一種制備冬凌草甲素的方法
【專利摘要】本發明涉及一種天然產物的提純方法，具體來說，本發明涉及一種制備高純度冬凌草甲素的方法及其工藝。采用反相硅膠或反相聚合物樹脂作為DAC制備柱填料，甲醇和水的混合溶劑為流動相的方法分離純化了冬凌草甲素，分離工藝簡單，提取率高，所得產品純度高，無污染，為進一步工業化制備型液相色譜分離純化冬凌草甲素提供了基礎。
【專利說明】一種制備冬凌草甲素的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是動態軸向壓縮柱分離純化冬凌草甲素的方法，具體是采用加熱回流提取、動態軸向壓縮制備柱進行分離純化冬凌草甲素的方法。
【背景技術】
[0002]冬凌草為唇形科植物碎米極[Rabdosiarubescens (Hamst) C.Y.ffu.et Hsuan]的干燥地上部分，主要分布于我國黃河流域及其以南各地區，主產于河南太行山南麓各地。冬凌草具清熱解表消炎止痛健胃活血等功效，在抗腫瘤方面有較強的活性。冬凌草甲素為冬凌草的有效活性成分，它對各種移植性腫瘤細胞具有較大的殺傷、抑制增殖能力，臨床上主要用來治療胃癌、食道癌等癥。冬凌草甲素目前主要從冬凌草植物中分離純化得到，提取方法主要為乙醚提取法、乙醇提取法及中壓柱色譜法等，但這些提取工藝操作周期長，條件不易控制，得到的冬凌草甲素的含量低。
[0003]隨著制藥、生物化工等行業的迅速發展，制備型液相色譜分離技術得到越來越廣泛的開發和應用，已成為分離和純化復雜混合物的重要方法，尤其適用于天然產物的返利。動態軸向壓縮(DAC)法具有多方面的優越性，因而得到了更為深入的研究和發展。動態軸向壓縮柱的核心技術是通過活塞的上下運動來裝柱、維持柱壓和卸柱，簡化了大直徑色譜柱的填卸過程，填裝的色譜柱性能穩定、效率高。DAC柱柱效高，重復性好，填裝所用的時間短，可以采用粒徑更小的填料，減小柱長，增加柱徑，從而減小管壁效應，得到幾乎接近分析柱的柱效。
[0004]本發明采用乙醇加熱回流提取，反相動態軸向壓縮柱制備色譜法分離純化了冬凌草甲素，分離工藝簡單，提取率高，所得產品純度高，無污染，為進一步工業化制備型液相色譜分離純化冬凌草甲素提供了基礎。·
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種從冬凌草中提取并用動態軸向壓縮柱分離純化冬凌草甲素的生產方法，屬于天然產物的提取分離純化領域，包括醇提取、動態軸向壓縮柱分離、濃縮以及成品的純度檢測。
[0006]本發明為實現上述發明目的采用如下步驟:
a、提取:將粉末過60目篩后置于提取器中，95%乙醇為溶劑，80°C水浴回流30min，提取
2-3次，合并提取液，減壓濃縮成稠膏狀；
b、樣品的溶解:a步驟的濃縮物用甲醇與水的混合溶劑溶解，過濾，備用；c、流動相的配制:流動相采用步驟I)的甲醇與水的混合溶劑，甲醇的濃度為40-70%之間；
d、DAC柱分離:用進樣泵向填裝好填料的動態軸向壓縮柱中泵入上述溶解的樣品溶液，再用步驟c配制好的流動相洗脫，收集目標主峰，取樣HPLC檢測；
e、濃縮:將d步驟中收集到的目標組分進行濃縮處理，得到冬凌草甲素純品；
f、成品的純度檢測:泵:NewstyleNP7000型泵；色譜柱(0DS填料4.6*250mm, 5 μ m);檢測器:漢邦紫外檢測器NewStyleNU3000，檢測波長:239nm，檢測溫度:室溫；流動相:甲醇:水=60:40,流速:lmL/min。
【具體實施方式】
[0007]實施方案一
1、提取:將粉末過60目篩后稱取100g置于提取器中，用600mL95%乙醇提取，80°C水浴回流30min，提取2次，合并提取液，減壓濃縮成膏；
2、樣品的溶解:濃縮物用甲醇:水=55:45溶解，濃度為10g/mL，過濾，備用；
3、流動相的配制:流動相為甲醇:水=55:45；
4、DAC柱分離:用進樣泵向填裝好粒徑為20um填料的動態軸向壓縮柱(50*500mm)中泵入樣品溶液，進樣流速為60mL/min,用流動相洗脫,流速為100mL/min,收集目標成分,取樣HPLC檢測；
5、濃縮:將收集到的目標組分進行濃縮處理，得到冬凌草甲素純品，經HPLC檢測純度為 99.2%ο
[0008]實施方案二
1、提取:將粉末過60目篩后稱取150g置于提取器中，用1200mL95%乙醇提取，80°C水浴回流30min，提取3次，合并提取液，減壓濃縮成膏；
2、樣品的溶解:濃縮物用甲醇:水=55:45溶解，濃度為15g/mL，過濾，備用；
3、流動相的配制:流動相為 甲醇:水=55:45；
4、DAC柱分離:用進樣泵向填裝好粒徑為20um填料的動態軸向壓縮柱(50*700mm)中泵入樣品溶液，進樣流速為80mL/min,用流動相洗脫,流速為120mL/min,收集目標成分,取樣HPLC檢測；
5、濃縮:將收集到的目標組分進行濃縮處理，得到冬凌草甲素純品，經HPLC檢測純度為 99.03%。
[0009]實施方案三
1、提取:將粉末過60目篩后稱取200g置于提取器中，用1500mL95%乙醇提取，80°C水浴回流30min，提取3次，合并提取液，減壓濃縮成膏；
2、樣品的溶解:濃縮物用甲醇:水=60:40溶解,濃度為20g/mL，過濾，備用；
3、流動相的配制:流動相為甲醇:水=60:40；
4、DAC柱分離:用進樣泵向填裝好粒徑為30um填料的動態軸向壓縮柱(100*500mm)中泵入樣品溶液，進樣流速為150mL/min,用流動相洗脫,流速為200mL/min,收集目標成分，取樣HPLC檢測；
5、濃縮:將收集到的目標組分進行濃縮處理，得到冬凌草甲素純品，經HPLC檢測純度為 99.35%。
[0010]上述實施實例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發明做出的任何修改和改變，都落入本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種制備冬凌草甲素的方法，包括: a、冬凌草甲素粗品的制備:將冬凌草干草粉末過篩后置于提取器中，95%乙醇為溶劑，80°C水浴回流30min，提取2_3次，合并提取液，減壓濃縮成稠膏狀； b、樣品的溶解:將冬凌草甲素粗品用甲醇與水的混合溶劑溶解，過濾，備用； C、流動相的配制:流動相采用步驟a的甲醇與水的混合溶劑，甲醇的濃度為40-70%之間； d、上柱洗脫:用進樣泵向裝好填料的動態軸向壓縮制備柱中泵入步驟a溶解好的樣品，再用步驟b配制好的流動相洗脫，收集冬凌草甲素，取樣用HPLC檢測純度； e、濃縮:對收集到的目標組分進行濃縮處理，得冬凌草甲素純品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是a步驟中每次回流所用95%乙醇的用量為冬凌草干草粉末的5~10倍量。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于b步驟樣品的濃度在10-30g/mL之間。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于c步驟中采用單針上柱吸附、解析并進行分段收集；或采用多針分批連續方式上柱、解析的連續進樣方式，且對每批解析液進行分段收集。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于采用的動態軸向壓縮柱為50-1000mm各系列不同直徑的制備柱，所述填料為C18和C8，填料粒徑為20-40um。
6.根據權利要求1所述的方法，其`特征在于c步驟樣品溶液的上樣流速為0.02BV/mirT0.10BV/min，洗脫流速為 0.10 BV/mirT0.20BV/min。
7.根據權利要求f6任一項所述的方法，其特征在于重復進行c步驟，直到所得冬凌草甲素HPLC檢測含量達到99%以上。
【文檔編號】C07D493/08GK103788107SQ201210423058
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月30日 優先權日:2012年10月30日
【發明者】張大兵, 張寧, 羅軍俠, 劉玉明, 王亞輝 申請人:江蘇漢邦科技有限公司