專利名稱：：一種鐮孢菌纖溶酶及其制備方法
技術領域：
：本發明屬于生物制藥
技術領域：
，具體地說，涉及一種鐮孢菌纖溶酶及其制備方法。
背景技術：
：血栓病是由于血栓引起的血管腔狹窄與閉塞，是主要臟器發生缺血和梗塞而引發機能障礙的疾病。血栓病屬于心腦血管疾病，據統計，全球每年腦血栓、腦梗塞、心肌梗塞、冠心病、動脈硬化等心腦血管疾病奪走1200萬人的生命，接近世界總死亡人數的1/4，成為人類健康的頭號大敵。我國每年死于心腦血管疾病的人數達到260萬人以上，存活的患者75%致殘。盡管血栓形成與血管及諸多因子有關，然而溶栓療法是心腦血管栓塞性疾病的一種常規治療手段。根據其不同的作用機制，溶栓劑可分為兩種類型l、纖溶酶原激活劑，如組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶(UK)，鏈激酶(SK)等，這類物質激活纖溶酶從而降解纖維蛋白。2、纖維蛋白溶酶，如蚓激酶、多種蛇毒抗栓酶，這類物質能直接降解血液中的纖維蛋白。目前臨床上使用的溶栓藥物，在治療血栓性疾病方面有一定的作用，但也存在很大的缺陷，如UK和SK的特異性較低、使用中可能會造成血纖溶酶過量激活，導致纖維蛋白原過量降解，引發全身出血，同時SK還具有很強的免疫原性，重復使用容易引起變態反應。tPA雖然對纖維蛋白的親和力很強，因而非常有效，但是這種酶非常昂貴，病人有可能會出現胃腸道出血，過敏反應。這些現有的溶栓藥物的不足，迫使人們從新的來源中去研制更有效的溶栓藥物。微生物是溶栓藥物的重要來源，目前從微生物中分離纖溶酶已有一些報道，其中包括枯草桿菌(BflciWiAs取)、鏈霉菌(S加//o，"'w)、豆豉桿菌(5fl"7/wsa，/o/一咖c/e"s)、根霉(7Wzo;msc/n'"e^)以及金黃色葡萄球菌(5to/7/z_y/ococc";y)等。近年來不斷篩選到許多能產生纖溶酶的微生物，但利用菊花莖內生鐮孢菌來分離制備纖溶酶，還未見報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種新型的纖溶酶——鐮孢菌纖溶酶。本發明的另一目的在于提供所述鐮孢菌纖溶酶的制備方法。本發明提供的鐮孢菌纖溶酶來源于菊花莖內生真菌鐮孢菌(尸^"n'wmsp.)。3其中，所述菊花莖內生真菌鐮孢菌(Fwran'Mwsp.)的保藏號為CGMCCNo.2347。本發明所述鐮孢菌纖溶酶的N—末端氨基酸殘基序列為QASSGTPATIRVLVV;分子量為28，000Da;等電點為8.1。根據本發明，所述鐮孢菌纖溶酶的纖溶作用可被苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸抑制。根據本發明，所述鐮孢菌纖溶酶的制備方法，包括以下步驟A)將菊花莖內生鐮孢菌進行發酵培養；B)從發酵液中分離純化得到鐮孢菌纖溶酶。其中，所述步驟B)包括以下步驟C)發酵液中加入硫酸銨分級鹽析，離心收集沉淀；D)溶解沉淀，經微濾收取透出液，再經超濾膜超濾，收取截留液；E)截留液以SephadexG—25柱層析或透析法脫鹽；F)以MonoQ陰離子層析，用NaCl洗脫，收集活性峰的洗脫液，洗脫液經G—25柱層析脫鹽后冷凍干燥，得到鐮孢菌纖溶酶的粗酶；'G)所得的鐮孢菌纖溶酶粗酶經Superdex75凝膠層析，收集活性峰，凍干后得到電泳純的鐮孢菌纖溶酶。本發明的鐮孢菌纖溶酶可應用于制備溶栓藥物。本發明的鐮孢菌纖溶酶及其制備方法的優點為該酶具有能直接降解纖維蛋白的纖溶活性，有良好的血栓溶解和抑制靜脈血栓形成的作用，并且分子量較小，同時，該酶的生產原材料豐富，生產工藝簡便，成本低廉，能彌補尿激酶等現有臨床藥物在生產和治療方面的不足，因此具有開發價值。圖1是鐮孢菌纖溶酶HCCB00699S1的纖維蛋白平板圖。圖2是鐮孢菌纖溶酶HCCB00699S1降解纖維蛋白活性特征的平板圖。圖3是鐮孢菌纖溶酶HCCB00699S1的SDS-PAGE電泳結果圖，其中S為標準品，1為樣品。具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。本發明中，菊花莖內生真菌鐮孢菌(F^"n'"msp.)菌株的保藏編號為CGMCCNo.2347，保藏日期為2008年1月16日，保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。本發明中，纖維蛋白原購自綠十字生物制品有限公司；凝血酶購自上海鷹躍生物試劑有限公司；尿激酶(UK)購自蘇州新寶生物醫藥有限公司；TLCK、TPCK、TMSF、EDTA、纖溶酶原均購自Sigma公司；硫酸銨購自國藥集團化學試劑有限公司；超濾膜、微濾膜購自AmershamBiosciences公司；AKTApurifier100蛋白純化儀由上海張江藥谷公共服務平臺有限公司提供。本發明中，所用培養基配方如下(重量/體積百分比)馬鈴薯一葡萄糖(PDA)培養基馬鈴薯20%、葡萄糖2%、生物素0.01%、蛋白胨0.2%、瓊脂2%。種子培養基葡萄糖1%、玉米粉1%、黃豆粉2%、KH2PO40.1%。發酵培養基玉米粉1.5%、面粉1%、黃豆粉1%、花生粉1%、碳酸鈣0.3%、微量元素(FeS040.001%、MnS040.001%、ZnS040.001%、乙酸鎳0.001%、CoCl20.001%)、鹽溶液(MgSO40,l%、NaC10.1%、KH2PO40,l%)。實施例1、鐮孢菌纖溶酶的制備按照下面的步驟制備鐮孢菌纖溶酶1、將菊花莖內生真菌鐮孢菌菌株(保藏編號CGMCCNo.2347)在PDA斜面培養基上，28。C培養4一5天，之后接種于種子培養基，28。C培養2天，再按10%的接種量，接種于發酵培養基，28t:培養6天，將培養物離心或過濾得發酵液。2、所得的發酵液中，加入硫酸銨至40%飽和度，4。C靜置4h，離心得上清液，繼續加入硫酸銨至60%飽和度，4t:靜置4h，離心得蛋白質沉淀。3、所得的沉淀用少量Tris—HCl緩沖液(pH7.4)溶解，經O.lmicron微濾膜收取透出液，再將獲得的透出液經10，000分子量的超濾膜超濾，收取截留液。4、所得到的截留液以SephadexG—25柱層析或透析法脫鹽。其中，以柱層析法脫鹽采用下述步驟，20mmol/L的Tris—HC1緩沖液(pH7.4)作為流動相，流速5ml/min，紫外檢測，收集活性峰；以透析法脫鹽采用下述步驟，截留液置于透析袋中，對20mmol/L的Tris—HCl緩沖液(pH7.4)透析，4°C、24h。5、以MonoQ陰離子層析，用lmol/LNaCl洗脫，280nm紫外檢測，收集活性峰的洗脫液，洗脫液經G—25柱層析脫鹽后冷凍干燥，得到鐮孢菌纖溶酶的粗酶。6、鐮孢菌纖溶酶的精提純所得的鐮孢菌纖溶酶粗酶經Superdex75凝膠層析，流速lmin/ml，280nm紫外檢測，收集活性峰，凍干后得到電泳純鐮孢菌纖溶酶，將其命名為HCCB00699S1。實施例2、鐮孢菌纖溶酶的鑒定取實施例1中所得鐮孢菌纖溶酶HCCB00699S1進行下列檢測2.1、在鐮孢菌纖溶酶活性特征研究中主要采用平杈法，具體為在直徑為9cm平皿中，先加入5ml0.5%的纖維蛋白原溶液，再加入含100ul(5U/ml)凝血酶的1%瓊脂糖溶液5ml，快速搖勻，室溫下靜置2h。用微量進樣器點10ul鐮孢菌纖溶酶或者是對照液(空白發酵培養基和Tris—HCl緩沖液)在纖維蛋白平板上，經37'C保溫18h，取出后用卡尺測出溶圈直徑。以溶圈直徑平方做縱坐標，尿激酶標準品的濃度為橫坐標作圖，即可在圖上査出樣品的活力單位。結果如圖l所示。圖1中的2為加入鐮孢菌纖溶酶后，顯示透明圈，而圖1的1為使用Tris—HCl緩沖液為對照樣品，圖1中的3為使用空白培養基作為對照樣品，從圖中可以看出，l和3均無透明圈，表明HCCB00699S1為具有纖溶性質的纖溶酶。2.2、直接降解纖維蛋白活性特征的測定。釆用2.1所示的平板法，分別以兩種平板一種不加纖溶酶原且8(TC加熱(滅活市售纖維蛋白原中可能混有的纖溶酶原)的平板(a)和一種不加熱并且加有纖溶酶原的平板(b)，在上述兩種平板上加入鐮孢菌纖溶酶，測定鐮孢菌纖溶酶的纖溶活性，結果如圖2所示。由圖2可知，a和b兩種平板上的溶圈面積無明顯差異，由此說明鐮孢菌纖溶酶的纖溶活性是直接降解纖維蛋白。2.3、取鐮孢菌纖溶酶溶液，按Laemmli法進行SDS-PAGE蛋白電泳，分離膠濃度為12%,考馬斯亮藍染色，結果如圖3所示。由圖3顯示的遷移率可知，所得鐮孢菌纖溶酶的分子量約為28,000Da。2.4、取鐮孢菌纖溶酶進行等電聚焦電泳，采用標準蛋白作為pH梯度，檢測纖溶酶等電點，結果顯示其等電點為8.1。62.5、取鐮孢菌纖溶酶凍干后的純品，溶解于少量Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中，按照Edman法測定蛋白N—末端氨基酸殘基序列，結果顯示其N端15個氨基酸序列為QASSGTPATIRVLVV。2.6、取鐮孢菌纖溶酶進行不同抑制劑對酶活性影響的檢測將鐮孢菌纖溶酶分別溶于四種不同濃度的抑制劑中，37'C下放置30min，測定剩余活力，結果如表l所示。表1不同抑制劑對鐮孢菌纖溶酶活性的影響抑制劑濃度(mmol/L)剩余活力(％)Nons1000.550PMSF1.5304.560,197TLCK0.3970,5950.1101TPCK0.3960.5970.524EDTA1.5164.54由表1可知，鐮孢菌纖溶酶HCCB00699S1的纖溶作用可被一種典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺酰氟)和金屬蛋白酶抑制劑EDTA(乙二胺四乙酸)所抑制，幾乎不受TLCK(N-甲苯磺酰-L-賴氨酸氯甲基化酮)和TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)抑制，結果表明HCCB00699S1可能是一種絲氨酸金屬蛋白酶。72.7、將本發明所得鐮孢菌纖溶酶與不同來源纖溶酶進行比較，結果如表2所示表2、鐮孢菌纖溶酶與不同來源纖溶酶的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表2的結果可知，通過與已經報道的其他來源的鐮孢菌纖溶酶以及其他一些已知纖溶酶的性質比較和N—末端序列比對，可知發明人純化得到的蛋白是一種新的纖溶蛋白。2.8、鐮孢菌纖溶酶的藥理作用將鐮孢菌纖溶酶以不同劑量在大鼠靜脈給藥，實驗結果如表3所示。表3、纖溶酶樣品對大鼠動靜脈旁路血栓形成的影響(^士s，n二6)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0,05，**P<0.01與陰性對照組比較；AP<0.05，AAP<0.01與肝素組比較纖溶酶樣品對靜脈血栓的抑制率按如下公式計算:抑制率(％)=(l'注射纖溶酶樣品后血栓濕重注射生理鹽水后血栓濕重由表3數據可知，隨著鐮孢菌纖溶酶劑量的增加，血栓濕重逐漸下降，表明該酶對大鼠動靜脈旁路血栓的形成具有顯著的抑制作用。本發明的鐮孢菌纖溶酶具有如下優點-該酶具有能直接降解纖維蛋白的纖溶活性，有良好的血栓溶解和顯著抑制靜脈血栓形成的作用，并且分子量較小；同時，通過液體發酵，使得該酶的生產原材料豐富，生產工藝簡便，成本低廉，能彌補尿激酶等現有臨床藥物在生產和治療方面的不足，因此具有開發價值。權利要求1、一種鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述鐮孢菌纖溶酶來源于菊花莖內生真菌鐮孢菌(Fusariumsp.)。2、如權利要求1所述鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述菊花莖內生真菌鐮孢菌(Fiwan、wsp.)的保藏號為CGMCCNo.2347。3、如權利要求1或2所述鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述鐮孢菌纖溶酶的N—末端氨基酸殘基序列為QASSGTPATIRVLVV。4、如權利要求1或2所述鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述鐮孢菌纖溶酶的分子量為28,000Da。5、如權利要求1或2所述鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述鐮孢菌纖溶酶的等電點為8.1。6、如權利要求1或2所述鐮孢菌纖溶酶，其特征在于，所述鐮孢菌纖溶酶的纖溶作用可被苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸抑制。7、一種如權利要求1所述鐮孢菌纖溶酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟-A)將菊花莖內生鐮孢菌進行發酵培養；B)從發酵液中分離純化得到鐮孢菌纖溶酶。8、如權利要求7所述鐮孢菌纖溶酶的制備方法，其特征在于，所述步驟B)包括以下步驟C)發酵液中加入硫酸銨分級鹽析，離心收集沉淀；D)溶解沉淀，經微濾收取透出液，再經超濾膜超濾，收取截留液；E)截留液以SephadexG—25柱層析或透析法脫鹽；F)以MonoQ陰離子層析，用NaCl洗脫，收集活性峰的洗脫液，洗脫液經G—25柱層析脫鹽后冷凍干燥，得到鐮孢菌纖溶酶的粗酶；G)所得的鐮孢菌纖溶酶粗酶經Superdex75凝膠層析，收集活性峰，凍干后得到電泳純的鐮孢菌纖溶酶。9、如權利要求l一6中任一項所述鐮孢菌纖溶酶在制備溶栓藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種鐮孢菌纖溶酶及其制備方法，所述鐮孢菌纖溶酶是由菊花莖內生鐮孢菌發酵制備。所述鐮孢菌纖溶酶的N-末端氨基酸殘基序列為QASSGTPATIRVLVV，分子量為28,000Da，等電點為8.1。本發明的鐮孢菌纖溶酶，具有能直接降解纖維蛋白的纖溶活性，有良好的血栓溶解和顯著抑制靜脈血栓形成的作用，并且分子量較小，同時，該酶的生產原材料豐富，生產工藝簡便，成本低廉，能彌補尿激酶等現有臨床藥物在生產和治療方面的不足，因此具有開發價值。文檔編號A61K38/43GK101525611SQ200810034360公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優先權日2008年3月7日發明者斌吳,吳黎誠,夏玉葉,梅戈,天楊,楊志鈞,瑜殷,羅敏玉,金文翔,陳代杰申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司;浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠