專利名稱：大豆異黃酮提取物、其制備方法和包含它的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一和大豆異黃酮提取物、其制備方法以及包含所述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
背景技術：
異黃酮類化合物存在于多種植物體內，是植物提取物領域中公認的一類重要物質。大豆尤其是異黃酮的重要資源。大豆為豆科植物大豆Glycine max(L.)merr.的成熟種子，其藥用價值始載于“神農本草經”。大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產物，主要為3種甙元和由它們形成的9種糖苷。大豆中，異黃酮只有少量以游離形式存在，大部分以β-葡萄糖苷的形式存在。在異黃酮葡萄糖苷中，有一部分是葡萄糖上的C-6羥基被丙二酰基取代，還有一部分是葡萄糖上的C-6羥基被乙酰基取代。12種成份見下表1和化學式1。
表1大豆異黃酮化合物的結構式
化學式I目前大豆異黃酮通常使用乙醇水溶液提取，通過常規的分離方法如過濾、離心等進行分離，通過溶劑萃取法、吸附法、超濾法、柱層析法、沉淀法、重結晶法、逆流色譜法和高壓液相色譜法等多種方法進行純化。
CN1422855A和CN1422856A中公開了對大豆豆粕進行乙醇提取并通過大孔吸附樹脂進行吸附來純化大豆異黃酮的方法，這些方法的缺點是(1)樹脂殘留；(2)解吸帶來有機溶劑殘留；(3)樹脂需要反復處理和再生。
CN1448394A中公開了一種純化大豆異黃酮的方法，包括將過80～100目篩的粉狀豆粕用具酸性的萃取劑食用酒精提取，減壓蒸餾法進行濃縮，并將濃縮液用柱層析法。本發明工藝簡單，效率高，時間效率尤為明顯，單產效率大為提高，能耗大幅降低，有著顯著的經濟與社會效益。但缺點是(1)硅膠柱層析不易工業化；(2)大量使用硅膠存在環保問題；(3)產品成本高。
CN1449763A中公開了一種提取大豆異黃酮苷組合物的方法，包括將大豆用乙醇提取，經濃縮，再用石油醚萃取，經真空干燥得到干粉，再將干粉溶解后通過大孔吸附樹脂柱，得到洗脫液，經真空干燥得干粉，再將干粉經硅膠拌樣，硅膠柱層析，洗脫液濃縮，真空干燥得組合物。該法的缺點是(1)樹脂殘留；(2)有機溶劑殘留；(3)樹脂需要反復處理和再生；(4)硅膠柱層析不易工業化；(5)大量使用硅膠存在環保問題；(6)生產周期長，操作煩瑣；(7)產品成本高。
發明內容
本發明涉及一種大豆異黃酮提取物、其制備方法以及包含所述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
在本發明的第一個方面中，提供了一種大豆異黃酮提取物，其含有三種異黃酮苷化合物染料木苷、大豆苷、大豆黃苷，三種異黃酮苷化合物總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
在該方面的一個實施方案中，其中染料木苷、大豆苷和大豆黃苷的總量占提取物總重量的50～89重量％，其中染料木苷優選占提取物總重量的42～74重量％，大豆苷優選占提取物總重量的8～15重量％，大豆黃苷優選占提取物總重量的1.5重量％以下。
在本發明的第二個方面中，本發明提供了包含前述大豆異黃酮提取物的藥物組合物。在該藥物組合物中，所述大豆異黃酮提取物可以單獨使用，或者和本領域技術人員公知的有類似活性的成分聯合使用。另外，本發明的藥物組合物也可以包含藥學上可接受的載體。這些載體是本領域技術人員公知的。
在該方面的一個實施方案中，所述藥物組合物配制成口服給藥、腔腸給藥、噴霧給藥、注射制劑、輸液制劑和透皮吸收的藥物制劑。在一個優選實施方案中，所述口服給藥的藥物制劑選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、晶體、溶液、懸液、湯、糖漿、酏劑、茶和咀嚼劑。這些藥物制劑均可以利用本領域技術人員公知的技術來制備。
在本發明的第三個方面中，提供了一種制備前述的大豆異黃酮提取物的方法，包括下列步驟(a)將豆粕用乙醇提取，以得到乙醇提取液；(b)將乙醇提取液濃縮至比重為1.10～1.30，以得到流浸膏；(c)用水將流浸膏稀釋至含固形物濃度為20～40％(w/v)；(d)加入葡萄糖-δ-內酯至濃度為0.05～0.3％(w/v)，并加熱至75～95℃持續30～90min以得到大豆異黃酮提取物。
在本發明方法的一個優選實施方案中，其中所用葡萄糖-δ-內酯濃度為0.15％(w/v)。在本發明方法的另一個優選實施方案中，步驟(d)中的加熱是90℃持續60min。
在本發明方法的另一個優選實施方案中，還包括在步驟(d)后將沉淀用水洗滌的步驟。在一個更優選的實施方案中，將沉淀用水洗滌1～4次。
根據本發明的上述方面，本發明的一個有利之處是有效成分含量高。大豆中的異黃酮主要有游離型的苷元和結合型的糖苷兩類，而苷元在大豆中含量很少，主要是以苷的形式存在，有丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰大豆黃苷、乙酰染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰大豆黃苷、染料木苷、大豆苷和大豆黃苷等。國內外研究報道顯示染料木苷、大豆苷和大豆黃苷為主要有效成份，而丙二酰和乙酰苷的研究報道很少。本發明在絮凝的同時進行加熱，并控制加熱條件使丙二酰基和乙酰基的苷全部轉化為各自相應的苷。因此，在本發明的大豆異黃酮提取物中，染料木苷、大豆苷和大豆黃苷的總量占提取物總重量的最高為89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的最高為74重量％，大豆苷占提取物總重量的最高為15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
本發明的另一個有利之處是使用葡萄糖-δ-內酯作為絮凝劑，一次絮凝就使大豆異黃酮的含量提高到30重量％以上。
本發明的又一有利之處是通過水洗可以使葡萄糖-δ-內酯幾乎不殘留在大豆異黃酮中，并且更重要的是可以逐步提高沉淀物中大豆異黃酮苷的含量，水洗次數越多大豆異黃酮苷的純度越高。
具體實施例方式
以下通過優選實施例具體說明本發明的各個方面和特征。本領域的技術人員應該理解，這些實施例只是用于說明目的，而不限制本發明的范圍。本發明的保護范圍只受權利要求書的限制。在不背離權利要求書范圍的條件下。本領域的技術人員可以對本發明的各個方面進行各種修改和改進，這些修改和改進也屬于本發明的保護范圍。
另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實施例中所用的各種材料和試劑都是本領域中常用的材料和試劑，可以通過常規的商業途徑獲得；所用方法均為本領域技術人員公知的常規方法。另外，除非特別指明，物質的百分含量均為重量/重量百分比，即％(w/w)。
實施例1.轉化對三種異黃酮總含量的影響大豆中的異黃酮主要有游離型的苷元和結合型的糖苷兩類，而苷元在大豆中含量很少，主要是以苷的形式存在，有丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、丙二酰大豆黃苷、乙酰染料木苷、乙酰大豆苷、乙酰大豆黃苷、染料木苷、大豆苷和大豆黃苷等。國內外研究報道顯示染料木苷、大豆苷和大豆黃苷為主要有效成份，而丙二酰和乙酰苷的研究報道很少。我們在工藝研究中發現加熱可使丙二酰和乙酰苷分別轉化成各自的苷，因此我們采取在絮凝加熱過程中，控制加熱條件使丙二酰基和乙酰基的苷全部轉化為各自相應的苷，從而提高有效成分的含量。
取大豆異黃酮浸膏200g(含固形物72％)，加水280g使含固形物為30％。另稱取葡萄糖-δ-內酯0.75g，加10ml水，加熱使溶解，在不斷攪拌下緩緩加入浸膏液中，放置30分鐘，離心(3500rpm/min)，棄去上清液，得沉淀(濕)8.64g。在60℃下減壓干燥后得干浸膏2.16g。測定大豆異黃酮含量為染料木苷18.5％，大豆苷5.6％，大豆黃苷1.5％，三種異黃酮苷總含量為25.6％。
取大豆異黃酮浸膏200g(含固形物72％)，加水280g使含固形物為30％。另稱取葡萄糖-δ-內酯(食品添加劑GB7657-87，購于浙江仙居東興化工廠)0.75g，加10ml水，加熱使溶解，在不斷攪拌下緩緩加入浸膏中，在90℃下保溫60分鐘后，放置到室溫，離心(3500rpm/min)，棄去上清液，得沉淀(濕)9.02g。在60℃下減壓干燥后得干浸膏2.35g。測定大豆異黃酮含量為染料木苷24.5％，大豆苷7.5％，大豆黃苷1.8％，三種異黃酮苷總含量為33.8％。
從上面可以看出不進行轉化時，絮凝后沉淀中三種異黃酮苷總含量為25.6％；在絮凝的同時進行了轉化，絮凝后沉淀中三種異黃酮苷總含量為33.8％。可以看出經過轉化后三種異黃酮總含量提高了約32％。
實施例2水洗次數對純度的影響絮凝后得到的大豆總異黃酮沉淀含量在30％左右，經過深入研究發現通過水洗可以逐步提高沉淀物中大豆異黃酮苷的含量。水洗次數越多大豆異黃酮苷的純度越高。
稱取按前述條件進行絮凝后得到大豆異黃酮粗提物，每次加10倍量的水洗滌，離心(3500r/min)，沉淀60℃減壓干燥，測定大豆異黃酮含量，結果如下(表2)
表2水洗實驗結果
表2(續)水洗實驗結果
從以上實驗結果可以看出，三次平行試驗表明，絮凝后沉淀大豆異黃酮總含量約30％左右，水洗一次大豆異黃酮總含量約45％左右，水洗二次后大豆異黃酮總含量約65％左右，水洗三次大豆異黃酮總含量約72％左右，水洗四次大豆異黃酮總含量約84％左右，水洗五次大豆異黃酮總含量約86％左右。第五次水洗純度基本不再上升多少，但樣品損失卻較多，所以本發明制備工藝以水洗四次以內為宜，可以根據需求大豆異黃酮純度為多少，確定水洗幾次來獲得不同級別的大豆異黃酮產品，比如，需要30％純度的大豆異黃酮產品，可以直接絮凝后干燥即可；需要40％純度的大豆異黃酮產品，可以水洗一次后干燥即可；需要50％純度的大豆異黃酮產品，可以用水洗二次的產品和水洗一次的產品勾兌；需要60％純度的大豆異黃酮產品，可以水洗二次后干燥即可；需要70％純度的大豆異黃酮產品，可以水洗三次后干燥即可；需要80％純度的大豆異黃酮產品，可以水洗四次后干燥即可。
實施例3制備方案1取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，65℃連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為30％，進一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1200kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機進行離心分離，轉速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌一次，得沉淀B(濕重360kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為84kg，提取率為0.055％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的65％，其中染料木苷約占提取物的54％，大豆苷約占提取物的10％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實施例4制備方案2取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用60％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，45℃連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.10。
取絮凝劑約4kg溶于7L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為40％，進一步攪拌混勻后加熱至75℃，保溫60分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A(濕重200kg)，取沉淀A，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為50kg，提取率為0.164％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的30％，其中染料木苷約占提取物的25％，大豆苷約占提取物的4％，大豆黃苷約占提取物的2％。
實施例5制備方案3取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，室溫連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.30。
取絮凝劑約18kg溶于30L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為20％，進一步攪拌混勻后加熱至95℃，保溫90分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A三份(濕重750kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機進行離心分離，轉速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用5倍體積的去離子水洗滌一次，得沉淀B(濕重280kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為68kg，提取率為0.075％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的50％，其中染料木苷約占提取物的42％，大豆苷約占提取物的8％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實施例6制備方案4取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用90％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，室溫連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為30％，進一步攪拌混勻后加熱至95℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1300kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機進行離心分離，轉速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌二次，得沉淀B(濕重220kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為55kg，提取率為0.036％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的72％，其中染料木苷約占提取物的60％，大豆苷約占提取物的11％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實施例7制備方案5取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，室溫連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為30％，進一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1100kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機進行離心分離，轉速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌三次，得沉淀B(濕重130kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為33kg，提取率為0.022％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的85％，其中染料木苷約占提取物的70％，大豆苷約占提取物的14％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實施例8制備方案6取東北大豆30.4噸，提取大豆油后，得大豆粕約24噸。連續進樣，每小時1噸，用80％食用酒精36噸，酒精加入量為每小時1.5噸，使用環型浸出器，室溫連續提取。提取液過濾后，連續通過兩級60m2/L的膜式蒸發器后進入10m3的釜式減壓濃縮罐，進一步濃縮至比重約1.20。
取絮凝劑約9kg溶于15L去離子水中，加入釜式濃縮罐中，進行攪拌混勻，然后加入去離子水調固形物含量為30％，進一步攪拌混勻后加熱至90℃，保溫30分鐘后放置降溫。
降溫至15℃以下，使用SS-800型離心機進行分離，轉速1600rpm，離心20分鐘，得沉淀A，放置冷藏。上清液作為進一步提取大豆皂甙和大豆低聚糖的原料，具體操作和方法略。
取沉淀A五份(濕重1260kg)，加入10倍體積的去離子水，攪勻10分鐘，使用SS-800型離心機進行離心分離，轉速為1600rpm，離心20分鐘，沉淀再用10倍體積的去離子水洗滌四次，得沉淀B(濕重90kg)。
取沉淀B，加入5倍量去離子水，攪拌混勻，過150目篩，濾液放入1.5m3的罐中進行滅菌(90℃，30分鐘)，滅菌后進行噴霧干燥，得粉末過100目篩。最后裝入藥品包裝用聚乙烯膜的袋中，稱重為22kg，提取率為0.014％。含量測定三種異黃酮苷化合物約占提取物的87％，其中染料木苷約占提取物的71％，大豆苷約占提取物的15％，大豆黃苷約占提取物的1％。
實施例9含大豆異黃酮的片劑的制備配方每1000片配方組成如下大豆異黃酮提取物 140.0g預膠化淀粉 155.0g交聯聚維酮 80.0g羧甲基淀粉鈉 20.0g5％PVP(w/v) 適量微粉硅膠 3.0g硬脂酸鎂 5.0g歐巴代 適量按選定配方、工藝進行中試，取大豆異黃酮原料1400g；預膠化淀粉1550g；交聯聚維酮800g；羧甲基淀粉鈉200g，分別過100目篩，準確稱量后過80目篩混合三遍，用5％PVP(w/v，50％乙醇配制)制軟材，16目篩制粒，在55℃烘箱內干燥，整粒(控制顆粒水分含量在3％左右)，將硬脂酸鎂50g與微粉硅膠30g過80目篩，與顆粒混勻后，壓片，理論投藥量為10000片，成品為9600片，包水溶性白色薄膜衣。包衣材料歐巴代購于上海卡樂康包衣技術有限公司(產品代號為85G68918)。
實施例10大豆異黃酮提取物預防給藥對去卵巢大鼠骨質疏松模型的影響采用去卵巢大鼠作為絕經后骨質疏松動物模型，60只10月齡雌性Wistar大鼠，隨機取出10只為假手術對照組(SH)，其余大鼠摘除雙側卵巢并隨機分為5組，每組10只切除卵巢組(OVX)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物低劑量組(L，20mg·kg-1·d-1)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物中劑量組(M，40mg·kg-1·d-1)、切除卵巢加大豆異黃酮提取物高劑量組(H，80mg·kg-1·d-1)和切除卵巢加尼爾雌醇組(NE，30μg·kg-1·d-1)。灌胃給藥12周后處死并檢測指標。
結果表明，與SH組相比，OVX第4腰椎骨、股骨骨密度及骨小梁面積和數目明顯下降(P＜0.05)，而骨小梁分隔距離、血清骨鈣素(BGP)含量及堿性磷酸酶(AKP)活性明顯升高(P＜0.05)，與OVX組相比，大豆異黃酮各劑量組及NE組以上各指標均無顯著差異，但有明顯改善，與SH組相比無顯著差異(P＜0.05)；與SH組比較，OVX組大鼠24h空腹尿鈣、尿磷值均明顯升高(P＜0.05)，大豆異黃酮中、高劑量及NE給藥可顯著降低OVX大鼠尿鈣值(P＜0.05)；去卵巢后大鼠體重明顯增加，其中OVX組顯著高于SH組(P＜0.05)；與OVX組相比，大豆異黃酮各劑量組子宮濕重無明顯升高(P＞0.05)，而NE組明顯增加(P＜0.05)；與OVX組相比，大豆異黃酮L組及NE組腹部脂肪濕重無明顯變化，但M、H組顯著低于NE組(P＜0.05)因此，本發明的大豆異黃酮提取物可有效抑制去卵巢引起的骨量丟失和骨小梁面積減少；有效抑制去卵巢引起的骨轉換，且不表現出明顯的子宮效應。本發明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據大鼠與人體表面積折算系數，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實施例11大豆異黃酮提取物治療給藥對去卵巢大鼠骨質疏松的影響。
為了觀察本發明的大豆異黃酮提取物(SI)治療給藥對去卵巢大鼠骨質疏松模型的作用，為其用于絕經后骨質疏松癥的臨床研究提供科學、合理的依據，通過摘除6月齡成年大鼠雙側卵巢建立骨質疏松動物模型，通過骨密度(BMD)、骨生物力學、骨組織形態學等骨治療指標、血清及尿的骨代謝指標以及體重及子宮系數指標，分別以仙靈骨葆膠囊(GB)和尼爾雌醇片(NE)作為中、西藥對照，對大豆異黃酮提取物20、40、80mg·kg-1·d-1三個劑量組的治療作用進行研究。
結果發現，OVX組大鼠腰椎、股骨GMD、股骨Wash及Ca、Pi含量與SH組相比明顯降低(P＜0.05)，SI中、高劑量可顯著提高此5項指標(P＜0.05或P＜0.01)。生物力學三點彎曲實驗結果表明，OVX組大鼠股骨最大載荷比SH組有顯著降低(P＜0.05)，與OVX組相比，SI中、高劑量顯著升高(P＜0.05)。故形態計量學指標中，OVX大鼠股骨骨小梁面積百分比(Tb.Tr(％))(P＜0.05)、骨小梁數目(Tb.N)比SH組顯著降低(P＜0.01)，而骨小梁間距(Tb.Sp)明顯升高(P＜0.01)，SI高、中劑量可顯著改善上述3指標(P＜0.05)。血清骨代謝指標顯示，OVX組血清BGP含量與SH組相比未有顯著性變化(P＞0.05)，而血清1，25-(OH)2D3、Ca和Pi含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，與OVX相比，SI高、中劑量可顯著提高血清BGP、Ca和1，25-(OH)2D3含量(P＜0.05或P＜0.01)，高劑量組升高1，25-(OH)2D3含量的作用強于GB組和NE組(P＜0.05)。與SH組相比，OVX組尿DPD/Cr有顯著性升高(P＜0.01)，SI中、高劑量、GB組和NE組可使該比值顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，SI高劑量組尿DPD/Cr顯著低于GB組(P＜0.05)。體重與子宮系數結果分析表明，相比于SH組，OVX組大鼠的體重顯著增加(P＜0.05)，而子宮系數顯著下降(P＜0.01)，與OVX組相比，SI高、中劑量可使大鼠體重明顯降低，而不顯著升高子宮系數(P＞0.05)，SI三個劑量組的子宮系數顯著低于NE組(P＜0.05)。
因此，本發明的大豆異黃酮提取物可拮抗大鼠去卵巢引起的骨丟失，顯著升高去卵巢大鼠的股骨最大載荷，改善去卵巢大鼠骨組織形態結構，促進腸鈣吸收，并有效抑制骨吸收，同時無明顯子宮效應。本發明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據大鼠與人體表面積折算系數，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實施例12大豆異黃酮提取物治療給藥對維甲酸致大鼠骨質疏松模型的影響為了觀察本發明的大豆異黃酮提取物(SI)對維甲酸致大鼠實驗性骨質疏松癥的治療效果，為其用于絕經后骨質疏松癥的臨床研究提供科學、合理的依據，用70mg/kg維甲酸誘導大鼠骨質疏松癥，通過骨密度(BMD)、骨生物力學、骨組織形態學等骨治療指標、血清及尿的骨代謝指標以及體重及子宮系數指標，分別以仙靈骨葆膠囊(GB)和尼爾雌醇片(NE)作為中、西藥對照，對大豆異黃酮提取物20、40、80mg·kg-1·d-1三個劑量組的治療作用進行研究。
模型組(RA)大鼠腰椎BMD明顯低于正常對照組(CON)，SI高、中劑量可顯著提高該指標(P＜0.05)。生物力學三點彎曲實驗結果表明，RA組大鼠股骨最大載荷與其他各組比較，雖無統計學差異，但均小于其他各組。骨形態計量學指標中，大鼠股骨骨小梁面積百分比(Tb.Tr(％))(P＜0.05)、骨小梁數目(Tb.N)比SH組顯著降低(P＜0.01)，而骨小梁間距(Tb.Sp)明顯升高(P＜0.01)，SI高、中劑量可顯著改善上述3指標(P＜0.05)。血清骨代謝指標中，RA組血清BGP含量及AKP活性均比CON組顯著升高(P＜0.01)，而血清1，25-(OH)2D3、Ca和Pi含量明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，SI高、中劑量可使BGP含量及AKP活性顯著回降，同時顯著提高血清1，25-(OH)2D3含量(P＜0.01)，作用強于GB和NE組(P＜0.05)。與CON組相比，RA組尿DPD/Cr有顯著性升高(P＜0.01)，SI中、高劑量可使該比值顯著降低(P＜0.05)，高劑量作用效果優于GB和NE組(P＜0.05)。
因此，本發明的大豆異黃酮提取物可拮抗維甲酸所致的骨丟失，改善實驗大鼠骨組織形態結構，促進實驗大鼠腸鈣吸收，并有效抑制維甲酸誘導的骨鈣高轉化態。本發明的大豆異黃酮提取物拮抗去卵巢大鼠骨丟失的有效劑量為40mg·kg-1·d-1，依據大鼠與人體表面積折算系數，推薦臨床有效劑量為6.4mg·kg-1·d-1。
實施例13毒性研究犬及大鼠長期毒性試驗、急性毒性試驗及一般藥理學研究結果均提示本發明的大豆異黃酮提取物安全范圍較寬，犬長期毒性試驗的安全劑量為100mg·kg-1·d-1，依據犬與人體表面積折算系數，推算臨床安全劑量最大為30mg·kg-1·d-1。
權利要求
1.一種大豆異黃酮提取物，其含有染料木苷、大豆苷和大豆黃苷，三者總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。
2.權利要求1的大豆異黃酮提取物，其中染料木苷、大豆苷和大豆黃苷總量占提取物總重量的50～89重量％。
3.權利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中染料木苷占提取物總重量的42～74重量％。
4.權利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中大豆苷占提取物總重量的8～15重量％。
5.權利要求1或2的大豆異黃酮提取物，其中大豆黃苷占提取物總重量的1.5重量％以下。
6.包含前述權利要求中任意一項所述的大豆異黃酮提取物的藥物組合物。
7.權利要求6所述的藥物組合物，其配制成口服給藥、腔腸給藥、噴霧給藥、注射制劑、輸液制劑和透皮吸收的藥物制劑。
8.權利要求7所述的藥物組合物，其中口服給藥的藥物制劑選自片劑、膠囊、粉末、顆粒、晶體、溶液、懸液、湯、糖漿、酏劑、茶和咀嚼劑。
9.一種制備權利要求1所述的大豆異黃酮提取物的方法，包括下列步驟(a)將豆粕用乙醇提取，以得到乙醇提取液；(b)將乙醇提取液濃縮至比重為1.10～1.30，以得到流浸膏；(c)用水將流浸膏稀釋至含固形物濃度為20～40％(w/w)；(d)加入葡萄糖-δ-內酯至濃度為0.05～0.3％(w/v)，并加熱至75～95℃持續30～90min以得到大豆異黃酮提取物。
10.權利要求9所述的方法，其中所用葡萄糖-δ-內酯濃度為0.15％(w/v)。
11.權利要求10所述的方法，其中步驟(d)中的加熱是90℃持續60min。
12.權利要求9-11中任意一項的方法，還包括在步驟(d)后將沉淀用水洗滌的步驟。
13.權利要求12所述的方法，其中將沉淀用水洗滌1～4次。
全文摘要
本發明涉及一種大豆異黃酮提取物，其含有三種異黃酮苷化合物染料木苷、大豆苷、大豆黃苷，三種異黃酮苷化合物總量占提取物總重量的30～89重量％，其中染料木苷占提取物總重量的25～74重量％，大豆苷占提取物總重量的4～15重量％，大豆黃苷占提取物總重量的2.5重量％以下。此外，本發明還涉及包含該大豆異黃酮提取物的藥物組合物，以及該大豆異黃酮提取物的制備方法。
文檔編號A61K36/185GK1876671SQ20061009935
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月17日 優先權日2006年7月17日
發明者廖幼鳴, 王海燕, 劉林, 劉曄, 趙穎濤, 王紅, 楊福艷 申請人:北京寶泰寧堂生物技術有限公司