橙黃決明素或其衍生物在制備降血脂藥物中的應用的制作方法

專利名稱：橙黃決明素或其衍生物在制備降血脂藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及橙黃決明素及其衍生物在制備降血脂藥物中的應用，屬于醫藥領域。
背景技術：
高脂血癥是一種常見疾病，系人體脂質代謝失調所致。臨床檢驗為血清膽固醇(TC)或甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(β-脂蛋白)過高；高密度脂蛋白(α-脂蛋白)趨于下降或低于正常值。高脂血癥易誘發冠心病、腦中風、高血壓等心血管疾病，還可能引起膽結石、胰腺炎，導致男性性功能障礙、老年癡呆等疾病。
決明子為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明C.tora.L.的干燥種子，為臨床常用中藥。性味甘、苦、咸，微寒。歸肝、腎、大腸經。具有清肝明目，潤腸通便的功效。現代研究證明決明子具有將血壓，調血脂，保肝及抑菌等活性，同時又可作為保健食品。《中國藥典》2000年版決明子項下，采用大黃素、大黃酚為對照品進行薄層色譜定性鑒別；《中國藥典》2005年版增加了含量測定項(用大黃酚為對照品)。眾所周知，大黃素、大黃酚并非決明子的專屬成分(例如大黃、首烏、虎杖等中藥均含有)，且大黃素、大黃酚并不具有降血脂活性。目前，決明子降血脂制劑也普遍采用上述方法對決明子進行質量控制。
《中草藥》，決明子蒽醌類化學成分的研究，郝延軍，桑有黎，趙余慶，2003年1月，34(1)；p18-19對決明子的化學成分進行的研究，公開了包括橙黃決明素在內的6個蒽醌類化合物。決明子提取物降脂作用的研究[J].李楚華，李續娥，郭寶江.華南師范大學學報，2002，(4)29公開了決明子提取物蒽醌苷類有導瀉作用，能減少腸道對膽固醇的吸收和增加排泄，通過反饋調節低密度脂蛋白代謝，從而降低血清膽固醇水平，延緩和抑制動脈粥樣硬化斑塊形成。但是，目前為止，還未見有關橙黃決明素及其衍生物能增強熒光素酶活性，對低密度脂蛋白受體基因轉錄水平有增強作用的報道和橙黃決明素及其衍生物在制備治療降血脂藥物中的應用的研究報道。

發明內容
本發明的技術方案是提供橙黃決明素及其衍生物在制備治療降血脂藥物中的應用。
其中，橙黃決明素及其衍生物具有式I結構
R1為-H或-OCH3；R2為-H、-OH、-OCH3、-COOH或-Oglu；R3為-OH、或-Oglu；進一步地，R1為-H或-OCH3；R2為-OH；R3為-OH、或-Oglu。
更優選的方案是R1為-OCH3；R2為-OH、R3為-OH。
本發明提供的橙黃決明素及其衍生物的制備方法為取決明子粗粉石油醚除去脂溶性物質后用正丁醇提取，將正丁醇提取物上AB-8大孔吸附樹脂，水或乙醇溶液洗脫，洗脫物上硅膠柱；(比如可以依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脫，取80％乙醇洗脫物上硅膠柱)用氯仿-甲醇梯度洗脫，分段收集氯仿-甲醇(9∶1)、(4∶1)、(3∶1)，然后分別將各段洗脫物經硅膠柱層析(石油醚-丙酮梯度洗脫)、C18柱層析(甲醇-水梯度洗脫)和Sephadex LH-20柱層析(甲醇-水梯度洗脫)進行分離，得到6個單體化合物化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV、化合物V、化合物VI。分離流程如圖1。
對分離得到的6個單體化合物進行重結晶，用薄層色譜法、高效液相色譜法對純化后的化合物進行純度檢查。薄層色譜法檢查均未見雜質斑點，高效液相色譜法測得6個單體化合物純度(面積歸一化法)均達95％以上。
本發明還提供了一種用于降血脂的藥物組合物，它是由式I結構的化合物為活性成分加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑， R1為-H或-OCH3；R2為-H、-OH、-OCH3、-COOH或-Oglu；R3為-OH、或-Oglu。進一步地，所述化合物為橙黃決明素，其中，每制劑單位含有橙黃明素4.5～5.5mg。所述的每制劑單位是指片劑的每片、膠囊劑的每粒、丸劑的每10g、顆粒劑的每10g。
所述制劑是口服制劑、注射制劑。
通過檢測添加樣品前后細胞內熒光素酶的活性，結果表明化合物II能明顯增加熒光素RLU，增加率為115.24％；其余化合物也能在一定程度上增加RLU，表明化合物II具有顯著降血脂活性，為臨床降血脂提供了一種新的選擇。
顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。


圖1橙黃決明素及其衍生物的分離流程圖具體實施方式
下面將結合具體實施例和附圖對本發明作進一步詳述，但不應理解為是對本發明的進一步限定，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，做出其它多種形式的修改、替換或變更所實現的技術均屬于本發明的范圍。
實施例1橙黃決明素的制備取決明子粗粉1公斤，用石油醚1800毫升提取除去脂溶性物質，用1800毫升正丁醇提取，得正丁醇提取物38克。將正丁醇提取物上AB-8大孔吸附樹脂，依次用水、20％乙醇、80％乙醇洗脫。取80％乙醇洗脫物上硅膠柱，用氯仿-甲醇梯度洗脫，分段收集氯仿-甲醇(9∶1)、(4∶1)、(3∶1)洗脫液，然后分別將各段洗脫物經硅膠柱層析(石油醚-丙酮梯度洗脫)、C18柱層析(甲醇-水梯度洗脫)和Sephadex LH-20柱層析(甲醇-水梯度洗脫)進行分離，得到6個單體化合物化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV、化合物V、化合物VI。分離流程如圖1。所述的分離過程為(1)運用大孔吸附樹脂進行初分將正丁醇提取物上AB-8大孔吸附樹脂，用不同濃度的乙醇依次洗脫，以薄層層析為指導，按組分的分布情況確定乙醇的濃度和用量，最終確定用水、20％乙醇、80％乙醇依次進行洗脫，分段收集洗脫液，回收溶劑，得到各段洗脫物。
(2)80％乙醇洗脫物的硅膠柱層析采用氯仿-甲醇進行梯度洗脫，分段收集。在洗脫劑的選擇上，比較了氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、正丁醇-乙酸-水等多個系統，結果發現氯仿-甲醇系統有較好的分離和洗脫能力，因此，確定采用氯仿-甲醇系統進行洗脫。分別得到氯仿-甲醇(9∶1)、氯仿-甲醇(4∶1)和氯仿-甲醇(3∶1)三個梯度洗脫組分。
(3)氯仿-甲醇(9∶1)洗脫物的成分分離氯仿-甲醇(9∶1)洗脫物極性相對較低，采用硅膠柱層析進行分離。在洗脫劑的選擇上，考察多個洗脫系統，結果氯仿-甲醇系統和石油醚-丙酮系統均有較好的分離度，從節約成本的角度考慮，確定采用石油醚-丙酮系統進行梯度洗脫。得到了2個單體化合物即化合物I和化合物II。
(4)氯仿-甲醇(4∶1)洗脫物的成分分離氯仿-甲醇(4∶1)洗脫組分，在薄層色譜上，運用多個展開系統，分離度均較差。采用硅膠柱層析進行預試驗，也未能得到單體成分。又采用Sephadex LH-20柱層析進行預試驗，有較好的分離效果，因此，用Sephadex LH-20柱層析，以甲醇-水系統進行梯度洗脫。得到2個單體化合物，即化合物III和化合物IV。
(5)氯仿-甲醇(3∶1)洗脫物的成分分離氯仿-甲醇(3∶1)洗脫物，在薄層色譜上，運用多個展開系統，均不能得到較好的分離度。采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析進行預試驗，也未能得到單體成分，又采用反相柱層析(C18)進行分離，得到2個單體化合物，即化合物V和化合物VI。
化合物I黃色針晶(環己烷-丙酮)，mp163～165℃，Borntrager反應呈陽性，Molish反應呈陰性。
UVλmaxMeOH(nm)224、275、401。
IR(KBr)cm-13342(OH)；2973，2921，2850(C-H)；1657(游離C＝O)；1635(締合C＝O)。
高分辨ESI-MSm/z307.0587[M+Na]-，確定分子式為C16H12O5。由分子式可知該化合物的不飽和度為11(與所推測的結構中3個環，6個C＝C鍵，2個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，CD3COCD3)δppm147.2(C-1)、155.2(C-2)、132.5(C-3)、126.1(C-4)、118.3(C-5)、136.3(C-6)、123.5(C-7)、162.0(C-8)、188.8(C-9)、181.0(C-10)、133.3(C-11)、116.9(C-12)、123.7(C-13)、125.9(C-14)、61.2(-CH3O)、15.8(-CH3)。
DEPT(θ＝135°)有10個季碳(C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，4個CH(C-4、C-5、C-6、C-7)，2個CH3(1-CH3O，3-CH3)。
1H-NMR(600MHz，CD3COCD3)δppm7.93(1H，s，H-4)，7.31(1H，dd，J＝8.2，1.1Hz，H-5)，7.73-7.78(2H，m，H-6，H-7)，3.97(3H，s，1-OCH3)，2.41(3H，s，3-CH3)。
根據以上數據的分析，并且與文獻對照一致，確定其為鈍葉素，即2，8-二羥基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌，結構如下 obtusifolin(2，8-dihydroxy-1-methoxy-3-methylanthraquinone)化合物II黃色針晶(環己烷-丙酮)，mp229～231℃，Borntrager反應呈陽性，Molish反應呈陰性。
UVλmaxMeOH(nm)285、313、393。
IR(KBr)cm-13448(OH)；2951，2928，2851(C-H)；1656(游離C＝O)；1627(締合C＝O)。
高分辨ESI-MSm/z329.0687[M-H]-，確定分子式為C17H14O7。由分子式可知該化合物的不飽和度為11(與所推測的結構中3個環，6個C＝C鍵，2個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，CD3COCD3)δppm147.1(C-1)、155.1(C-2)、131.8(C-3)、126.1(C-4)、107.2(C-5)、156.9(C-6)、139.4(C-7)、156.1(C-8)、187.7(C-9)、180.5(C-10)、129.3(C-11)、111.9(C-12)、123.9(C-13)、125.9(C-14)、61.2(-CH3O)、59.9(-CH3O)、15.7(-CH3)。
DEPT(θ＝135°)有12個季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，2個CH(C-4、C-5)，3個CH3(1-CH3O，7-CH3O，3-CH3)。
1H-NMR(600MHz，CD3COCD3)δppm7.87(1H，s，H-4)，7.26(1H，s，H-5)，3.98(3H，s，1-OCH3)，3.95(3H，s，7-OCH3)，2.48(3H，s，3-CH3)。
根據以上數據的分析，并且與文獻對照一致，確定其為橙黃決明素，即2，6，8-三羥基-1，7-二甲氧基-3-甲基蒽醌，結構如下 aurantio-obtusin(2，6，8-trihydroxy-1，7-dimethoxy-3-methylanthraquinone)化合物III黃色針晶(甲醇-水)，mp255～256℃，Borntrager反應呈陽性，Molish反應呈陽性。
UVλmaxMeOH(nm)209、278、399。
IR(KBr)cm-13395(OH)；2938(C-H)；1663(游離C＝O)；1629(締合C＝O)。
高分辨ESI-MSm/z505.1361[M-H]-，確定分子式為C24H26O12。由分子式可知該化合物的不飽和度為12(與所推測的結構中4個環，6個C＝C鍵，2個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，MeOD)δppm153.6(C-1)、154.6(C-2)、141.7(C-3)、125.5(C-4)、102.8(C-5)、157.9(C-6)、141.3(C-7)、156.2(C-8)、187.5(C-9)、181.1(C-10)、128.6(C-11)、112.8(C-12)、124.6(C-13)、130.1(C-14)、61.0(1-CH3O)、59.8(6-CH3O)、55.5(7-CH3O)、16.7(-CH3)、103.6(C-1’)、74.2(C-2’)、76.9(C-3’)、70.1(C-4’)、76.5(C-5’)、61.1(C-6’)。
DEPT(θ＝135°)有12個季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，7個CH(C-4、C-5、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’)，4個CH3(1-CH3O、6-CH3O、7-CH3O，3-CH3)，1個CH2(C-6’)。
1H-NMR(600MHz，MeOD)δppm7.89(1H，s，H-4)，7.40(1H，s，H-5)，4.03(3H，s，6-OCH3)，3.98(3H，s，1-OCH3)，3.94(3H，s，7-O CH3)，2.49(3H，s，3-CH3)，5.22(1H，d，J＝7.44，H-1’，β構型)，3.24-3.80(6H，m，glucosyl-H)。
根據以上數據的分析，并且與文獻對照一致，確定其為鈍葉決明素苷。即2-O-β-D-葡萄糖-8-羥基-1，6，7-三甲氧基-3-甲基蒽醌，結構如下 Gluco-obtusin(2-O-β-D-glucopyranosyl-8-hydroxy-1，6，7-trimethoxy-3-methylanthraquinone)化合物IV黃色針晶(甲醇-水)，mp246～249℃，Borntrager反應呈陽性，Molish反應呈陽性。
UVλmaxMeOH(nm)220、261、401。
IR(KBr)cm-13576，3449(OH)；2996，2926，2847(C-H)；1669(游離C＝O)；1638(締合C＝O)。
高分辨ESI-MSm/z445.1143[M-H]-，確定分子式為C22H22O10。由分子式可知該化合物的不飽和度為12(與所推測的結構中4個環，6個C＝C鍵，2個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，MeOD3)δppm153.6(C-1)、154.7(C-2)、142.2(C-3)、125.4(C-4)、118.3(C-5)、135.9(C-6)、123.9(C-7)、162.1(C-8)、188.3(C-9)、181.8(C-10)、132.8(C-11)、116.8(C-12)、124.6(C-13)、130.3(C-14)、61.0(-CH3O)、16.7(-CH3)，103.6(C-1’)、74.2(C-2’)、76.9(C-3’)、70.1(C-4’)、76.6(C-5’)、61.1(C-6’)。
DEPT(θ＝135°)有10個季碳(C-1、C-2、C-3、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14)，9個CH(C-4、C-5、C-6、C-7、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’)，2個CH3(1-CH3O、3-CH3)，1個CH2(C-6’)。
1H-NMR(600MHz，MeOD3)δppm7.93(1H，s，H-4)，7.27(1H，d，J＝8.1Hz，H-5)，7.67-7.71(2H，m，H-6，H-7)，3.98(3H，s，1-OCH3)，2.48(3H，s，3-CH3)，5.21(1H，d，J＝7.44，H-1’，β構型)，3.22-3.78(6H，m，glucosyl-H)。
根據以上數據的分析，并且與文獻對照一致，確定其為鈍葉素苷。即2-O-β-D-吡喃葡萄糖-8羥基-1-甲氧基-3-甲基蒽醌，結構如下
Gluco-obtusifoin(2-O-β-D-glucopyranosyl-8-hydroxy-1-methoxy-3-methylanthraquinone)化合物V白色針晶(甲醇-水)，mp235～237℃，Borntrager反應呈陰性，鹽酸-鎂粉反應呈陰性，Molish反應呈陽性。
UVλmaxMeOH(nm)249。
IR(KBr)cm-13410，3260(-OH)；3034，1568，1594(苯環)；1515，1249(C-O-C)；2926，2889(C-H)；1634(C＝O)。
高分辨ESI-MSm/z415.1011[M-H]-，確定分子式為C21H20O9。由分子式可知該化合物的不飽和度為12(與所推測的結構中4個環，7個C＝C鍵，1個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，MeOD)δppm153.7(C-2)、124.8(C-3)、176.7(C-4)、126.9(C-5)、115.6(C-6)、162.1(C-7)、103.6(C-8)、157.4(C-9)、118.8(C-10)、122.7(C-1’)、129.9(C-2’、C-6’)、114.9(C-3’、C-5’)、157.8(C-4’)、100.4(C-1”)、73.4(C-2”)、76.9(C-3”)、69.9(C-4”)、76.5(C-5”)、61.1(C-6”)。
DEPT(θ＝135°)有7個季碳(C-3、C-4、C-7、C-9、C-10、C-1’、C-4’)，13個CH(C-2、C-5、C-6、C-8、C-2’、C-6’、C-3’、C-5’、C-1”、C-2”、C-3”、C-4”、C-5”)；1個CH2(C-6”)。
1H-NMR(600MHz，MeOD)δppm8.21(1H，s，H-2)，8.14(1H，d，J＝8.8Hz，H-5)，7.38(2H，d，J＝8.7Hz，H-2’、H-6’)，7.25(1H，d，J＝2.1Hz，H-8)，7.21(1H，dd，J＝8.8，2.1Hz，H-6)，6.85(2H，d，J＝8.7Hz，H-3’、H-5’)，5.11(1H，d，J＝7.32，H-1”，β構型)，3.41-3.94(6H，m，glucosyl-H)。
根據以上數據的分析，并且與文獻對照一致，確定其為大豆苷，即7-O-β-D-吡喃葡萄糖-4’-羥基異黃酮。結構如下
Daidzin(7-O-β-D-glucopyranosyl-4’-hydroxyisoflavone)化合物VI淺黃色針晶(甲醇-水)，mp249～251℃，Borntrager反應呈陰性，Molish反應呈陽性。
UVλmaxMeOH(nm)231、274、310、321、391。
IR(KBr)cm-13421(OH)；2921，2888(C-H)；1634(C＝O)；1588(苯環)；1457，1376(CH3)。
高分辨ESI-MSm/z555.1739[M-H]-，確定分子式為C25H32O14。由分子式可知該化合物的不飽和度為10(與所推測的結構中4個環，5個C＝C鍵，1個C＝O鍵相吻合)。
13C-NMR(600MHz，MeOD)δppm161.5(C-1)、109.6(C-2)、159.0(C-3)、96.8(C-4)、102.8(C-5)、156.9(C-6)、96.6(C-7)、160.0(C-8)、107.1(C-9)、140.5(C-10)、99.3(C-1’)、77.3(C-2’)、77.2(C-3’)、70.1(C-4’)、76.9(C-5’)、61.2(C-6’)、109.4(C-1”)、76.7(C-2”)、79.3(C-3”)、74.1(C-4”)、64.7(C-5”)、55.3(1-OCH3)、54.5(6-OCH3)、204.1(2-COCH3)、31.64(2-COCH3)。
DEPT(θ＝135°)有9個季碳(C-1、C-2、C-3、C-6、C-8、C-9、C-10、C-3”、2-COCH3、)，10個CH(C-4、C-5、C-7、C-1’、C-2’、C-3’、C-4’、C-5’、C-1”、C-2”)；3個CH2(C-6’、C-4”、C-5”)，3個CH3(1-OCH3、2-COCH3、6-OCH3)。
1H-NMR(600MHz，MeOD)δppm6.65(1H，s，H-4)、6.88(1H，d，J＝1.92Hz，H-5)、6.57(1H，d，J＝1.92Hz，H-7)、5.11(1H，d，J＝7.62Hz，H-1’，β構型)、3.68(1H，d，J＝7.62，H-2’)、3.63(1H，t，J＝9.0，H-3’)、3.37-3.41(1H，m，H-4’)、3.52-3.55(1H，m，H-5’)、3.69-3.71(1H，m，H-6’)、3.95(1H，m，H-6’)、5.49(1H，s，H-1”)、3.94(1H，s，H-2”)、3.82(1H，d，J＝9.54Hz，H-4”)、4.11(1H，d，J＝9.54Hz，H-4”)、3.56(2H，s，H-5”)、3.96(3H，s，1-OCH3)、3.91(3H，6-OCH3)、2.62(3H，s，2-COCH3)。
根據以上數據的分析，并且與文獻[15]對照一致，確定其為cassitoroside，即2-乙酰基-3-O-β-D-呋喃芹菜糖-8-O-β-D-吡喃葡萄糖-1，6-二甲氧基奈。結構如下 cassitoroside(2-acetyl-3-O-β-D-apifuranosyloxy-8-O-β-D-glucopyranosyloxy-1，6-dimethoxynaphthalene)實施例2本發明藥物片劑的制備[處方]橙黃決明素5g輔料 適量制成 1000片[性狀]本品為黃色片。
降脂藥。用于高膽固醇、高甘油三酯血癥。
口服。一次1片，一日1～2次。
其中，每片含橙黃決明素(C14H14O7)應為4.5～5.5mg。
實施例3本發明藥物膠囊劑的制備[處方]橙黃決明素5g輔料 適量制成 1000粒[性狀]本品為膠囊劑，內容物為黃色粉末。
降脂藥。用于高膽固醇、高甘油三酯血癥。
口服。一次1粒，一日1～2次。
本品每粒含橙黃決明素(C14H14O7)應為4.5～5.5mg。
根據標準動物的等效劑量折算系數法，藥效學試驗中能降低高脂血癥大鼠TC和TG的高劑量為6.03mg/kg，中劑量為3.015mg/kg，折算成人用劑量為高劑量為7.6mg/日，中劑量為3.8mg/日，所以暫選擇人用劑量為5mg/日。
以下通過藥效學試驗證明本發明藥物的有益效果。
試驗例1決明子降血脂有效成分的篩選運用低密度脂蛋白受體(LDLR)報告基因模型對以上6個化合物進行了藥效學篩選。
低密度脂蛋白(LDL)是膽固醇在人體血清中的一個重要存在形式，位于細胞膜上的低密度脂蛋白受體(LDLR)吸收血液中的低密度脂蛋白，在調節低密度脂蛋白代謝和保持血液中膽固醇正常濃度方面起著非常重要的作用[16]。通過直接激活LDLR基因的表達來調節血液中的LDL被認為是一種很好的降低血液LDL及TC濃度的途徑[17]。
以控制LDLR基因表達的SRE(LDLR基因的啟動子)為靶位點，構建LDLR啟動子熒光素酶(luciferase)報告基因質粒，將此質粒轉染人肝癌細胞系HepG2構建成LDLR報告基因模型，利用該模型研究決明子單體化合物的降血脂活性。由活性化合物造成的SRE活性狀態的改變將影響到位于其下游的熒光素酶基因的表達。因此，通過檢測添加樣品前后細胞內熒光素酶的活性，可以直接篩選出具有增強LDLR基因表達的活性化合物。
實驗材料與儀器供試藥品(1)決明子單體化合物I-VI自制(純度＞95％)。
(2)普伐他汀10mg×7片/盒，上海施貴寶制藥有限公司，批號0403063。
試劑(1)熒光素酶檢測試劑promega，批號195112。
(2)SofastTM基因轉染試劑Sunma Biotechnology Co.，Ltd，批號20041201。
DMEM培養基invitogen corporation，批號1208501。
細胞及質粒HepG2ATCC；pGL3-BasicPromega。
儀器Victor21420-012 multilabel counterPerkin Elmer。
實驗方法LDLR啟動子熒光素酶(luciferase)報告基因質粒的構建提取正常肝組織基因組DNA，選取LDLR基因-166至+35這一片段[18]，根據其序列設計引物，并分別在正義和反義引物中加入酶切位點Kpn I和Bgl II，經PCR反應，酶切，連接，克隆到pGL3-Basic質粒載體。
細胞培養將HepG2細胞用含10％血清及100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的低糖DMEM培養基培養，置于37℃、5％CO2孵箱。
基因轉染將一定量的質粒和轉染試劑分別與一定量的低糖DMEM混合均勻，再將兩種液體混勻，室溫孵育20min后，與一定濃度的HepG2細胞懸液混合均勻，接種此細胞于96孔板上，使每孔中有3×104個細胞。37℃培養24h，換新鮮DMEM培養基同時加入樣品(初篩濃度為50μg/ml，復篩濃度為1-50μg/ml)。繼續培養16h。反應均為雙復孔，試驗重復進行兩次。以普伐他汀作為本實驗的陽性藥物(初篩濃度為150μmol/l，復篩濃度為20-150μmol/l)。
熒光素酶活性測定參照熒光素酶檢測試劑盒進行熒光素酶活性測定吸棄培養細胞中的上清液，每孔加入PBS洗滌細胞兩次，加入裂解液40μl，室溫放置15min，使細胞充分裂解，加入20μl底物振蕩后，在562nm波長下測定相對發光單位RLU(relative luciferase unit)，RLU強弱代表酶活性高低，即代表藥物作用強弱。
由熒光素酶催化的以熒光素(Luciferin)為底物的發光反應的反應式為
Luciferae+Luciferase·Luiferyl-AMP+O2→Luciferase+oxyluciferin+AMP+CO2+hv實驗結果(1)化合物I-VI對LDLR報告基因的轉錄激活作用見表1。
表1化合物I-VI對LDLR報告基因的轉錄激活作用

注增加率(％)表示與轉染對照組的RLU相比。
結果表明(1)轉染對照組與細胞對照組相比較，RLU顯著增加，表明轉染成功。
(2)與轉染對照組相比較，化合物II顯示陽性，能明顯增加熒光素RLU，增加率為115.24％；其余化合物能在一定程度上增加RLU，但與相當濃度的普伐他汀(陽性藥)相比較，沒有顯著活性，故均為陰性。為確證化合物II的藥理活性，將化合物II再次進行藥效學試驗。
(3)化合物II對LDLR報告基因的轉錄激活作用見表2。
表2化合物II對LDLR報告基因的轉錄激活作用

試驗例2橙黃決明素對高脂血癥大鼠血脂的影響2.1實驗材料實驗動物SD大鼠，150～250g，雌雄各半，一級，動物合格證號川實動管字04-11，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，檢疫后備用。
實驗藥物與試劑橙黃決明素自制(相當于生藥量5g·kg-1)；乙醇提取物、正丁醇提取物(相當于生藥量5g·kg-1)取決明子粗粉，95％乙醇回流提取制得乙醇提取物，按系統溶劑提取法進行提取，決明子正丁醇提取物。
普伐他汀(10mg×7片/盒，批號0403063)上海施貴寶制藥有限公司。
膽固醇(25g/瓶，進口分裝(荷蘭)批號0001021)天津市衛生材料廠經銷；去氧膽酸鈉(10g/瓶，進口分裝(意大利)，批號000213)上海化學試劑采購供應站經銷；丙硫氧嘧啶片(50mg×100片/盒，批號20057193)深圳市中聯制藥有限公司；豬油自制。
總膽固醇測定試劑盒(規格R140ml×2 R210ml×2，批號1105051)，甘油三酯測定試劑盒(規格R140ml×2 R210ml×2，批號1105031)，均由四川邁克科技有限責任公司。
其它試劑均為分析純。
2.2實驗方法脂肪乳的配制將1g丙硫氧嘧啶于乳缽中研細，備用。取25g豬油于40℃水浴加熱融化，置于乳缽中，加入10g膽固醇，1g丙硫氧嘧啶，充分攪拌，溶解，再加入吐溫-80、丙二醇各20ml，研磨混勻。然后徐徐加入2g去氧膽酸鈉，研磨乳化。再加蒸餾水至100ml。裝入密閉容器中，冷藏，使用時先于37℃水浴融化，即得。
實驗方法取健康大鼠96只，按體重隨機分為8組，空白對照組(N＝12)、陽性對照組(N＝12)、模型對照組(N＝12)、乙醇提取物組(N＝12)、正丁醇提取物組(N＝12)、高劑量組(N＝12)、中劑量組(N＝12)、低劑量組(N＝12)。
空白對照組上午灌胃2％吐溫溶液15ml·kg-1，下午灌胃蒸餾水15ml·kg-1；模型對照組上午灌胃2％吐溫溶液，下午灌胃脂肪乳劑15ml·kg-1；陽性對照組上午灌胃普伐他汀的2％吐溫溶液15ml·kg-1，劑量為3mg·kg-1，下午灌胃脂肪乳劑15ml·kg-1；乙醇提取物組每天上午灌胃各提取物的2％吐溫溶液，下午灌胃脂肪乳劑15ml·kg-1；各劑量組每天上午灌胃橙黃決明素的2％吐溫溶液，下午灌胃脂肪乳劑15ml·kg-1；連續10天。各組動物最后一次灌胃后，禁食不禁水12h后，眼眶取血，分離血清。COD-CE-PAP法測定血清總膽固醇(TC)，GPO-PAP法測定血清甘油三脂(TG)。采用SPSS11.0統計軟件進行方差分析。
2.3實驗結果結果表明(1)高脂血癥模型組與生理鹽水對照組比較，能顯著升高TC(##P＜0.01)，TG(#P＜0.05)，說明本方法造模成功。(2)與高脂血癥模型組相比較，橙黃決明素高、中、低劑量組及正丁醇提取物組、乙醇提取物組均能顯著降低高脂血癥小鼠的TC，橙黃決明素高劑量組及正丁醇提取物組均能顯著降低高脂血癥小鼠的和TG，其中均以高劑量組效果最好，效果較普伐他丁組弱。(見表3)表3橙黃決明素對高脂血癥大鼠血脂的影響(x±s)

注#P＜0.05，##P＜0.01，與正常對照組相比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與高脂血癥模型組比較。TC降低率、TG降低率與高脂血癥組相比較。
試驗例3橙黃決明素對高脂血癥小鼠血脂的影響3.1實驗材料實驗動物昆明種小鼠，20g，雌雄各半，一級，動物合格證號川實動管字04-11，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，檢疫后備用。
實驗藥物與試劑同1.2.1.2實驗藥物與試劑3.3實驗結果決明子各提取物對高脂血癥小鼠血脂的影響(x±s)

注#P＜0.05，##P＜0.01，與生理鹽水對照組相比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與高脂血癥模型組比較。TC降低率、TG降低率與高脂血癥模型組相比較。
結果表明(1)高脂血癥模型組與生理鹽水對照組比較，能顯著升高TC(P＜0.01)，TG(P＜0.01)，說明本方法造模成功。(2)與高脂血癥模型組相比較，高、中、低劑量組及正丁醇提取物組均能顯著降低高脂血癥小鼠的TC和TG，其中又以高劑量組效果最好，效果優于普伐他丁組，而乙醇提取物組則能在一定程度上降低TC和TG，但與模型組相比，差異無顯著性意義(P＞0.05)。因此橙黃決明素具有降血脂活性。(見表4)總之，本發明提供的化合物尤其化合物II能增強熒光素酶活性，對低密度脂蛋白受體基因轉錄水平有增強作用，具有顯著降血脂活性，為臨床降血脂提供了一種新的選擇。
權利要求
1.式I結構的化合物在制備治療降血脂藥物中的用途 R1為-H或-OCH3；R2為-H、-OH、-OCH3、-COOH或-Oglu；R3為-OH、或-Oglu。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于所述化合物R1為-H或-OCH3；R2為-OH或-OCH3；R3為-OH、或-Oglu。
3.根據權利要求2所述的用途，其特征在于所述化合物為橙黃決明素或其衍生物化合物IIR1為-OCH3，R2為-OH，R3為-OH；化合物IIIR1為-OCH3，R2為-OCH3，R3為-Oglu；化合物IVR1為-H，R2為-H，R3為-Oglu。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述化合物為化合物IIR1為-OCH3；R2為-OH、R3為-OH，即橙黃決明素。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述橙黃決明素及其衍生物是由以下方法制備得到a、取決明子粗粉石油醚除去脂溶性物質后用正丁醇提取；b、將正丁醇提取物上AB-8大孔吸附樹脂，水或乙醇溶液洗脫，洗脫物上硅膠柱；c、用氯仿—甲醇梯度洗脫，分段收集氯仿—甲醇體積9∶1、4∶1洗脫液，d、氯仿—甲醇9∶1洗脫液經石油醚—丙酮梯度洗脫，分離得化合物I、化合物II；氯仿—甲醇4∶1洗脫液經甲醇—水梯度洗脫分離得化合物III、化合物IV。
6.一種用于降血脂的藥物組合物，它是由式I結構的化合物為活性成分加上藥學上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑， R1為-H或-OCH3；R2為-H、-OH、-OCH3、-COOH或-Oglu；R3為-OH、或-Oglu。
7.根據權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述化合物為橙黃決明素，每制劑單位含有橙黃明素4.5～5.5mg。
8.根據權利要求6、7所述的藥物組合物，其特征在于所述制劑是口服制劑、注射制劑。
全文摘要
本發明提供了式I結構的化合物在制備治療降血脂藥物中的用途，其中R
文檔編號A61K31/704GK101077341SQ200610020879
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月23日 優先權日2006年5月23日
發明者萬麗, 張加雄, 胡軼娟, 盧先明, 尹蓉莉, 黃國鈞, 蘭志瓊 申請人:成都中醫藥大學