專利名稱：：細皺香薷中主要化學成分及有效組份的抗流感用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥細皺香薷的主要化學成分及有效組份的制備方法、新的藥理作用以及其在預防和治療流感疾病中的應用，屬中藥
技術領域：
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背景技術：
：流感是由流感病毒引起的對人類健康威脅最大的呼吸道傳染病之一，具有傳染性強，發病率高，流行面廣等特點。在兒童、老人及高危人群中死亡率很高，嚴重威脅著人類的健康。流感病毒屬于正粘病毒科，根據病毒核蛋白和基質蛋白抗原決定簇的不同，分為A,B,C三種類型，其中只有A和B型可以引起大規模的流行，B和C兩型僅能對人致病，A型可對人、豬、馬和禽等致病。目前世界流行的H5N1型禽流感(avianinfluenza)即屬于A型的一種亞型病毒，該亞型流感病毒是人與動物共患的流感病毒病原體，很容易引起世界大流行。據報道，目前世界流行的H5N1型禽流感病毒很可能變異產生一種新型、可以致人死亡的流感病毒，并且該病毒的變異速度極快，而人類對該病毒并沒有免疫能力。流感病毒之所以易于流行是因為它的抗原多變性使得人體不能對其永久性免疫。在發現神經氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制劑之前，流感的治療僅限于金剛烷胺/金剛乙胺和病毒疫苗，但其不足之處在于(1)由于流感疫苗的有效性是建立在疫苗的病毒株與將要流行或環境中存在的流感病毒株相類似基礎上的，而流感病毒抗原的高度易變性大大降低了人們對流感病毒爆發預測的準確性，這就使常規的流感疫苗對預防流感爆發與流行的有效性受到了嚴重影響，并對新產生的不可預見的流感病毒株束手無策。(2)流感病毒M2蛋白抑制劑金剛垸胺和金剛乙胺只對A型流感病毒有效，且很快會出現耐藥病毒株和比較嚴重的中樞神經系統副作用，使這類藥物的臨床應用受到極大限制。值得慶幸是，所有A、B型流感病毒神經氨酸酶的活性位點的氨基酸殘基是高度保守的，這對于尋找廣譜抗流感病毒藥物提供了新的機遇。神經氨酸酶在變異中的相對保守性為篩選、設計和合成有效的抗流感藥物提供了重要的靶標。神經氨酸酶(EC3.2.1.18)又稱唾液酸酶，它可促進新生的流感病毒從宿主細胞的唾液酸殘基釋放，并加速流感病毒轉染其它的宿主細胞，因此神經氨酸酶抑制劑可以有效地阻斷流感病毒的復制過程。神經氨酸酶晶體結構的解析，使一類新型抗流感病毒藥物一一神經氨酸酶抑制劑的研發取得了成功，并引起世界各國對研發神經氨酸酶抑制劑的熱潮。與其它類型的抗流感藥物相比，神經氨酸酶抑制劑具有更高的療效和更好的安全性和耐受性，對所有的流感病毒亞型均有效，且很少出現病毒抗藥性。目前臨床應用的MA抑制劑奧塞米韋(oseltamivir)是公認的抗流感和禽流感病毒的有效藥物。但由于技術原因，藥物的制備工藝復雜，生產成本高，價格昂貴，限制了它的廣泛應用。而國內在防治流感方面進行了疫苗的研究，取得一定進展，但在藥物研究方面，還沒有有效的藥物研究成果。
發明內容為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一了一類新的神經氨酸酶(neuraminidase,NA)抑制齊U。為實現的本發明的目的，本發明采用如下的技術方案。從流感病毒的重要靶點神經氨酸酶建立NA抑制劑篩選模型，篩選評價中藥提取物的活性，然后基于活性評價結果，進一步分離得到有效組份及活性化學成分。因流感病毒感染常常引起許多炎性癥狀及過氧化損傷癥狀，為了綜合評價活性組份與活性化合物的生物活性，除了評價其NA抑制活性及活性特異性，還需評價其抗炎免疫活性及抗氧化活性，以便找到新型有效的抗流感藥物。本發明公開了細皺香薷(Efcto/te;an/g"/oMHemsl.)的有效組份的制備方法，包括如下步驟:(a)細鈹香薷(a^o/te,'arwgwto。Hemsl.)以85%乙醇提取，合并提取液，減壓蒸干，得細皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細皺香薷乙酵總提物溶于水中，以石油醚萃取得細皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到細皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)和細皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，最后得細皺香薷水層部位(ER-水層)；本發明還公開了另一種細皺香薷(^^/ofe^n^/waHemsl.)的有效組份的制備方法，包括如下步驟(a)細鈹香薷(E/Wo/te/arag"/o^Hemsl.)用水提取，合并提取液，減壓蒸干得細皺香薷水總提物(ER-水總提)，(b)加入水一乙醇溶液(85%的乙醇)至乙醇含量為75%，得細皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(c)將沉淀物溶于水后，用大孔樹脂進一步分離，用不同比例的水一乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份細皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，細皺香薷乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，細皺香薷乙醇洗脫組份(ER-50X乙醇洗脫組份)和細皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。原藥材經干燥并適當的粉碎，以利增大與溶劑的接觸面積提高效率。原藥材的提取溶劑使用水、醇類、或水與醇類的混合物。優選的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，最優選的是乙醇，乙醇濃度為體積比50100%;優選的濃度為體積比7095%。提取時溶劑量為原藥重量的414倍。提取可以在靜態或動態下，優選在動態條件下。為了提高提取的效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(例如2(TC)到溶劑回流溫度的范圍內，優選在回流的溫度下。提取可連續或間歇進行，間歇提取時可重復25次。提取時間是1小時到4小時，優選為2.5到3小時。本發明還公開了一類細皺香薷有效組份，所述的細皺香薷有效組份由上述方法制備，選自(a)細皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)細皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)，(d)細皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，(e)細皺香薷水層部位(ER-水層)；以及(al)細皺香薷水總提物(ER-水總提)，，(bl)細皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(cl)細皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，(dl)細皺香薷30%乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，(el)細皺香薷50%乙醇洗脫組份(ER-50。/。乙醇洗脫組份)，(fl)細皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。本發明還公開了由細鈹香薷獲得的樺木酸(betulinicacid)，齊墩果酸(oleanolicacid)禾口熊果酸(ursolicacid)，存菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3,陽glycuronicmethylester)和木月旨素等成分。本發明還提供一種藥物組合物，含有至少一種上述細皺香薷有效組份和藥效學上可接受的載體本發明還提供另一種藥物組合物，含有藥效學上可接受的載體和至少作為有效成分的化合物，所述的化合物選自芹菜素(apigenin),木犀草素(luteolin),芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。本發明涉及的藥物組合物以本發明有效組份和化合物作為活性成份。該藥物組合物可根據本領域公知的方法制備。可通過將本發明有效組份和化合物與一種或多種藥學上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發明有效組份和化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95重量％。本發明有效組份和化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。—給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑(包括o/w型、w/o型和復乳)、混懸劑、注射劑(包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑(包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣(粉)霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠齊IJ、糊劑等。'本發明有效組份和化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統。為了將本發明有效組份和化合物制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙」瞎吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯聚乙烯吡咯垸酮、交聯羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二垸基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發明有效組份和化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發明有效組份和化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆粒或微丸，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發明有效組份和化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發明有效組份和化合物的膠囊劑。為將本發明有效組份和化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領域常用的增溶劑、助溶劑、pH調劑劑、滲透壓調節劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-e-環糊精等；pH調劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調節劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。>本發明提供了細皺香薷(E&toto'an/g"/oMHemsl,)的有效組份在制備預防和X或治療流感藥物中的應用，優選的是醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)、50%乙醇洗脫部位(ER-50X醇洗脫組分)。本發明提供了一類黃酮類化合物在制備預防和\或治療流感藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin),木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。本發明提供了細皺香薷(五&to/te/。n^/amHemsl.)的有效組份在制備抗氧化藥物中的應用，優選的是ER-50X醇洗脫組分、ER-醋酸乙酯層、ER-水總提。本發明提供了一類黃酮類化合物在制備抗氧化藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin),芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)，優選的是斧菜素(叩igenin)。本發明提供了細皺香薷(E狄ofe/an/gw/waHemsl.)的有效組份在制備抗炎藥物中的應用，優選的是乙醇總提物(ER-乙醇總提物)、乙酸乙酯部位(ER-乙酸乙酯層)、正丁醇部位(ER-正丁醇層)和水溶性部位(ER-水層)本發明提供了一類黃酮類化合物在制備抗炎藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl6Ster)0本發明提供了細皺香薷(孤tote/an/gw/oraHemsl.)的有效組份在制備增強免疫藥物中的應用，優選的是細皺香薷ER-水層。本發明提供了一類黃酮類化合物在制備增強免疫藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(叩igenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>本發明通過研究發現，細皺香薷主要化學成分芹菜素，芹苷，木犀草素，木犀草苷以及木犀草素-3-葡糖醛酸甲酯對甲、乙型流感病毒神經氨酸酶均具有較強的抑制作用，同時對細胞水平的流感病毒具有抑制作用，表明它們是細鈹香薷中藥抗流感病毒的物質基礎，同時它們還具有一定的抗氧化抗炎作用，其中芽菜素具有較強的細胞水平流感病毒抑制作用和抗氧化作用。細皺香薷的粗提物ER-醋酸乙酯層、ER-50X醇洗脫組份對甲、乙型流感病毒神經氨酸酶具有較強的抑制活性以及自由基清除作用，ER-醋酸乙酯層、ER-正丁醇層和ER-水層還具有抑制腫瘤壞死因子分泌作用，ER-水層具有促進T淋巴細胞分化，增強免疫作用。總之，細皺香薷對流感的治療作用可以通過其主要化學成分及有效部位抑制流感病毒的復制、清除自由基以及抗炎免疫作用等多種途徑發揮治療作用，因此具有良好的抗流感藥物開發前景。為達到用藥目的，增強治療效果，本發明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。本發明有效組份、化合物、藥物組合物的給藥劑量依照所要預防或治療疾病的性質和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg體重，優選為0.1-100mg/Kg體重，更優選為1-60mg/Kg體重，最優選為2-30mg/Kg體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫生的臨床經驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。本發明有效組份、化合物、藥物組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或對癥藥物合并使用。當本發明的化合物與其它治療藥物存在協同作用時，應根據實際情況調整它的劑量。本發明的優點所有A、B型流感病毒神經氨酸酶的活性位點的氨基酸殘基是高度保守的，因此本發明的神經氨酸酶抑制劑具有對抗不同類型流感病毒的活性，具有廣譜性。本發明的神經氨酸酶抑制劑包括其有效組份及活性成分具有抗病毒靶點明確，毒性低，提取工藝簡單等特點；藥材資源豐富，具有很好的應用和開發前景,是一種比較理想的新型預防和治療流感疾病的中藥。具體實施例方式下面結合本發明進一步說明尋找神經氨酸酶抑制劑的過程、細皺香薷有效組份及主要化學成分制備方法、體外抗炎免疫作用及其在體內預防和治療流感的作用，更詳細地舉例說明本發明。實施例1:建立神經氨酸酶抑制劑篩選模型(參考文獻:Potier,M.,L.Mameli，M.Belislem，L.Dallaire，andS.B.Melanxon.Fluorometricassayofneuraminidasewithasodium(4-methylumbelliferyla-D-N-acetylneuraminate)substrate.Anal.Biochem.，1979，94:287-296.)，通過對樣品庫中10萬個樣品的神經氨酸酶抑制活性評價，發現細皺香薷水提部位具有較高的神經氨酸酶抑制活性，其IC50為l~4ug/ml。實施例2:將30kg細皺香薷全草陰干并粉碎后，以85%乙醇提取3次(2h,1hX2)，合并提取液，減壓蒸干，得乙醇總提物(ER-乙醇總提物，1.675kg)，之后溶于水中，以石油醚萃取得石油醚部位(ER-石油醚層，0.012kg)，剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層，0.040kg)和正丁醇部位(ER—正丁醇層，0.057kg),最后得水層部位(ER-水層，0.725kg)。實施例3:石油醚部位經進一步分離得到樺木酸(betulinicacid)，齊墩果酸(oleanolicacid)和熊果酸(ursolicacid)，醋酸乙酯部位(235.3克)經進一步分離得到芹菜素(apigeniii，55mg)，木犀草素(luteolin，113mg)，芹苷(apiin，15mg),木犀草苷(galuteolin,35mg)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester,19mg)，和木脂素(27mg)等成分。實施例3的分離提純結果表明，3個三萜類化合物，5個黃酮類化合物和1個木脂素是該中藥的主要化學成分。實施例4:將7.5kg細皺香薷全草陰干并粉碎后，用水提取3次(2h,1.5X2h)，合并提取液，減壓蒸干得總提物(ER-水總提，0.826kg)，加入水一乙醇溶液(85%的乙醇)至乙醇含量為75%，得沉淀物(ER-水提醇沉，0.710kg),將沉淀物溶于水后，用大孔樹脂進一步分離，用不同比例的水一乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份ER-水洗組份，ER-30X乙醇洗脫組份，ER-50X乙醇洗脫組份(0.026kg)和ER-70。/。乙醇洗脫組份。藥理實驗不同組份經神經氨酸酶抑制活性評價，確定其中的有效組份及其制備方法。實驗例1:細皺香薷提取部位及主要成分的神經氨酸酶活性評價。本實驗中使用的流感病毒A型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)和A/Jinan/15/90(H3N2)和B型流感病毒B/Jiangsu/10/2003，在神經氨酸酶活性檢測體系中，各種濃度的待測物質與病毒神經氨酸酶懸浮于32.5mmo1L"MES緩沖液-4mmo1L1CaCI2(pH6.5)，室溫孵育30—60min，加底物圖NANA啟動反應體系，37oC孵育30—120min后(不同病毒的神經氨酸酶需孵育的時間不同)，加150uL0.034MNaOH終止液終止反應。在激發波長360nm和發射波長為450nm的參數條件下，測定熒光強度值。根據抑制活性與抑制劑的濃度計算ICs。值。有效組份、主要化學成分及陽性對照藥奧塞米韋(oseltamivir)的半數抑制率ICso值列于表1中。表1細皺香薷的化學成分與提取物的流感病毒神經氨酸酶抑制作用檢測物質_IC50a(pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實驗結果表明，ER-醋酸乙酯層、ER-50^乙醇洗脫組份、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、芹苷(apiin)、木犀草苷(galuteolin)和木犀草素-3-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3-glycuronicmethylester)是細皺香薷抑制流感病毒神經氨酸酶的活性物質基礎。實驗例2:細皺香薷有效組份及主要化學成分的體外抗流感病毒活性評價。本實施例采用MDCK(狗腎細胞)進行藥物的MDCK細胞毒性實驗和藥物對流感病毒的抑制實驗。病毒為甲型(粵防72—243)流感病毒，10—5感染，病毒感染相當于316個TCID5Q。實驗方法采用細胞病變效應(CPE)法，每毫升2030萬個MDCK細胞接種96孔細胞培養板，每孔0.1ml，37oC,5XC02培養24小時，棄培養液，加入適量病毒，吸附2小時后，棄病毒液，加入藥物，藥物濃度均小于最大無細胞毒性濃度TC。。藥物作3倍系列稀釋，8個稀釋度，每濃度設2孔，37oC,5%C02培養。24小時觀察細胞病變，完全破壞為4*75%為3，50%為2，25%為1，無病變為0。設無藥物細胞對照，病毒對照，陽性對照藥為奧韋(oseltamivir)和利巴韋林(ribavirin)。計算藥物半數有效濃度(IC幼)。體外抗流感病毒實驗結果見表2。表2藥物抗流感病毒實驗結果_<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>aTD5Q:對MDCK細胞的半數有毒藥物濃度。bTDo:無MDCK細胞毒性的最大濃度。eIC5o:藥物對甲型流感病毒(粵防72—243)的半數抑制濃度。dSI(SelectiveIndex):選擇性指數為TD50/IC50。結果表明細鈹香薷的醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)、50^乙醇洗脫部位(ER-50X醇洗脫組分)以及分離得到的黃酮均具有抑制流感病毒的作用，其中芹菜素表現出較強的流感病毒抑制作用。芹菜素的流感病毒半數抑制濃度IC50比奧塞米韋的3倍，但比利巴韋林的小4倍，即其抑制病毒的活性比奧塞米韋的小3倍，比利巴韋林的大4倍，其選擇性指數為7,48。可見，細皺香薷的醋酸乙酯部位、50%乙醇洗脫部位及黃酮化學成分均為其抗流感病毒的物質基礎，其中并菜素為其抗流感病毒的重要物質基礎。實驗例3:細皺香薷有效組份及主要化學成分的抗氧化活性評價。本實施例采用DPPH自由基清除實驗研究其抗氧化活性。在反應體系中，含有65uMDPPH溶液190ul，待測樣品10wl，總體積為200u'l，陽性對照組加入維生素C，空白對照組以去離子水代替待測樣品，室溫下避光靜置30分鐘后，于515nm波長處測定吸光度。根據吸光度計算DPPH清除率，并計算SC幼值.實驗結果見表3，表3細皺香薷的化學成分及提取物的DPPH自由基清除作用<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.61結果表明化學成分芹菜素(apigenin)、ER-50X醇洗脫組分、ER-醋酸乙酯層、ER-水總提等具有較強的抗氧化作用，其他成分也具有一定的抗氧化作用。說明該中藥有效部位及活性成分在疾病治療中還具有自由基清哮作用和自由基損傷保護作用。實施例4:細皺香薷有效組份及主要成分的抗炎作用評價。本實施例應用抗腫瘤壞死因子實驗研究其抗炎作用。該實驗利用巨噬細胞在誘導劑刺激后可分泌大量炎性細胞因子，觀察樣品對腫瘤壞死因子分泌水平的影響。在反應體系中，含有約5X10Vml巨嗜細胞，待測樣品10ul，刺激劑190ul，總體積為200u1,同時設陰性對照？L，以去離子水代替待測樣品，37°C、5%C02孵育6h,取上清90ul，加入到濃度為2X105/ml的L929細胞中，并加入10ul放線菌素D(終濃度5ug/ml)，37°C、5%C02孵育24h，加入MTT后繼續孵育4小時，于540nm波長處測定吸光度。根據吸光度計算TNF-a抑制率，陽性評價標準抑制率大于50%(參考文獻徐叔云，卞如濂，陳修主編。《藥理實驗方法學》。北京人民衛生出版社2005。)。實驗結果(見表4)表4細鈹香薷的化學成分及提取物對腫瘤壞死因子的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表明中藥的乙醇總提物(ER-乙醇總提物)、乙酸乙酯部位(ER-乙酸乙酯層)、正丁醇部位(ER-正丁醇層)和水溶性部位(ER-水層)具有較強的抑制巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子作用，其他部位及主要化學成分也具有一定的活性。說明該中藥各提取部位及主要化學成分具有抗炎作用。實驗例5:細皺香薷提取物促T淋巴細胞轉移作用實驗本實施例利用純系小鼠脾臟進行T/B淋巴細胞增殖反應，觀察樣品對細胞的影響。在反應體系中，含有約1X106/ml脾細胞，待測樣品10&1，加ConA(終濃度5ug/ml)，總體積為200ul，同時設陰性對照孔，以去離子水代替待測樣品，陽性對照組加入環孢素A，37°C、5%C02孵育72h，加入MTT后繼續孵育4小時，于540nm波長處測定吸光度。根據吸光度計算淋巴細胞轉化率(參考文獻徐叔云，卞如濂，陳修主編。《藥理實驗方法學》。2005，北京人民衛生出版社)。實驗結果(見表5)。表5細皺香薷提取物促T淋巴細胞轉移作用實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表明細皺香薷ER-水層在所檢測的濃度范圍均具有穩定的促T淋巴細胞轉化作用，說明有效部位具有增強免疫的作用。權利要求1、細皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)的有效組份的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(a)細皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)以85％乙醇提取，合并提取液，減壓蒸干，得細皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細皺香薷乙醇總提物溶于水中，以石油醚萃取得細皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)剩余部分分別以醋酸乙酯、正丁醇萃取分別得到細皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)和細皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，最后得細皺香薷水層部位(ER-水層)；或(a)細皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsl.)用水提取，合并提取液，減壓蒸干得細皺香薷水總提物(ER-水總提)，(b)加入水—乙醇溶液(85％的乙醇)至乙醇含量為75％，得細皺香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(c)將沉淀物溶于水后，用大孔樹脂進一步分離，用不同比例的水—乙醇洗脫液洗脫后得到不同組份細皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，細皺香薷乙醇洗脫組份(ER-30％乙醇洗脫組份)，細皺香薷乙醇洗脫組份(ER-50％乙醇洗脫組份)和細皺香薷70％乙醇洗脫組份(ER-70％乙醇洗脫組份)。2、根據權利要求1的制備方法獲得的細皺香薷有效組份，其特征在于，所述的細皺香薷有效組份選自(a)細皺香薷乙醇總提物(ER-乙醇總提物)，(b)細皺香薷石油醚部位(ER-石油醚層)，(c)細皺香薷醋酸乙酯部位(ER-醋酸乙酯層)，(d)細皺香薷正丁醇部位(ER—正丁醇層)，(e)細皺香薷水層部位(ER-水層)；以及(al)細皺香薷水總提物(ER-水總提)，(bl)細鈹香薷沉淀物(ER-水提醇沉)，(cl)細皺香薷水洗組份(ER-水洗組份)，(dl)細皺香薷30%乙醇洗脫組份(ER-30X乙醇洗脫組份)，(el)細皺香薷50%乙醇洗脫組份(ER-50X乙醇洗脫組份)，(fl)細皺香薷70%乙醇洗脫組份(ER-70X乙醇洗脫組份)。3、一種藥物組合物，其特征在于，含有至少一種選自權利要求2的細皺香薷有效組份和藥效學上可接受的載體。4、一種藥物組合物，其特征在于，含有藥效學上可接受的載體和至少作為有效成分的化合物，所述的化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)o5、權利要求2的細皺香薷(E/Ao/feZan/g"/cwaHemsl.)的有效組份在制備預防和、或治療流感藥物中的應用。6、一類黃酮類化合物在制備預防和\或治療流感藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin),芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester7、權利要求2的細皺香薷(EMofe/an/gwforaHemsl.)的有效組份在制備抗氧化藥物中的應用。8、一類黃酮類化合物在制備抗氧化藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin),木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。9、權利要求2的細皺香薷(幼to/te/arwgw/(waHemsl.)的有效組份在制備抗炎藥物中的應用。10、一類黃酮類化合物在制備抗炎藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethylester)。11、權利要求2的細皺香薷(孤to/te/an/g"foMHemsl.)的有效組份在制備增強免疫藥物中的應用。12、一類黃酮類化合物在制備增強免疫藥物中的應用，所述的黃酮類化合物選自芹菜素(apigenin)，木犀草素(luteolin)，芹苷(apiin)，木犀草苷(galuteolin)，木犀草素-3'-葡糖醛酸甲酯(luteolin-3'-glycuronicmethyl全文摘要本發明涉及中藥細皺香薷(ElsholtziarugulosaHemsI.)的有效組份及主要活性成分的制備方法，含有有效組份及主要活性成分的藥物組合物，以及活性組分在預防和治療流感疾病中的應用。本發明的創新之處在于從細皺香薷中提取的有效組份及分離得到的活性成分對所有類型流感病毒均具有神經氨酸酶抑制作用；具有抗氧化、抗炎免疫作用。文檔編號A61P39/06GK101385776SQ200710121740公開日2009年3月18日申請日期2007年9月13日優先權日2007年9月13日發明者何國榮,波劉,劉艾林,杜冠華,秦海林,胡娟娟申請人:中國醫學科學院藥物研究所