專利名稱：銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物在制備血管擴張藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物在制備血管擴張藥物中的應用。
背景技術：
重金屬污染土壤的綠色植物修復技術，是通過植物光合作用，充分利用太陽能，吸 收固定空氣中的CO2,轉化為生物質中的碳；同時通過收割大量富含重金屬的生物質，達到 帶走土壤中重金屬的目的；是一種具有低廉高效、環境友好、綠色低碳等優勢的生物環保創 新技術，已經得到了國內外各級政府和科學家的高度認可。我國銅富集植物海州香薷能耐 受污染土壤中的高銅，明顯降低污染土壤中水溶態或醋酸提取態銅含量，在不破壞農田生 態環境和種植功能的前提下，能夠降低污染土壤中有效態銅含量，恢復土壤農耕、保障食品 安全(中國專利，ZL200310108946. 1，銅污染土壤的生物原位修復方法)。而且，我國大面 積存在的鎘鉛銅中輕度污染農業土壤，我國Zn/Cd超積累及Pb富集植物東南景天、Cu富集 植物海州香薷及其修復應用技術已經得到國內很多單位的采用；在上海望新中輕度污染蔬 菜基地、浙江省富陽重金屬污染農業土壤修復基地、浙江省慈溪市中輕度污染蔬菜基地，利 用海州香薷_東南景天_蔬菜互作或間套作模式，已經建立了適合于我國國情的鎘鉛銅中 輕度污染農業土壤的“邊生產邊修復”創新技術。土壤污染的修復植物是可再生的生物質 資源；當今國際土壤學、植物營養學、環境科學領域的研究重點和難點是，如何將土壤修復 植物高附加值利用，開發生物基化學品，實現重金屬污染土壤的植物修復與可再生生物質 資源利用的緊密結合。海州香薷是唇形科香薷屬植物，在東南亞地區多作為民間藥草使用。近年來對海 州香薷化學成分和藥理作用的研究表明，其葉片和花枝的乙醇提取物在臨床上有較好的抑 菌抗炎、抗氧化功能。研究表明銅耐性/富集植物海州香薷能夠及時清除銅離子產生的氧 自由基，保護細胞膜完整性。銅污染土壤中生長的海州香薷全草、花枝等含有黃酮成分，我 們已經報道了海州香薷總黃酮提取的方法(中國專利，ZL 200610050201. 8，從銅污染土壤 的修復植物海州香薷中提取總黃酮的方法)。生物類黃酮具有清除自由基和抗氧化的能力， 其作用機理在于它阻止了自由基在體內的產生。生物類黃酮可以通過抗自由基作用直接抑 制癌細胞生長及抗致癌因子達到抗癌、防癌作用；還可以保護細胞免受致癌因子損害。而 且，生物類黃酮可以防止低密度脂蛋白發生脂質過氧化反應，降低病人血漿中的低密度脂 蛋白被氧化的易感系數，提高血漿中低密度脂蛋白的抗氧化、抗凝聚、抗滯留能力，因而，可 用來治療各種因血脂高、脂質氧化所引起的疾病。近年來，天然植物(如銀杏、沙棘、大豆和杭白菊)的心血管效應受到了國內外 學者的高度重視，目前對其有效部位的研究已經成為新藥開發的熱點。多項研究顯示一 些天然植物的黃酮類成分可通過減輕心臟缺血/復灌損傷發揮其心臟保護作用，通過舒 張血管發揮其降低血壓的作用。近年來的研究顯示，大豆黃酮可劑量依賴性的舒張苯腎 上腺素預收縮的大鼠主動脈，(IC5tl = 33. 6 μ M) [Santosh KM, Stewart EA, Choudhury Ζ,Cheng M，Khatab N，et al. Endothelium-dependent relaxation of rat aorta and main pulmonaryartery by the phytoestrogens genistein and daidzein. Cardio Res，2000， 40:539-546]，而且大豆黃酮還可內皮非依賴性的舒張由去甲腎上腺素、KCl、CaCl2預收 縮的腸系膜動脈[Nevala R，Korpela R，Vapaatalo H. Plant-derived estrogens relax rat mesentericartery in vitro. Life Sci，1998，63 (6) :95_100]。Torregrosa 等觀察 了大豆黃酮等植物雌激素對家兔離體大腦動脈的作用，結果發現大豆黃酮可以劑量依賴 性的舒張大腦基底動脈環[Torregrosa G，Burguete MC，Perez-Asensio FJ，Salom JB， Gil JV，AlborchE. Pharmacological profile of phytoestrogens in cerebral vessels in vitrostudywith rabbit basilar artery .Eur J Pharmacol，2003，15，482 (1-3) 227-234]。蔣惠娣等利用大鼠胸主動脈環模型，證實杭白菊乙酸乙酯提取物(CME)具有顯 著的舒血管作用[Jiang Huidi，Wang Lingfei，Zhou Xinmei, et al. Vasorelaxant effect andunderlying mechanism of EtoAc extract from Chrysanthemum morifolium in ratthoracic aorta. China Journal of Pathophysiology. 2005, 21 (2) :334_338]。f旦UiL 有關沙棘和銀杏葉總黃酮提取物舒張血管效應的報道。目前，尚沒有海州香薷總黃酮提取物具有舒張血管作用的文章被發表。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物的用 途用于制備血管擴張藥物。為了解決上述技術問題，本發明提供一種銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物在 制備血管擴張藥物中的應用。本發明的銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物(Total Flavonoids of ElsholtziaSplendens, TFES)對離體大鼠胸主動脈具有劑量依賴性的血管舒張活性； 50-100 μ g/ml中等濃度劑量的海州香薷總黃酮，可時間依賴性舒張苯腎上腺素(PE， 10_2mol/L)預收縮的胸主動脈血管環，其出現明顯舒血管效應的時間為IOmin ；且上述舒血 管效應具有部分內皮依賴性。本發明所說的劑量依賴性的心血管舒張活性，是200 μ g/ml高濃度劑量的海州香 薷總黃酮TFES，使苯腎上腺素(PE)預收縮的內皮完整的離體大鼠胸主動脈血管環張力最 大舒張效果可達91 士5%，使KCl預收縮的內皮完整、去內皮的離體大鼠胸主動脈血管環張 力最大舒張效果分別為55 士 8 %和48 士 7 %。本發明所說的部分內皮依賴性的血管舒張活性，是一氧化氮合酶抑制劑 L-NAME (0. Immo 1/L)和鳥苷酸環化酶抑制劑ODQ(5X 10_4mol/L)預處理對TFES誘導的內皮 完整動脈環舒張作用具有明顯的抑制效應，但環氧合酶抑制劑吲哚美辛(lndo，0. Olmmol/ L)預處理對TFES誘導的內皮完整動脈環舒張作用無明顯抑制作用。本發明的離體大鼠胸主動脈血管環，是將體重為240-260g的 Sprague-Dawley(SD)大鼠斷頭后迅速取出胸主動脈，置于通混合氣的冰冷K-H液中，剔除 周圍結締組織，剪成3-4mm寬的血管環。本發明的大鼠胸主動脈血管環張力，是將血管環懸掛于盛有5ml K-H液的37°C恒 溫浴槽中，通以95% 02+5% CO2的混合氣體，在孵育液中加入海州香薷總黃酮等實驗試劑，采用RM6240微機信號采集系統記錄血管環張力變化。本發明中所用的海州香薷總黃酮提取物，可按申請號為200610050201. 8的《從銅 污染土壤的修復植物海州香薷中提取總黃酮的方法》進行制備，具體為將種植在銅污染土 壤的盛花期海州香薷全草、花枝和種子，風干后得到的風干物，粉碎并過10目篩至50目篩， 加入10倍重量份至20倍重量份的體積濃度為40% -60%的水-乙醇混合溶劑，浸泡至微 沸回流提取2次至3次，每次1小時至3小時，合并提取液，放置室溫后，過濾，濾液減壓濃 縮，回收乙醇后，分別用蒸餾水、石油醚洗滌，除去雜質，然后母液分別用乙酸乙酯、正丁醇 萃取，濃縮正丁醇萃取層后，得到棕黃色的海州香薷總黃酮粉末。本發明的海州香薷總黃酮提取物作為血管擴張藥物時，具體用法和用量如下根據離體動物實驗有效劑量(IC5tl = 50士6mg/L)，海州香薷總黃酮提取物作為血管擴張藥物整體應用時，靜脈注射5 20mg/kg (體重)海州香薷總黃酮提取物則可產生明 顯血管舒張效應。本發明的顯著優點和效果如下a)、本發明是以修復銅污染土壤的銅耐性/富集植物海州香薷為原料，具有顯著 的生態環境效應。重金屬污染土壤的綠色植物修復技術，是通過植物光合作用，充分利用太 陽能，吸收固定空氣中的CO2,轉化為生物質中的碳，通過生物固碳降低空氣中CO2濃度；同 時通過收割大量富含重金屬的生物質，達到帶走土壤中重金屬的目的。海州香薷富集植物 帶走中輕度污染土壤的重金屬時，預計每公頃污染土壤可生產植物生物量7. 9噸/年(干 重)，依據生物固碳8萬元/噸的生態補償機制計算，僅此項經濟效益每公頃污染土壤為 63. 2萬元/年，在減少CO2濃度方面會產生重大國際環境效應。b)、隨著海州香薷植物修復銅污染土壤的大規模田間示范和應用推廣，植物修復 材料的產后處置和資源化是個急需解決的環境問題，可再生植物資源海州香薷中黃酮的開 發利用，為拓展海州香薷黃酮在心血管疾病研究方面提供基礎，促進我國可再生生物質植 物資源的循環利用。C)、本發明采用了簡單合理的工藝條件，通過對水-醇濃度、乙醇用量、浸提時間 的有效控制，使銅耐性/富集植物海州香薷全草、花枝和種子干粉中，總黃酮溶出量粗提物 可達7. 4-16%，對提取物進行離體大鼠胸主動脈的血管舒張作用測定，顯示提取物具有部 分內皮依賴性舒張血管效應，為從提取物中發現具有治療心血管疾病的先導化合物提供了 依據。綜上所述，本發明充分開發利用了銅耐性/富集植物海州香薷總黃酮提取物 (totalflavonoids of Elsholtzia splendens)，測定了提取物對大鼠主動脈血管的舒張活 性、及其誘導的血管舒張活性是否具有內皮依賴性；從而得出海州香薷總黃酮提取物能用 于制備血管擴張藥物。本發明創建了適合我國國情的土壤植物修復材料一海州香薷產后 高附加值利用的新途徑，從而促進我國銅污染土壤植物修復的可持續發展。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖1為實施例1中海州香薷總黃酮(TFES)對苯腎上腺素(PE)預收縮大鼠胸主動 脈張力的影響；
圖中Mean SD, η = 12 ；*P < 0. 05，**Ρ < 0. Olvs Control (Control 代表對照；E+ 代表內皮完整)；#p < 0. 05，##P < 0. Olvs Control (Control代表對照；E-代表去內皮)。圖2為實施例2中海州香薷總黃酮(TFES)對KCl預收縮大鼠胸主動脈張力的影 響；圖中=Mean SD, η = 12 ；##Ρ < 0. 01 vs Control (Control 代表對照；E+ 代表內皮 完整)；*P < 0. 05vs Control (Control代表對照；E-代表去內皮)。
圖3為實施例3中海州香薷總黃酮(TFES)對大鼠離體胸主動脈血管環舒張作用 的時間依賴性。圖4為實施例4中L-NAME，ODQ或吲哚美辛(Indo)預處理對香薷總黃酮(TFES) 血管舒張作用的影響；圖中=Mean SD, η = 12 ；**Ρ < 0. 01，L_NAME+TFES 組 vs ES 組;#P < 0. 01,0DQ+TFES 組 vs TFES 組。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下述實施例1 4中所用的海州香薷總黃酮提取物(TFES)均可按照如下方法得 到盛花期收獲種植在銅污染土壤的海州香薷花枝，烘干，粉碎后，過40目篩。稱取 干粉50g，用體積濃度為60 40的乙醇-水溶液5000毫升，回流浸提4小時，冷卻，抽濾， 濾渣繼續用同一種溶液提取，反復3次，冷卻，抽濾，合并濾液，分光光度計測總黃酮含量為 11.8%。乙醇回收，固體繼續用蒸餾水稀釋總黃酮粗提物，除去水不溶性雜質，再用石油醚 萃取，除去脂溶性雜質，然后母液用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯萃取層，最后母液用正丁 醇萃取，減壓濃縮正丁醇萃取層，冷凍干燥得到總黃酮8. 0克。實施例1、海州香薷總黃酮提取物(TFES)對苯腎上腺素(PE)預收縮大鼠胸主動脈 張力的影響TFES對PE預收縮的內皮完整主動脈環張力影響組(η = 9)選擇內皮完整的血管 環，加入PE(IymoVL)預收縮的大鼠胸主動脈達穩態后，累積加入TFES，使灌流液中TFES 濃度分別達5、10、25、50、100、200 μ g/ml ；以加入TFES后的血管張力幅度與PE誘發的血管 環的最大收縮幅度之間的比值反映血管張力的變化，繪制TFES對PE預收縮的內皮完整主 動脈環的TFES濃度-舒張曲線。TFES對PE預收縮主動脈環張力影響組(η = 9):使用去 除內皮的血管環，其余方法同上，繪制TFES對PE預收縮的去內皮主動脈環的TFES濃度-舒 張曲線(圖1)。結果表明，TFES濃度為5、10、25、50、100、200 μ g/ml，可使PE預收縮的內皮完整的
主動脈血管環有明顯的舒張作用Cp <0.01)，并呈現濃度依賴性(圖1)，最大舒張效果可 達91 士5% ；去除內皮后，這種舒張作用部分被取消。上述實施例1中所用的大鼠離體胸主動脈環的制備方法如下將體重為240_260g 的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠斷頭后迅速取出胸主動脈，置于通混合氣的冰冷K-H液 中，小心去除周圍結締組織，血管剪成3-4mm寬的血管環。根據實驗需要去內皮，將血管環 懸掛于經37°C預熱容量為5mLK-H液的浴槽內，一端固定，一端通過張力換能器連接RM6240微機信號采集系統，記錄血管環張力。調零30min后，靜息張力設為2g，平衡lh。加入 60mmol/L KC1，重復3次，以激發血管環活性。加入1 μ mol/L苯腎上腺素PE預收縮血管 環達峰值，加入ΙΟμπιοΙ/L ACh檢驗血管內皮完整性。以PE或KCl誘發最大收縮幅度為 100%,以加入藥物后的血管張力幅度與PE或KCl誘發最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。實施例2、海州香薷總黃酮提取物(TFES)對KCl預收縮大鼠胸主動脈張力的影響TFES對內皮完整KCl預收縮主動脈環張力影響組(η = 9):選擇內皮完整的血管 環，用KCl (60mmol/L)預收縮達到穩態后，采用累積加藥法加入TFES，使灌流液中TFES濃 度分別達5、10、25、50、100、200 μ g/ml ；以加入TFES后的血管張力幅度與KCl誘發的血管 環的最大收縮幅度之間的比值反映血管張力的變化，繪制TFES對PE預收縮的內皮完整主 動脈環的TFES濃度-舒張曲線。TFES對去內皮KCl預收縮主動脈環張力影響組(η = 8): 使用去除內皮血管環，其余方法同上，繪制TFES對KCl預收縮的去內皮主動脈環的TFES濃 度-舒張曲線(圖2)。結果表明，TFES對KCl預收縮的內皮完整或去內皮胸主動脈均產生濃度依賴性的 舒張作用，最大舒張效果分別為55士8%和48士7% (圖2)。大鼠離體胸主動脈環的制備方法同實施例1中的方法。實施例3、TFES對大鼠離體胸主動脈血管環舒張作用的時間依賴性選擇內皮完整，用PE(IymoVL)預收縮內皮完整主動脈環達穩態后，加入 TFES (0. 05g/ml)使灌流液濃度達到100 μ g/ml，每3min記錄血管張力變化；同時選擇去內 皮的主動脈環，用PE(IymoVL)預收縮去內皮主動脈環達穩態后，方法同上，每3min記錄 血管張力變化；測定TFES舒血管作用是否存在時間依賴性(圖3)。結果表明，對內皮完整的血管環用PE預處理，在保持TFES為100 μ g/ml濃度環 境下觀察血管的張力變化，得到血管內皮最大舒張程度是峰值的9. 31% 士0. 11，最大舒張 時間Tmax及舒張一半時間T1/2分別大于60min和19. 78士3. 56min。對去內皮血管進行相同 操作，得到血管內皮最大舒張程度是峰值的14. 00% 士0. 25，最大舒張時間Tmax及舒張一半 時間T1/2分別為大于60min和35. 51 士7. 12min，有內皮組的T1/2顯著性小于無內皮組的(ρ < 0. 05)(圖 3)。實施例4、L-NAME, 0DQ、吲哚美辛預處理對TFES誘導的舒張反應的影響內皮完整的主動脈環，分別用100 μ mol/L 一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME)、 500ymol/L鳥苷酸環化酶抑制劑(ODQ)或10 μ mol/L環氧合酶抑制劑吲哚美辛預處理 30min后，再用PE (1 μ mol/L)預收縮血管達穩態后，采用累積加藥法加入TFES，使灌流液中 TFES濃度分別達5、10、25、50、100、200 μ g/ml ；觀察內皮完整主動脈環的TFES濃度-舒張 曲線(圖4)。結果表明，L-NAME和ODQ預處理對TFES誘導的內皮完整動脈環舒張作用具有明 顯的抑制效應，但吲哚美辛預處理對香薷總黃酮誘導的內皮完整動脈環舒張作用無明顯影 響(圖4)。說明TFES的部分內皮依賴性舒血管作用機制涉及NO-cGMP信號轉導途徑，為海 州香薷總黃酮在心血管疾病防治中的應用提供了依據。對比實驗以多種不同的總黃酮提取物作為實驗對象，分別按照實施例1所述的 方法測定其對苯腎上腺素(PE)預收縮大鼠胸主動脈張力的影響，選擇內皮完整的血管環，使灌流液中總黃酮提取物的濃度為ΙΟΟμ g/ml，結果如下100 μ g/ml的杭白菊總黃酮提取物可使苯腎上腺素預收縮的大鼠胸主動脈舒張約69士6% ；100 μ g/ml的銀杏葉總黃酮和100 μ g/ml的大豆總黃酮的血管舒張效應分別為 70士5%和 71 士6% ；而本發明所述的100 μ g/ml的海州香薷總黃酮的舒張效應為78士7%。以上結果說明本發明的海州香薷總黃酮的舒血管效應明顯優于杭白菊總黃酮提 取物、銀杏葉總黃酮和大豆總黃酮。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物在制備血管擴張藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了銅污染土壤的海州香薷總黃酮提取物在制備血管擴張藥物中的應用。本發明的海州香薷總黃酮的舒血管效應明顯優于杭白菊總黃酮提取物、銀杏葉總黃酮和大豆總黃酮。
文檔編號A61P9/08GK101810673SQ201010151950
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月20日 優先權日2010年4月20日
發明者彭紅云, 楊肖娥, 王會平, 石偉勇, 章國林 申請人:浙江大學