專利名稱：一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，涉及ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，更具體的說是ー種通過抑制大豆異黃酮生物合成途徑的關鍵酶-苯丙氨酸解氨酶PAL的活性，克服大豆遺傳轉化障礙、提高其農桿菌轉化效率的方法。
背景技術：
作物遺傳轉化常用的方法是基因槍法和農桿菌法。基因槍法由于穿透力強，包被在微彈中的外源基因借助轟擊壓力直接穿過細胞壁和細胞膜而進入植物基因組，從而實現外源基因轉化的目的，因此基因槍法具有轉化時間短、無宿主限制等優點。但適宜基因槍法的受體大多需要經過愈傷誘導、綠苗分化再生等繁瑣的組織培養過程，而大豆的愈傷誘導、 綠苗分化再生較難，因此目前很少用基因槍法轉化大豆。農桿菌法是利用根癌農桿菌對植物的侵染特性把外源基因導入植物基因組的方法，因其拷貝數少、整合完整、遺傳穩定以及受目的基因分子量限制小而廣泛應用于植物的遺傳轉化。雙子葉植物雖然是農桿菌的天然宿主，但直到1983年才由Pederson等證明了大豆可作為農桿菌的合適宿主。Hinchee等 (1988)首次報告了農桿菌成功轉化大豆的事例。自Hinchee等(1988)首次報道利用農桿菌轉化大豆子葉節成功以來，因其不必經過愈傷組織的誘導過程，直接從子葉節部位的分生組織分化出芽，解決了大豆的離體再生難問題，使得農桿菌轉化子葉節法成為最常用的大豆遺傳轉化方法。目前對農桿菌轉化大豆的研究主要集中在選用強毒カ菌株、構建高效表達載體、添加化學物質誘導WR基因的高效表達、以及防止組織壞死提高T-DNA轉移效率等方面，這些都是通過研究農桿菌轉化大豆的外源物質或農桿菌本身等大豆外部因素來實現大豆遺傳轉化的，轉化率低，而對于通過調節大豆內源物質降低對農桿菌侵染的抑制作用方面的研究未見報道。大豆富含異黃酮，大豆異黃酮可調節復雜的植物/微生物互作(馬君蘭等，2007)， 在動物上具有提高機體免疫力的功效。異黃酮類物質是由苯丙烷類代謝途徑的ー個分支所合成的，而苯丙氨酸解氨酶PAL是其生物合成途徑的第一個關鍵酶，能夠在轉錄和轉錄后水平對異黃酮的生物合成進行調控。有研究表明，苯丙氨酸解氨酶PAL抑制劑處理甘薯后幾個小時內就可以檢測到PAL酶活性的降低及下游代謝產物合成積累的受阻(王敬文等， 1981)，而農桿菌一般在附著外植體16個小時后才開始T-DNA的轉移(王關林等，1998)，這就為農桿菌轉化大豆過程中人為調控PAL酶活性提供可能性和時機。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述技術缺陷提供ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法。本發明的原理是通過苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，抑制大豆異黃酮合成的關鍵酶PAL，減少大豆異黃酮類次生代謝產物的合成和積累，從而降低大豆外植體的“免疫力”，提高農桿菌的被侵染力，也就是說從改善植物/農桿菌互作關系方面提供了 ー種提高大豆遺傳轉化效率的方法。本發明提供了ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于包括如下步驟①種子的消毒取健康飽滿大豆種子，放入含有IOOml 30%次氯酸鈉和細1濃鹽酸的密閉容器內，利用反應生成的氯氣消毒M 36小時；②種子的萌發培養將步驟①中的種子接種到も萌苗培養基中進行為期5 6天的25°C、16/ !光暗周期的培養；③外植體制備將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留0. 5 2. Ocm的下胚軸，用手木刀片對子葉節部位進行創傷處理；④固體共培養基的制備向經過121°C高壓滅菌15min后的含有も大量元素、B5 微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH 5. 4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉， DTT,半胱氨酸，B5有機成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按 30ml/皿分裝到Φ 90mm的滅菌培養皿中；⑤農桿菌侵染液的制備將含有外源基因的重組農桿菌懸于含有大量元素、微量元素、IX^有機成分6-BA1. Omgじ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30g じ1，乙酰丁香酮AS200yM，PH 5. 4的培養基中，調節菌液濃度到OD6tltl ^ 0. 5，室溫靜置半小時備用；⑥農桿菌侵染和共培養將步驟③中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入步驟⑤ 制備的農桿菌侵染液中，搖床上SOrpm低速轉動30分鐘后，取出外植體，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟④中固體共培養培養基上，暗培養3 5天；⑦芽誘導和抗性植株的獲得將步驟⑥中的外植體轉移到恢復培養基上培養7天后，轉移到帶有篩選壓的芽誘導培養基上培養14 21天，然后將誘導出抗性芽的外植體轉移到芽伸長培養基上進行芽伸長，芽長4 5cm時轉移到生根培養基中，獲得轉化再生植株移栽到花盆中獲得轉化的抗性植株。所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑為α -氨氧基乙酸Α0Α、 放線菌素D、激酶抑制劑1(25 其中的ー種。所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟 ④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，PH 5.4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸 Igじ1，IXB5有機成分，AS 200 μ M及20 50 μ moIL"1 α -氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶 PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中。所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟 ④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，PH 5.4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸 Igじ1，IXB5有機成分，AS 200 μ M及2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中。
所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 Sgr15PH 5.4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸IglA IX^有機成分，AS 200μΜ及0. 01 0. 2ymolじ1激酶抑制劑1(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中。所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA使用濃度為30 μ mo 1じ1。所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于步驟⑤農桿菌侵染液的制備中所述的含有外源基因的重組農桿菌是利用熱擊法將含有PPT 抗性基因的質粒PCAMBIA3301導入到根癌農桿菌EHA105所得到的重組農桿菌。本發明在農桿菌介導大豆子葉節外植體的侵染過程中，在外植體與農桿菌的共培養期的固體培養基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑，其目的是降低大豆異黃酮等次生代謝產物對農桿菌侵染的抑制作用，提高了農桿菌侵染頻率，侵染后的外植體經不定芽誘導、伸長、生根，明顯增加了獲得大豆抗性植株的數量，如在外植體與農桿菌的共培養期的固體培養基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑α-氨氧基乙酸AOA 后，大豆抗性植株獲得率為10.四％，而空白對照組獲得抗性植株率僅為1.68% ；同樣在外植體與農桿菌的固體共培養期的培養基中添加2. 39 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑放線菌素D后，大豆抗性植株獲得率為14.0%，而空白對照組獲得抗性植株率僅為 0. 78%，獲得大豆抗性植株的數量増加了 13. 22%，明顯的提高了大豆農桿菌介導遺傳轉化效率。
圖1是在固體共培養基中添加不同濃度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100% ；CK表示在固體共性培養基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α-氨氧基乙酸AOA。圖2是在固體共培養集中添加2. 39 μ mo 1じ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D對大豆遺傳轉化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100% ；CK表示在固體培養基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D。圖3是在固體共培養基中添加不同濃度的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑K252a 對大豆遺傳轉化效率影響效果中抗性植株獲得率=生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100% ；
CK表示在固體培養基中不添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑K252a。下面結合具體實施例對本發明作進ー步闡述，但不以任何方式限制本發明的范圍。
具體實施例方式實施例中所使用的培養基配方如無特殊說明，均為常規培養基，所用試劑如無特殊說明均購自上海生エ生物工程技術有限公司，所用農桿菌菌株EHA105購買自北京天思澤基因科技有限公司，質粒PCAMBIA3301購買自澳大利亞CAMBIA公司。實施例1 在固體共培養基中添加20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉化效率的影響1.種子消毒取健康飽滿的冀黃13大豆種子，放入含有IOOml 30%次氯酸鈉和 4ml濃鹽酸的密閉容器內，利用反應生成的氯氣消毒36小時；2.種子的萌發培養將步驟1中的種子接種到も培養基中進行6天25で、16/他光暗周期的培養；3.外植體制備將步驟2中萌發好的種子，無菌條件下去掉種皮，切掉幼葉和上胚軸，保留0. 5cm長的下胚軸，用手木刀片對子葉節部位進行創傷處理；4.農桿菌侵染液的制備利用熱擊法將含有PPT抗性基因的質粒PCAMBIA3301 導入到根癌農桿菌EHA105得到的重組農桿菌。將該重組農桿菌接種在含有50mgじ1利福平、50mgじ1卡那霉素的YEP液體培養基中，28°C、200rpm振蕩培養至對數增長期，OD6tltl在 0. 8-1.0左右。將菌液移至50ml無菌離心管中，4°C、5000rpm離心lOmin，棄上清，收集管底菌體部分。將含有大量元素、微量元素、IX^有機成分6-BA1.0mgじ1、 IBA 0. 2mgじ1、MES 3. 9gじ1、蔗糖30gじ1，乙酰丁香酮AS 200 μ M, PH 5. 4的培養基導入離心管中，顛倒搖晃使菌體懸浮均勻，調節菌液濃度到0D_ ^ 0. 5，室溫靜置半小時備用；5.固體共培養基制備向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、 微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、瓊脂 5g じ1，
PH 5. 4的培養基中，加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1， 1 χB5有機成分，AS 200 μ Μ,然后再分別加入20 μ molじ1的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加α -氨氧基乙酸AOA的處理為對照，混勻后按30ml/皿分裝到 Φ 90mm的滅菌培養皿中；6.農桿菌侵染和共培養將步驟3中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入按步驟 4制備好的農桿菌侵染液，搖床上低速轉動(80 100rpm)30分鐘。將外植體取出，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟5制備的固體共培養基上，暗處共培養3天；7.芽誘導及抗性植株獲得將步驟6中的外植體轉移到恢復培養基(MS大量元素+MS 微量元素 +鐵鹽+B5 有機+6-BA 1.5-3. Omg じ1+IBAO. 2mg じ+Cef 250mg じ1+Ticar 200mgじ1+蔗糖30gじ1+瓊脂5. 5β ΛΡΗ 5.8)上培養7天，然后轉移到含有5mg/L PPT的芽誘導培養基(成分同恢復培養基)上篩選培養18天，然后將誘導出抗性芽的外植體轉移到芽伸長培養基(MS大量元素+MS微量元素+鐵鹽+ 有機+Cefotaxime 250mgじ1+Ticar 200mgじ1+PPT 3mgじ1+蔗糖30gじ1+瓊脂5. 5gじ1，PH 5.8)上進行芽伸長。芽長4cm時轉移到添加有lmg/L PPT的生根培養基(1/2MS大量元素+MS微量元素+鐵鹽+B5有機NAA0. 4mg じ1+Cef 250mg じ1+Ticar 200mg じ1+PPT Img じ1+蔗糖 20g じ1+瓊脂 5. Og じ1，PH 5.8)中，獲得可移栽的轉化再生植株。生根植株移栽到花盆中獲得轉化植株產生的種子。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100%)。結果見圖1:20μπιΟ1じ1 AOA處理的113個外植體，獲得8個生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為7. 1 % ；對照組處理的119個外植體，獲得2個生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1. 68%。因此在步驟5固體共培養基中添加20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例2 在固體共培養基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉化效率的影響在實施例1步驟5固體共培養基制備中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA代替20 μ molじ苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加AOA為對照；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100% )。結果見圖1 :30μπιΟ1じ1AOA處理的175個外植體，獲得18個生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為10. 29% ；對照組處理的119個外植體，獲得2個生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1.68%。因此在實施例1步驟5固體共培養基中添加30 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例3 在固體共培養基中添加50 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 α -氨氧基乙酸AOA對大豆遺傳轉化效率的影響在實施例1步驟5固體共培養基制備中添加50 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA代替20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加AOA為對照；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率(生根良好的移栽植株數/處理的外植體總數*100%)。結果見圖1:50μπιΟ1じ1AOA處理的152個外植體，獲得3個生根良好可移栽的PPT抗性植株，抗性植株獲得率為1. 97% ；對照組處理的119個外植體，獲得2個生根良好可移栽的PPT抗性植株株，抗性植株率為1. 68%。因此在實施例1步驟5固體共培養基中添加50 μ mo 1じ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例4 在固體共培養集中添加2. 39 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑放線菌素D對大豆遺傳轉化效率影響在實施例1步驟5固體共培養基制備中添加2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D代替 20 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加放線菌素D為對照；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率。結果見圖2 放線菌素D處理組處理的 100個外植體，獲得14株生根良好可移栽的植株，抗性植株獲得率為14.0%;對照組處理的 129個外植體，獲得1株生根良好可以移栽的抗性植株，獲得率為0. 78%。因此在實施例1 步驟5固體共培養基中添加2. 39 μ molじ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例5 在固體共培養基中添加0. 01 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉化效率影響將實施例1中步驟5固體共培養基中添加0. 01 μ mol L_1K252a代替20 μ molじ1 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸Α0Α，以不加K252a的處理為對照；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率。結果見圖3 0. 01 μ moir1K252a處理外植體94個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株株8個，抗性植株獲得率為8. 51 % ；對照組處理外植體1 個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實施例1步驟5固體共培養基中添加0. 01 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例6 在固體共培養基中添加0. 05 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉化效率影響將實施例1中步驟5固體共培養基中添加0. 05 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶 PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率。結果見圖3 0. 05 μ moir1K252a處理外植體138個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株12個，抗性植株獲得率為8. 7% ；對照組處理外植體1 個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實施例1步驟5固體共培養基中添加0. 05 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例7:在固體共培養基中添加0.1 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉化效率影響將實施例1中步驟5固體共培養基中添加0. 1 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL 活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率。結果見圖3 :0. 1 μ molじ11(25 處理外植體112個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株4個，抗性植株獲得率為3. 57% ；對照組處理外植體1 個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個，抗性植株獲得率為1. 59%。 在實施例1步驟5固體共培養基中添加0. 1 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。實施例8 在固體共培養基中添加0. 2 μ molじ1苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑 K252a對大豆遺傳轉化效率影響將實施例1中步驟5固體共培養基中添加0. 2 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL 活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA ；其余步驟與實施例1相同。統計處理組和對照組的抗性植株獲得率。結果見圖3 :0. 2 μ molじ11(25 處理外植體110個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個，抗性植株獲得率為1. 82% ；對照組處理外植體1 個，獲得生根良好可移栽的PPT抗性植株2個，抗性植株獲得率為1. 59%。 因此在實施例1步驟5固體共培養基中添加0. 2 μ molじ11(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑比對照明顯提高了大豆抗性植株的獲得率。本發明列舉的實施例旨在更進ー步地闡明苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑對降低大豆異黃酮等次生代謝產物對農桿菌侵染的抑制作用，提高大豆農桿菌轉化效率具有的顯著效果，而不對本發明的范圍構成任何限制。
權利要求
1.ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于包括如下步驟①種子的消毒取健康飽滿大豆種子，放入含有IOOml30%次氯酸鈉和細1濃鹽酸的密閉容器內，利用反應生成的氯氣消毒M 36小時；②種子的萌發培養將步驟①中的種子接種到民萌苗培養基中進行為期5 6天的 25°C、16/ !光暗周期的培養；③外植體制備將步驟②中的種子在無菌條件下去掉種皮、切掉幼葉和上胚軸，保留 0. 5 2. Ocm的下胚軸，用手木刀片對子葉節部位進行創傷處理；④固體共培養基的制備向經過121°C高壓滅菌15min后的含有民大量元素、B5微量元素、6-BA、IBA、MES、蔗糖、瓊脂，PH 5. 4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉，DTT, 半胱氨酸，B5有機成分、乙酰丁香酮AS及苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/ 皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中；⑤農桿菌侵染液的制備將含有外源基因的重組農桿菌懸于含有1/10X&大量元素、 微量元素、IX^ 有機成分 6-BA1. Omgじ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30gじ1，乙酰丁香酮AS 200 μ M, PH 5. 4的培養基中，調節菌液濃度到OD6tltl ^ 0. 5，室溫靜置半小時備用；⑥農桿菌侵染和共培養將步驟③中的外植體放入IOOml三角瓶中，加入步驟⑤制備的農桿菌侵染液中，搖床上SOrpm低速轉動30分鐘后，取出外植體，用滅菌濾紙吸掉多余菌液，擺放到步驟④中固體共培養培養基上，暗培養3 5天；⑦芽誘導和抗性植株的獲得將步驟⑥中的外植體轉移到恢復培養基上培養7天后， 轉移到帶有篩選壓的芽誘導培養基上培養14 21天，然后將誘導出抗性芽的外植體轉移到芽伸長培養基上進行芽伸長，芽長4 5cm時轉移到生根培養基中，獲得轉化再生植株移栽到花盆中獲得轉化的抗性植株。
2.根據權利要求1ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑為α -氨氧基乙酸Α0Α、放線菌素D、激酶抑制劑1(25 其中的ー種。
3.根據權利要求2—種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖 30g じ1、 瓊脂5g ΙΛΡΗ 5.4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1， 半胱氨酸Igじ1，IX^有機成分，AS 200μΜ及20 50μπιο1じ1 α -氨氧基乙酸AOA苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中。
4.根據權利要求1所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30gじ1、瓊脂5gじ1，PH 5. 4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1，IX^有機成分，AS 200 μ M及2. 39 μ mo 1じ1放線菌素D苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ90mm的滅菌培養皿中。
5.根據權利要求1所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于驟④中所述固體共培養基的制備為向經過121°C高壓滅菌15min后的含有大量元素、微量元素、6-BA1. Omg じ1、IBA 0. 2mg じ1、MES 3. 9g じ1、蔗糖30gじ1、瓊脂5gじ1，PH 5. 4的培養基中，再加入抽濾滅菌的硫代硫酸鈉158mgじ1，DTT 154mgじ1，半胱氨酸Igじ1，IX^有機成分，AS 200 μ M及0. 01 0. 2 μ mo 1じ1激酶抑制劑1(25 苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑，混勻后按30ml/皿分裝到Φ 90mm的滅菌培養皿中。
6.根據權利要求3—種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于步驟④固體共培養基的制備中所述的苯丙氨酸解氨酶PAL活性抑制劑α -氨氧基乙酸AOA使用濃度為30 μ mo 1じ1。
7.根據權利要求1所述ー種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法， 其特征在于步驟⑤農桿菌侵染液的制備中所述的含有外源基因的重組農桿菌是利用熱擊法將含有PPT抗性基因的質粒PCAMBIA3301導入到根癌農桿菌EHA105所得到的重組農桿菌。
全文摘要
本發明公開了一種利用調節異黃酮生物合成提高大豆遺傳轉化效率的方法，其特征在于包括以下步驟①種子的消毒、②種子的萌發培養、③外植體制備、④固體共培養基的制備、⑤農桿菌侵染液的制備、⑥農桿菌侵染和共培養、⑦芽誘導和抗性植株的獲得。本發明在農桿菌介導大豆子葉節外植體的侵染過程中，在外植體與農桿菌的共培養期的固體培養基中添加苯丙氨酸解氨酶PAL活性的抑制劑，抑制大豆異黃酮合成的關鍵酶PAL，減少大豆異黃酮類次生代謝產物的合成和積累，從而降低大豆外植體的“免疫力”，提高農桿菌的被侵染力，通過改善這種植物/農桿菌互作關系大大提高了大豆抗性植株的數量和遺傳轉化效率。
文檔編號C12N15/84GK102559747SQ20121000698
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者劉子會, 張孟臣, 張紅梅, 張艷敏, 蔣春志, 郭秀林 申請人:河北省農林科學院糧油作物研究所, 河北省農林科學院遺傳生理研究所