一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法

專利名稱：一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法
技術領域：
本發明涉及到用林蛙體萃取膠原旋肽的制備方法。
技術背景林蛙以其特有的營養價值和藥用價值，而日漸被人們所重視，成為蛙類 中經濟價值較高的一種。又因其專攝取昆蟲類食物，又被譽為"純綠色食 品"。林蛙是延緩衰老、滋補強壯、美容健膚、增強機體免疫力的最佳進補 良藥。目前林蛙人工養殖數量日益增多，科學加工林蛙已是相關科研單位 研究的主要課題。經研究表明源自兩棲動物的肽，具有螺旋肽兩親性結構， 與細胞膜的肌膚有高親和性。它們在蛙類的兩棲動物的肌健、骨膜、皮膚 腺體中形成生物防護素，即膠原螺旋肽。本發明是從林蛙體中萃取膠原螺 旋肽的方法，為林蛙藥用保健價值提供新的空間。發明內容本發明的目的是提供從林蛙體中萃取膠原螺旋肽的制備方法，使林蛙體 生物活性物質得到更廣泛的應用，為人們能在日常生活中獲得林蛙的營養、 藥用、美容價值的保健食品提供方便，也為林蛙產業發展起到促進作用。一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法1、 林蛙體的獲取1.1林蛙體的選擇在秋季捕捉林蛙，經干制法被剝取林蛙油后的雌性 林蛙和雄性林蛙體，或經鮮活制法剝取蛙油后的新鮮雌性蛙體，或鮮活的 雄性林蛙體為原料。1.2林蛙體的貯存A、收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，貯于0 一4。C冷藏庫內；B、收集鮮活雄蛙或被剝取蛙油的雌蛙，速凍后貯存于一 18。C的冷凍庫內備用；2、 林蛙體的預處理2.1取干制的林蛙體，用中藥切片機切成1.0—5.0mm的蛙體片，然后 將蛙體片置于不銹鋼槽內，加入1一5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時 加入1一3%蛙體重量的擰檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡4一10小時，水溫控 制在20-40。C之內，每隔20-60min攪拌一次；2.2取冷凍貯存的蛙體，采用電動刨肉機，將蛙體均勻的刨成l.O— 5.0mm的薄片，然后置于不銹鋼槽內，加入l一3倍蛙體重量的蒸餾水或純 凈水，同時加入1一3%蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡2—6小 時，每隔20-60min攪拌一次，水溫控制在10-20°C;3、 生物酶解3.1復合酶解將預處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應釜內，加熱至35—60。C，調整PH值為6—8，每千克林蛙體加入2—6g的1398 中性蛋白酶，l一3g的1203脂肪酶，l一5g防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉， 每100萬單位酶活量加入2—8g亞硫酸鈉或Vc作為酶激活劑；真空度控制 在100—800Pa，攪拌下酶解反應6—12h;然后用100—300目的雙聯過濾 器過濾出骨渣等雜物；在復合酶解反應下，有脫脂反應過程和酶解蛋白質 過程；得復合酶解液；3.2生物酶修飾經酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復合體，味比較苦， 為修飾苦味和徹底酶解，將復合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應 釜中，調整PH值為6 8，溫度控制在40 60。C，加入蛙體質量0.2 2.0%的 丹麥諾維信功能食品工業生產的Flavourzyme復合風味蛋白酶、0.1 1.0%的 磷脂酯酰基水解酶(俗稱:磷脂酶A)，真空度為200 800Pa攪拌酶修飾3 8h; 通過酶修飾成黏度3/mpa.s6 12、產率16 36%的膠原螺旋肽分子液；3.3滅酶，采用超高溫瞬間滅酶法在120—15(TC/s，出料溫度為30—50 。C的條件下滅酶，或加溫60—8(TC/ 30—60min使酶失活；4、 膠原螺旋肽分離純化4.1離心分離采用高速離心機將酶解液以6000—60000r/min的速度離 心6—20min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內，即酶解分離液，下 層液被分離出去；4.2稀釋將酶解分離液，按l: l一3重量比例加入純凈水或蒸餾水， 在真空度100—800Pa攪拌稀釋；4.3超微膜純化將稀釋液用循環泵加壓0.2MPa—0.8MPa通過平衡保 險分離器在0.1um—0.5um的精度下進行分離，然后用5—50mVh的循環泵 將濾液在0.6—1.6MPa的壓力下通過50000道爾頓的超微膜純化，獲得分子 量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽液；4.4低溫濃縮為保持膠原螺旋肽活性，不被高溫破壞螺旋肽活性成份， 采用熱隔膜低溫濃縮技術對膠原螺旋肽液進行濃縮，溫度為40—6(TC，真 空度為0.3—1.8MPa，除去膠原螺旋肽液中30—70%體積的水分，然后將濃 縮液輸送到平衡罐內；5、 干燥成型5.1噴霧干燥將濃縮液用濃漿泵以100—500r/min的流速輸入180— 26(TC的離心噴霧干燥塔內干燥成粉沫；在出料口收集膠原螺旋肽粉，用復 合袋密封，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽粉；5.2將干燥后的膠原螺旋肽糖，經自動充膠囊機灌上每粒200—300毫 克的硬膠囊，然后泡罩成PVC和鋁箔每板10粒。經檢驗包裝成精品盒或 獲得林蛙膠原螺旋肽膠囊成品。本發明的積極效果1.采用生物蛋白酶解技術將雄性林蛙和被剝取蛙油的雌蛙降解成膠原 螺旋肽。2. 采用超微膜和低溫濃縮技術分離林蛙酶解液純化林蛙膠原螺旋肽分 子量。使產品具有穩定性、抗氧化性、易保存，易被人體吸收。3. 采用林蛙干或鮮林蛙制備林蛙螺旋肽膠囊，使人們在日常生活中即 食莢豌豆獲得林蛙的保健功效，為林蛙的藥用價值、營養價值提供新的發 展空間。總之采用生物技術將林蛙體具有螺旋狀兩親性結構與細胞膜和肌膚有 高親和性的林蛙生物防護素——膠原螺旋肽通過生物酶解、修飾、分離純 化、濃縮成林蛙膠原螺旋肽生物保健品，為林蛙的藥用價值、食用價值， 提供了新的途徑。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。 實施例1取秋季捕捉經干制剝取林蛙油的雌性林蛙和雄性林蛙50kg，采用中草 藥切片機將干制林蛙切成2mm的林蛙片，置于300L的不銹鋼槽內，加入 200kg的蒸餾水和3kg的檸檬酸鈉，浸泡8小時，水溫控制在2(TC。用木 攪拌棒每隔30min攪動3min，將500L不銹鋼真空酶反應釜用100PPM/L 的二氧化氯消毒液消毒，放出消毒液后，再將浸泡的林蛙片連同浸泡汁一 起倒入酶反應釜內，調整PH值為7，蒸汽加熱、，溫度控制在37。C，加入 1398中性蛋白酶150g，酶活力每克90000U， 1203脂肪酶100g、乳酸菌素 100g、 Vc10.8g。密封加料罐蓋，抽真空300Pa，維持260Pa，啟動攪拌器 攪拌使酶反應8小時。然后用供料泵通過200目的雙聯過濾器濾出骨渣等 雜物。濾液輸送至500L的酶修飾反應釜內，調整PH值為7，溫度為50'C， 加入丹麥諾維信功能食品工業生產的FLAUOURZYME復合風味蛋白酶 150g、磷脂酶50g，密封罐口，抽真空400Pa，維持真空360Pa。啟動攪拌 器，攪拌酶降解6小時后，形成勃氏黏度60。C測試為8，產出肽蛋白率為 36%的酶解液。采用供料泵將酶解液通過140°C/s的超高溫瞬間滅酶，出料 溫度控制在50°C。趁熱用6000r/min的蝶式分離機分離酶解液10min，除去 下層液和雜質，合并中、上層液體。輸入1000L不銹鋼稀釋罐內加入400kg 的純凈水攪拌稀釋20min，真空度為200Pa。啟動板式超微膜分離器，將 580kg的稀釋液在0.4MPa循環泵的輸出壓力下通過0.2um的微膜過濾保安 器。然后啟動5mVh的循環泵在l.OMPa的壓力下通過50000道爾頓的126 層膜板，分離出50000分子量的膠原螺旋肽液體。啟動真空熱隔膜泵式低 溫濃縮器將分離出在55°C、真空l.OMPa的環境下除去水份70%濃縮174kg 的濃縮液。用供料泵輸入平衡罐內。啟動濃漿泵設置200r/min的流速將濃 縮液輸送到24(TC的離心噴霧干燥塔內進行干燥，在二級旋風口集膠原螺旋 肽糖18kg，再將18kg膠原螺旋肽糖，經自動充膠囊，每粒膠囊300mg，共 灌300mg膠囊60000粒。采用膠囊泡罩機用PVC和鋁箔復合每板10粒。 然后每兩板20粒裝入精品盒內獲得3000盒膠原螺旋肽膠囊成品。實施例2與實施例l不同之處在于，取秋季捕捉鮮活林蛙，100kg采用鮮活取法 剝取林蛙油后的雌性林蛙體和雄性林蛙。清洗干凈后裝2000克的鐵盒內， 共裝48盒，送入一35。C的速凍盒內進行冷凍4小時。凍透后，將48個鐵 盒放入涼水槽內沖3min倒出林蛙冷凍體，用電動刨肉機刨成3mm的薄片。 放在300L不銹鋼浸泡槽內，加入150kg的純凈水和2kg的Vc，浸泡6小 時，水溫控制在20。C，用木棒每隔30min攪動2min，將500L不銹鋼真空 酶反應釜用100PPM/L的二氧化氯消毒，放出消毒液后，再將浸泡的林蛙片 連同浸泡汁一起倒入酶反應釜內，調整PH值為7，加溫至37。C，加入1398 中性蛋白酶200g、 1203脂肪酶150g、氟硅酸鈉100g、亞硫酸鈉15g，密封 罐口，抽真空260Pa，攪拌酶反應8小時。采用料泵通過200目的雙聯過濾 器濾出骨渣等雜物，濾液輸送至500L的酶修飾反應釜內，調整PH值為7、 溫度為50°C，加入丹麥諾維信功能食品工業生產的FLAVOURZYME200g、 磷脂酶50g，密封罐口，抽真空360Pa，攪拌酶降解4小時，通過140°C/s 瞬間滅酶。趁熱用6000r/min的分離機分離出酶解液輸入稀釋罐內加入 400kg蒸餾水真空攪拌稀釋20min，用超微膜分離純化50000分子量的膠原 螺旋肽液體，真空低溫濃縮成210kg的膠原螺旋肽濃縮液，噴霧干燥成21kg 膠原螺旋肽糖，制成300mg的膠囊70000粒，包裝成精品3500盒林蛙膠原 螺旋肽成品。實施例3與實施例1不同之處在于a.林蛙體的貯存，收集干制的雄蛙干或取 油后的雌蛙干，貯于0—4"C冷藏庫內備用；b. 取干制的林蛙體，用中藥切片機切成l.Omm的蛙體片，然后將蛙體 片置于不銹鋼槽內，加入5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時加入3%蛙 體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或Vc，浸泡10小時，水溫控制在4(TC之內， 每隔-60min攪拌一次；c. 復合酶解將預處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應釜內，加 熱至35。C，調整PH值為6，每千克林蛙體加入6g的1398中性蛋白酶，lg 的1203脂肪酶，lg防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉，每100萬單位酶活量加入 2g亞硫酸鈉或Vc作為酶激活劑；真空度控制在100Pa，攪拌下酶解反應6h; 然后用100目的雙聯過濾器過濾出骨渣等雜物；在復合酶解反應下，有脫 脂反應過程和酶解蛋白質過程；得復合酶解液；d. 生物酶修飾經酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復合體，味比較苦， 為修飾苦味和徹底酶解，將復合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應 釜中，調整PH值為6，溫度控制在4(TC，加入蛙體質量0.2%的丹麥諾維 信功能食品工業生產的Flavourzyme復合風味蛋白酶、0.1%的磷脂酯酰基水 解酶(俗稱磷脂酶A)，真空度為800Pa攪拌酶修飾8h;通過酶修飾成黏 度3/mpa.s6 12、產率36%的膠原螺旋肽分子液.
權利要求
1. 一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法，其特征在于1)林蛙體的獲取1.1林蛙體的選擇在秋季捕捉林蛙，經干制法被剝取林蛙油后的雌性林蛙和雄性林蛙體，或經鮮活制法剝取蛙油后的新鮮雌性蛙體，或鮮活的雄性林蛙體為原料；1.2林蛙體的貯存A、收集干制的雄蛙干或取油后的雌蛙干，貯于0-4℃冷藏庫內；B、收集鮮活雄蛙或被剝取蛙油的雌蛙，速凍后貯存于-18℃的冷凍庫內備用；2)林蛙體的預處理2.1取干制的林蛙體，用中藥切片機切成1.0-5.0mm的蛙體片，然后將蛙體片置于不銹鋼槽內，加入1-5倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時加入1-3％蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或VC，浸泡4-10小時，水溫控制在20-40℃之內，每隔20-60min攪拌一次；2.2取冷凍貯存的蛙體，采用電動刨肉機，將蛙體均勻的刨成1.0-5.0mm的薄片，然后置于不銹鋼槽內，加入1-3倍蛙體重量的蒸餾水或純凈水，同時加入1-3％蛙體重量的檸檬酸鈉、酒石酸或VC，浸泡2-6小時，每隔20-60min攪拌一次，水溫控制在10-20℃；3)生物酶解3.1復合酶解將預處理后的林蛙片連同浸泡汁，加入真空反應釜內，加熱至35-60℃，調整PH值為6-8，每千克林蛙體加入2-6g的1398中性蛋白酶，1-3g的1203脂肪酶，1-5g防腐劑乳酸菌素或氟硅酸鈉，每100萬單位酶活量加入2-8g亞硫酸鈉或VC作為酶激活劑；真空度控制在100-800Pa，攪拌下酶解反應6-12h；然后用100-300目的雙聯過濾器過濾，得復合酶解液；3.2生物酶修飾經酶降解液體含有蛋白酶與肽酶復合體，味比較苦，為修飾苦味和徹底酶解，將復合酶解液用空氣壓力輸送至生物酶修飾反應釜中，調整PH值為6-8，溫度控制在40-60℃，加入蛙體質量0.2-2.0％的丹麥諾維信功能食品工業生產的Flavourzyme復合風味蛋白酶、0.1-1.0％的磷脂酯酰基水解酶，真空度為200-800Pa攪拌酶修飾3-8h；得膠原螺旋肽分子液；3.3滅酶，采用超高溫瞬間滅酶法在120-150℃/s，出料溫度為30-50℃的條件下滅酶，或加溫60-80℃/30-60min使酶失活；4)膠原螺旋肽分離純化4.1離心分離采用高速離心機將酶解液以6000-60000r/min的速度離心6-20min，將上層液和中層液合并輸入稀釋罐體內，即酶解分離液，下<pb pnum="1"/>層液被分離出去；4.2稀釋將酶解分離液，按1∶1-3重量比例加入純凈水或蒸餾水，在真空度100-800Pa攪拌稀釋；4.3超微膜純化將稀釋液用循環泵加壓0.2MPa-0.8MPa通過平衡保險分離器在0.1um-0.5um的精度下進行分離，然后用5-50m3/h的循環泵將濾液在0.6-1.6MPa的壓力下通過50000道爾頓的超微膜純化，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽液；4.4低溫濃縮采用熱隔膜低溫濃縮技術對膠原螺旋肽液進行濃縮，溫度為40-60℃，真空度為0.3-1.8MPa，除去膠原螺旋肽液中30-70％體積的水分，然后將濃縮液輸送到平衡罐內；5)干燥成型5.1噴霧干燥將濃縮液用濃漿泵以100-500r/min的流速輸入180-260℃的離心噴霧干燥塔內干燥成粉沫；在出料口收集膠原螺旋肽粉，用復合袋密封，獲得分子量大于等于50000道爾頓的膠原螺旋肽粉。
2.按權利要求1所述的的制備方法，其特征在于將干燥后的膠原螺 旋肽粉，經自動充膠囊機灌上每粒200—300毫克的硬膠囊，然后泡罩成PVC 和鋁箔每板10粒。經檢驗包裝成精品盒或獲得林蛙膠原螺旋肽膠囊成品。
全文摘要
一種從林蛙組織中萃取膠原螺旋肽的制備方法，用干制與鮮活秋季捕捉野生或人工養殖雄性林蛙或被剝取林蛙油的雌性林蛙體作原料，經預處理、復合酶解、生物酶修飾、離心分離、稀釋、超微膜純化、低溫濃縮、離心噴霧干燥、膠囊包裝成林蛙膠原螺旋肽成品。本發明的優點為采用生物技術將林蛙體具有螺旋狀兩親性結構與細胞膜和肌膚有高親和性的林蛙生物防護素——膠原螺旋肽通過生物酶解、修飾、分離純化、濃縮成林蛙膠原螺旋肽生物保健品，為林蛙的藥用價值、食用價值，提供了新的途徑。
文檔編號A61P37/00GK101270379SQ20071001068
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月21日 優先權日2007年3月21日
發明者毅 冷, 李小龍, 李長青, 紅 王 申請人:丹東科健食品有限公司