一種冬凌草有效組分及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：：一種冬凌草有效組分及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬中藥提取物，具體地說涉及從冬凌草中提取的有效組分，及其制備方法，以及該有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
：腫瘤是一種常見病、多發病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業內對惡性腫瘤的治療主要還是以手術、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在作用于靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優勢和廣闊的應用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現己開發為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因學、發病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用于開發成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。冬凌草又名冰凌草、六月令，得名于冬天全株結滿薄如蟬翼的銀白色冰凌片，植物來源為唇形科香茶菜屬植物碎米椏(Rabdosiarubescens(Hemls.)Hara)，廣布于黃河、長江流域，主產地在河南濟源太行山一帶。河南、安徽、湖北、貴州等地均有產，其中以河南濟源市產最佳。全草含有單萜、倍半萜、二萜等多種萜類化合物以及少量揮發油、生物堿，其中冬凌草素是含量較高的二萜類成分，具有很強的苦味。另外，還從中分離得到了水楊酸和三個黃酮類化合物——胡麻素、線薊素和Pedalitin(李欽，等.冬凌草化學成分、藥理作用及開發研究進展.河南中醫學院.2003，6(18):31-33)。冬凌草味甘苦，性微寒，具清熱解毒、消炎止痛、健胃活血及抗腫瘤之功效。冬凌草對金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、乙型鏈球菌均有小劑量抑菌，大劑量殺菌作用，其中肺炎雙球菌對之最敏感。另外，冬凌草醇提物對大鼠棉球肉芽腫有抑制作用，對小鼠有鎮痛作用(段曉穎.復方冬凌草含片體外抗菌實驗研究.河南中醫藥學刊，1997，12(3):38-40)。研究表明，冬凌草甲素具有抑制腫瘤細胞增值、誘導腫瘤細胞調亡等作用(辛慶鋒，等.冬凌草甲素抗腫瘤作用機制研究進展.醫學綜述.2008，14(3):455-456)。冬凌草甲素還有抗突變作用(楊勝利，張巧.冬凌草甲素抗突變性研究.癌變畸變突變,2001，13(1):8-10.)、3受體拮抗作用(李琦，劉潔.冬凌草甲素對家兔血流動力學的影響及機理研究[J].白求恩醫科大學學報，1994，20(2):128-129.)、抗氧化作用(張予，王筠.冬凌草甲素對活性氧自由基的清除作用.河南醫學研究，1998，8(2):100-104.)。冬凌草多糖在體外高濃度下可以抑制EAC腫瘤細胞的生長，小鼠體內進一步研究發現其能夠抑制S180的生長，且對S180的抑瘤效應呈現出明顯的量效關系。冬凌草多糖對體液免疫和細胞免疫均有增強作用(王一飛，江金花，王慶端,等.冬凌草多糖的抗腫瘤及其免疫增強作用.中國病理生理雜志，2002，18(11):1341—1343.)。本發明的目的是提供一種冬凌草有效組分，該有效組分主要含有化合物A:CoetsoidinF，化合物B:CoetsoidinC，其中化合物A的摩爾百分比含量為7090%，化合物B的摩爾百分比含量為5~20%。優選化合物A的摩爾百分比含量為75~85%，化合物B的摩爾百分比含量為8~15%。化合物A的結構式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>化合物B的結構式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>本發明的另一目的是提供該冬凌草有效組分的制備方法，通過以下步驟實現將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。優選的冬凌草有效組分制備方法，包括下列步驟將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8~1.2小時，提取1~3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。最佳的冬凌草有效組分制備方法，包括下列步驟將冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30%的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。本發明的再一個目的是提供該冬凌草有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應用。本發明的冬凌草有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。本發明的冬凌草有效組分還可以作為活性成分之一，加入其他抗腫瘤藥物，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法制成制劑。所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。本發明的有益效果為1.本發明的提取分離工藝中使用了正相硅膠柱，能有效地除去糖、蛋白質、氨基酸等雜質，提高有效成分的含量，同時采用了制備色譜，能快速準確的得到有效成分。2.本發明提供的冬凌草有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機制，在生產中更易于藥物的質量控制。3.本發明提供的方法首次從冬凌草中得到A、B等幾個成分的組合物，并首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，得到較好的藥理活性。具體實施例方式本發明結合下面實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用于說明本發明而并非對本發明的限制。實施例一冬凌草有效組分的制備將200g冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:0.8)，加熱提取1次得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(53:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經測定，化合物A的含量為70~86%，化合物B的含量為518Q/。。實施例二冬凌草有效組分的制備將500g冬凌草藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:1.2)，加熱回流1.2小時，提取3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經測定，化合物A的含量為75~90%，化合物B的含量為820%。實施例三冬凌草有效組分的制備取冬凌草藥材250g，將其粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合并得提取液。將提取液濃縮成浸膏，將浸膏和硅膠拌樣，用正相硅膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮干燥后得樣品。用制備液相色譜繼續分離得到的樣品。制備色譜的分離條件色譜柱為Agient制備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30°/。的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經制備液相色譜分離，在時間段7.115.5min收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分。經測定，化合物A的含量為7585。/。，化合物B的含量為8~15%。實施例四冬凌草有效組分HPLC-ELSD分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmxl50mm，5pm);采用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mLmin";檢測波長全波長；柱溫30。C。ELSD參數氮氣流速2.0L/min;漂移管溫度105°C。供試品溶液的制備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測定，即得。本發明中，化合物A的結構式為實施例五冬凌草有效組分制劑滴丸的制備，取實施例三的冬凌草有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至68"C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實施例六冬凌草有效組分制劑凍干粉針的制備，取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基p-環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低溫干燥，得降香油和羥丙基3-環糊精的包合物粉末。本發明中，化合物B的結構式為:9除上述降香油合羥丙基p-環糊精的包合物粉末外，再取實施例三的冬凌草提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實施例七冬凌草有效組分制劑注射液的制備，取實施例三的冬凌草有效組分適量用4(TC注射用水溶解，加入適量藥用載體等滲劑，調節溶液的pH值為7.0-8.0，加注射用水至全量，用超濾器超濾除熱源，測定pH值后，用膜過濾，分裝后，高壓滅菌，檢驗、包裝，即得。實施例八冬凌草有效組分制劑膠丸的制備，取實施例三的冬凌草有效組分與花生油按2:18的比例水溶式不銹鋼攪拌灌中，同時加入適量明膠和甘油混合，放出再用膠體磨磨漿，磨出的混合液攪拌，制成藥液；將甘油與蒸餾水在40-5(TC溫度下攪拌混溶，再將甘油液溫至80-90°C，取明膠加入其中混合攪拌，直至全部溶化成膠液，然后在60'C溫度下使膠液靜置4小時，用制板機制成膠板供制丸工序使用；將上述制成的藥液和膠板送入壓丸機制丸，然后在22-25"C溫度下吹風4小時作滾筒定型，又在25-3(TC溫度下吹風干燥16-20小時，檢選合格膠丸，用95%乙醇清洗，在25-30'C下吹風干燥4小時，即得。實施例九冬凌草有效組分制劑片劑的制備，取實施例三的冬凌草有效組分適量與微晶纖維素混合均勻，加3%聚維酮乙醇溶液制軟材，過18目篩制顆粒，6(TC干燥1小時，整粒，加入滑石粉適量，混勻，壓片，即得。實施例十冬凌草有效組分的藥理實驗藥理模型HL60腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%,非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培養HL60細胞，密度需低于1(^個/mL。計算需要細胞總量N產pcell'mL"xVT(p=2xl04個/mL)，其中Vf0.1mLx孔數+細胞槽剩余量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數Nl，則離心管中的細胞數N為Nl/4x10、2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VimL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使VfNT/NxV^在細胞槽中再加入Vt-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100)iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養液作為空白對照，剩余孔加入100)iLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案冬凌草有效組分用DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88^L藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50iaL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設4個平行復孔，每板設空白組(blank,只加培養液，不含細胞)，及陰性對照組(negative,細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200^iL的培養液，將吸取0.88(iLDMSO加入混勻)。SRB染色細胞培養結束后，取出培養板，每孔加入40%(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)100pL固定細胞，室溫放置5min，fC冰箱中放置1h。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100^iL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中干燥后用lOmmol/LTrisl50nL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組難-空白組難xl00%陰性對照組力值一空白組j值藥效結果見表l。根據HL60腫瘤細胞抑制率結果，冬凌草有效組分對抑制HL60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.2藥理模型K562腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培養K562細胞。計算需要細胞總量NT:pcell'mL"xVT(p二8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩余量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取l(^L，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100^iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案冬凌草有效組分加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88(iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。SRB染色細胞培養結束后，取出培養板，每孔加入40%(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)70pL固定細胞，4。C冰箱中放置1h。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100^iL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50!iL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算-抑制率(％)=藥物歸-空白歸x腦陰性對照組/i值一空白組/(值藥效結果見表2。根據K562腫瘤細胞抑制率結果，冬凌草有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.3藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培養MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT-pcell'mL"xVT(p-2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩余量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取l0^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100)iL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案冬凌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入22(VL/孔的培養液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50iaL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4昭/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去除每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液=10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150^iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=,隨-空白歸x腦陰性對照組^值一空白組/4值藥效結果見表3。根據MCF-7腫瘤細胞抑制率結果，冬凌草有效組分對抑制MCF-7腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4藥理模型KB腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養KB細胞。計算需要細胞總量NT-pcell，mL"xVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩余量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10|iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案冬凌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88|iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50^iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去除每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150|iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=難值-空畫x腦陰性對照組^值一空白組^值藥效結果見表4。根據KB腫瘤細胞抑制率結果，冬凌草有效組分對抑制KB腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2.5藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%,非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養HepG2細胞。計算需要細胞總量NT:pcell，mL"xVT(p-2x103個/mL)，其中VT-0.1mLx孔數+細胞槽剩余量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養液作為空白對照，剩余孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案冬凌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88|iL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為5(Vg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200i!L的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿霉素終濃度4嗎/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去除每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100pL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150(^L的DMSO，振蕩10min,550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=,歸-空畫x廳陰性對照組力值一空白組^值藥效結果見表5。根據HepG2腫瘤細胞抑制率結果，冬凌草有效組分對抑制HepG2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表5冬凌草組分陰性空白陽性平均細胞存活數0.070.470.080.09抑制率(％)102.630.00100.0097.69RSD(。/cO4.282.837.364.30權利要求1.一種冬凌草有效組分，其特征是該有效組分主要含有化合物ACoetsoidinF和化合物BCoetsoidinC，其中化合物A的摩爾百分比含量為70～90％，化合物B的摩爾百分比含量為5～20％，化合物A的結構式為化合物B的結構式為2.根據權利要求1所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是通過以下步驟實現將冬凌草藥材粉碎后加入1:0.8~1.2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.81.2小時，提取13次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進行拌樣，用正相硅膠柱對其進行分離，首先用4753:1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用813:1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續分離得到的目的物；制備色譜的分離條件為色譜柱為制備柱，流動相為水和乙化合物B的結構式為:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。3.根據權利要求2所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是所述梯度洗脫程序為0分鐘時，流動相為70%的水溶液和30%的乙腈溶液；40分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根據權利要求2所述的一種冬凌草有效組分的制備方法，其特征是色譜分離后，在7.115.5min時間段收集溶液。5.根據權利要求1所述的一種冬凌草有效組分在制備治療、預防腫瘤藥物中的應用。6.根據權利要求5所述的一種冬凌草有效組分的應用，其特征是所制備的藥物還含有制劑允許的藥物賦形劑或載體。7.根據權利要求5所述的一種冬凌草有效組分的應用，其特征是所述藥物的制劑形式包括液體制劑、固體制劑、膠囊劑或膠丸劑。8.根據權利要求7所述的一種冬凌草有效組分的應用，其特征是所述藥物的給藥方式包括口服給藥或注射給藥。全文摘要本發明提供一種冬凌草有效組分，主要含有化合物ACoetsoidinF和化合物BCoetsoidinC，其中化合物A的含量為70～90％，化合物B的含量為5～20％。藥材通過加熱提取，濃縮，硅膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮干燥，再用液相色譜繼續分離，收集溶液，溶液經濃縮干燥后得到有效組分。本發明提供的冬凌草有效組分可在制備治療、預防腫瘤藥物中的應用。本發明方法設計合理，能快速準確地得到有效成分，在生產中更易于藥物的質量控制。文檔編號A61K31/352GK101317837SQ20081006301公開日2008年12月10日申請日期2008年7月4日優先權日2008年7月4日發明者靂劉,水文波,程翼宇,葛志偉申請人:浙江大學