 根據前述任一項權利要求的蛋白質復合物，其中蛋白質復合物還含 有無毒的、非血細胞凝集性的蛋白質。
4. 根據前述任一項權利要求的蛋白質復合物，其中重鏈分離自A、 B、 C、 D、 E、 F或G型肉毒毒素復合物中的一種。
5. 根據前述任一項權利要求的蛋白質復合物，其中重鏈是在合適的表 達系統中重組表達的。
6. 根據前述任一項權利要求的蛋白質復合物，其中多肽是激素、細胞 因子、生長因子、抗原、抗體、抑制劑、受體激動劑或受體拮抗劑、或凝 血因子。
7. 根據前述任一項權利要求的蛋白質復合物，其中選擇的多肽和重鏈 或其N-末端片段是以融合蛋白的方式重組產生的。
8. 根據權利要求1 - 6任一項所述的蛋白質復合物，其中選擇的多肽和 重鏈或其N-末端片段是通過化學鍵連接的。
9. 根據權利要求8的蛋白質復合物，其中化學鍵是二硫鍵。
10. 根據權利要求8的蛋白質復合物，其中化學鍵是肽鍵。
11. 生產前述任一項權利要求的蛋白質復合物的方法，該方法包括步驟a) 在pH值為2.0-6.5的范圍內，從肉毒梭菌分離肉毒毒素復合物；b) 調整步驟a)中分離的肉毒毒素復合物的pH值到7.0-10.0的范圍；c) 通過層析法從復合物蛋白質中除去肉毒毒素；d) 把步驟c)中獲得的復合物蛋白質與多肽-Hc-偶聯物混合；或者e) 分離在步驟c)中得到的復合物蛋白質，并將至少一種復合物蛋白質 與多肽-Hc-偶聯物混合；f )對pH值為6.5-2.0范圍的緩沖液透析步驟d)或e)的混合物。
12. 根據權利要求1 - IO任一項所述的蛋白質復合物作為運輸載體的 用途，其用于運送具有藥理學活性、免疫活性的多肽，或用作診斷的目的 的多肽。
全文摘要
本發明涉及由至少一種血凝素和多肽-Hc-偶聯物組成的蛋白質復合物，其中血凝素來源于A、B、C、D、E、F或G型肉毒梭菌(Clostridium botulinum)中的至少一型，多肽-Hc-偶聯物由選擇的多肽連接于肉毒梭菌毒素的重鏈或其氨基末端片段而組成的。
文檔編號A61P3/00GK101340932SQ200580024486
公開日2009年1月7日 申請日期2005年7月22日 優先權日2004年7月22日
發明者于爾根·弗雷弗特, 托馬斯·斯蒂博拉 申請人:比奧泰康醫療有限責任公司