胸腺素α1的一種新用途的制作方法

專利名稱：：胸腺素α1的一種新用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及胸腺素al(Thymosinal，Tal)，尤其是涉及胸腺素al的一種新用途。
背景技術：
：胸腺肽的臨床應用始于20世紀70年代中期，其最主要的貢獻是對胸腺依賴性疾病的治療，由于它對于維持原發性免疫缺陷病、自身免疫疾病和癌癥患者的免疫反應性，刺激其特異性淋巴細胞的活性起著主要作用，因此廣泛應用于治療系統性紅斑狼瘡、白塞氏綜合征、類風濕性關節炎、重癥感染、支氣管哮喘、急慢性肝炎和腫瘤等疾病。另外，由于人類的老化明顯地反映胸腺組織的萎縮和功能的衰竭，胸腺肽可以推遲一些老年性疾病的出現，因此應用胸腺肽抗衰老也有著極其廣闊的前景。隨著研究的深入，人們已經將研究重點轉向胸腺素中的單一肽，以期發現更有效的臨床治療藥物。文獻表明，胸腺素a原(prothymosina，ProTa)和Tal是當前胸腺素研究中的熱點。Tal是一種具有熱穩定性的酸性多肽，由28個氨基酸組成，pl值為4.2，相對分子量為3108，且不含有甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸。其氨基酸序列(l、GoldsteinAL，GaraciE.CombinationTherapiess[M].NewYork:springer，.1993:39—48)為NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。Tal具有生物反應調節功能，其主要內容包括(l)Tal可恢復T細胞的功能，并促進成熟T細胞的增殖、細胞因子及其受體的產生，從而增強機體對腫瘤的免疫應答能力；(2)修飾腫瘤細胞，誘導宿主產生強烈的免疫反應；(3)促進腫瘤細胞的分化成熟，使惡性增殖細胞恢復正常化；(4)減輕化療、放療的副作用。胸腺素al是從胸腺第五組分(TF5)中提取并純化具有生物活性的酸性多肽，作為免疫增強劑，可以調節免疫系統的許多環節，包括活化NK細胞、T細胞、單核和巨噬細胞，還可以刺激骨髓造血細胞的增殖分化;其中最主要的是對T細胞分化的調節。現在主要用于治療乙肝、丙肝等感染性疾病，非小細胞肺癌、黑素瘤、肝癌、胃癌等惡性腫瘤，自身免疫性疾病，如類風濕關節炎、重癥無力、系統性紅斑狼瘡等，以及免疫缺陷病的治療。國內外研究(2、RubinLA'，KurmanCC，FriezME，etal.Solubleinterleukinreceptorsarereleasedfromactivatedhumanlymphoidcellinvitro.JImmun，1985，135:3172;3、孫永良.可溶性白細胞介素II受體與感染性疾病.國外醫學流行病學傳染病學冊，1991，18:34)均發現，SIL-2R是一種重要的免疫抑制物質，它的作用類似封閉因子，其水平的增高多伴有NK細胞活性的下降和CD4細胞的減少，并可能反映機體免疫反應下降和病情的嚴重程度。胸腺素是由胸腺上皮細胞合成和分泌的多種生化性質不同的具有激素樣活性的多肽類物質的總稱(4、張符光，劉佃辛.胸腺和胸腺素研究進展.國外醫學免疫學分冊，1996，19:187)。以健康小牛胸腺為原料含胸腺素a等多種活性多肽的胸腺肽注射液，主要作用于T淋巴細胞分化、發育及成熟的各個階段，從而發揮調節細胞免疫功能的作用，同時能增強NK細胞的吞隨能力(5、MuzzioliM'MocchegianiE，BressaniN，etal.InvitrorestorationbythymulinofNkactivityofcellsfromoldmice.IntJI腿unopharmaCol，1992,14:57)。蔡文瑋等(6、蔡文瑋，陸平，朱健.臨床中老年保健，2002，5(2):90-91)和王兆海(7、臨床肺科雜志，2004，9(4):357-358)采用胸腺肽增強糖尿病以及糖尿病合并肺結核患者的細胞免疫功能，取得一定的療效。證明胸腺肽在提高機體免疫功能和調節機體免疫能力方面具有明顯效果。I型糖尿病的重要原因與自身免疫疾病密切相關，其中主要是因為胰島P細胞受到自身免疫細胞的攻擊，造成抗原暴露，引起免疫系統進一步的反應，使得胰島p細胞大量損失，正常胰島素的分泌受到影響，血糖升高，形成糖尿病癥狀。鏈脲佐菌素(STZ)在I型糖尿病模型制備中已經得到廣泛應用，大鼠在50mg/kg—次性注射情況下并可以造模成功，而小鼠則在相同劑量經過5次連續注射后基本達到造模目的。目前認為STZ的作用機理是通過使機體產生過量的NO，攻擊破壞胰島P細胞，引起胰島細胞抗原暴露，激活機體免疫機制，大量巨噬細胞進入胰島細胞從而加劇胰島細胞的損傷，最后造成胰島素分泌減少，引起血糖增高，誘發糖尿病。誘導的小鼠胸腺萎縮，腎臟明顯腫大，并且血清抗氧化能力顯著下降。近年來，糖尿病的病因和發病機理研究表明氧化應激與糖尿病的發生和發展密切相關(8、曹文彬等，抗氧化微量營養素防治糖尿病的研究進展，長春中醫藥大學學報，2006，22(2):73-74)，為了防止糖尿病的發生發展，人們對一些具有防治糖尿病作用的天然抗氧化物進行了系統的研究，發現它們通過表達不同的機制與作用環節打斷氧化侵襲引致胰島P細胞損害的惡性循環，從而為天然抗氧化治療糖尿病提供了一個新的策略。劉仁海等(9、劉仁海，等.轉胸腺素al基因聚球藻抗氧化作用的研究，中國海洋藥物雜志，2002.2:4-7;10、劉仁海，等.口服轉胸腺素al基因聚球藻對小鼠T細胞亞群作用的研究，廈門大學學報(自然科學版)，2003，4:517-520)分別證明了轉胸腺素al基因聚球藻在抗氧化和調節小鼠T細胞亞群方面具有顯著的效果，能夠顯著提高健康小鼠CD3，CD4亞群水平，提高機體CD4/CD8比值。進一步說明胸腺素al是一種有效的免疫增強劑。前胸腺素a原(prothymosin)與胸腺素al具有N端相同的28個肽，其全長是108110個氨4基酸，體內外實驗證明它具有調節平衡免疫功能的作用，能夠使過激的免疫功能下調，避免自身免疫疾病的發生，同時，最近研究(11、Malicet，C.，Dagom，J.C.，Neira，j丄andIovanna，J丄.P8andprothymosinalpha:unityisstrenthe.Cellcycle，2006，5(8):829-830)還表明，ProTct與細胞凋亡因子P8能夠形成復合體，共同起到抑制細胞凋亡，促進細胞分裂的功能。此外，最近研究(12、Mallo，G.V.，Fiedler,F.，Calvo，E丄.，Ortiz,E.M.，Vasseur，etal.cloningandexpressionontheratp8cDNA，anewgenepancreasduringtheacutephaseofpancreatitis,pancreasdevelopment,andregeneration,andwhichpromostescelluarproduction.J.Biol.Chem.1997，272(51):32360-32369)還證明，P8能夠刺激胰島素(3細胞細胞增殖，因此，推測ProTa不僅能夠保護胰島細胞避免自身免疫細胞的攻擊，同時能夠促進胰島細胞的分裂，從而增加胰島素的分泌功能。早在20世紀80年代Tabata，T(13、Tabata，T.，Kinoshita，Y.，Fujin，S.，Hato，F.，etal.pretectionbythymosinfraction5fromstreptozotoeininducediabetesinmice-Cellularandmolecularbiology1989，35(2):121-127)采用從豬的胸腺分離到的肽腺因子進行抵抗STZ誘導的糖尿病的發生，有一定的效果，但所用的是含有多種成分的復合物。
發明內容本發明的目的在于提供胸腺素al的一種新用途。本發明所述的胸腺素cd用于制備糖尿病藥物。通過動物實驗證實，胸腺素al不僅能夠減緩小鼠體重的增加，降低正常小鼠空腹血糖值，明顯增強小鼠的糖耐量作用，而且能夠抵抗STZ誘導小鼠糖尿病的發生；此外對于保護胰島細胞結構和胰島素的分泌水平具有重要作用。本發明所述的胸腺素al可用于維持正常糖代謝，保護胰島細胞結構和功能；通過口服胸腺素al的方法，還能夠明顯減緩體重增加的功效，因此胸腺素al可在制備預防糖尿病發生和治療糖尿病的藥物和臨床上應用。采用日達仙(意大利，賽百勝產品，1.6mg/瓶)為實驗材料，選擇昆明小鼠和C57BL/6為實驗動物，通過口服和皮下注射兩種途徑給藥，可驗證胸腺素al的上述生理功能。本發明所述的胸腺素al的一種新用途的實驗方法包括以下步驟1)通過口服和皮下注射兩個途徑將胸腺素al按10ng/只劑量給藥；2)每隔5天稱小鼠體重；3)14天后測小鼠空腹血糖及進行糖耐量實驗；4)口服給藥的小鼠一部分捕殺，剝取小鼠體內脂肪(腎周脂肪和生殖器脂肪)，稱重。計算總脂肪重量(等于腎周脂肪重量和生殖器脂肪重量之和)和脂/體比值[等于(總脂肪重量/體重xl00);5)口服給藥的小鼠另一部分，一次性腹腔注射STZ，按100mg/kg劑量，自注射后，每10天測血糖一次；6)預先皮下注射胸腺素al，14天后，小鼠經腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg劑量，連續4天，自注射STZ后，每510天測血糖。30天后取血分離血清，采用胰島素檢測試劑盒檢測血清胰島素水平；7)胸腺素al皮下注射的同時，小鼠經腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg劑量，連續4天，自注射STZ后，每510天測血糖。通過動物體內實驗，證明胸腺素al具有很好的抵抗STZ誘導的糖尿病的發生，表現出很好的抵抗糖尿病誘發因素的影響，并且在具備增強糖耐量作用的功能。此外，經過口服發現，胸腺素al能夠，明顯減緩體重增加速度的功效，通過解剖檢査發現，其體內腎周脂肪重量和生殖器脂肪重量明顯比對照組低，證明該蛋白在減少肥胖，抵抗糖尿病的發生中具有重要保護作用，為今后開發糖尿病基因工程潛在藥物奠定基礎。圖l為口服胸腺素al對小鼠體重的影響。在圖1中，橫坐標為口服藥后天數(d)，縱坐標為小鼠體重(g);—令一為對照組，一國一為胸腺素al組。圖2為口服胸腺素al(10d)抵抗STZ誘導糖尿病小鼠效果。在圖2中，橫坐標為注射STZ后天數(d)，縱坐標為血糖值(mmol/L);—令一為對照組，一畫一為胸腺素al組；與對照組相比，PO.05,差異顯著；與對照組相比，P<0.01，差異極顯著。圖3為皮下注射胸腺素al對增強小鼠糖耐量作用的效果。在圖3中，橫坐標分別為l:對照組，2:胸腺素al組，縱坐標為曲線下面積。圖4為皮下胸腺素al(預先注射14天)對小鼠抵抗STZ誘導糖尿病的作用。在圖4中，橫坐標為注射鏈脲佐菌素(STZ)后天數(d)，縱坐標為血糖值(mmol/L);—命一為擰檬酸組，一B—為胸腺素al組。圖5為胸腺素al對血清胰島素水平的影響。在圖5中，橫坐標為Tal,control,縱坐標為Pg/mL;與對照組相比，PO.01差異極顯著。圖6為皮下胸腺素al對小鼠抵抗STZ誘導糖尿病的作用(胸腺素al與STZ同時注射)。在圖6中，橫坐標為天數(d)，縱坐標為血糖值(mmol/L);—命一為檸檬酸組，一■—為胸腺素al組。具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。實施例所采用的材料與方法說明如下。1.實驗取材和主要生物試劑試驗動物為C57BL/6小鼠，(20土2)g,6-7周齡，雄性，SPF級，小鼠60只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號SCXK(滬)200320003。單籠喂養，室溫1825°C，相對溫度50%80%，每日光照12h，自由攝食、飲水。鏈脲佐菌素(streptozotocinSTZ，SIGMA.USA)，批號0S3K1569;擰檬酸(成都鴻鶴化工試劑廠)，批號:20040821。胰島素試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。血糖檢測儀為強生公司Llifscan產品及配套檢測試紙。2.將40只小鼠平均分為2組，每組20只，l組口服途徑喂詞胸腺素cd,—組以相同體積生理鹽水作為對照組。連續10天，期間每5天稱體重一次，口服胸腺素al對小鼠體重的影響結果見表l和圖l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>~*:與對照組相比，P<0.05，差異顯著；**:與對照組相比，PO.01差異極顯著第5d、10d測空腹血糖。連續口服胸腺素al5d,10d后小鼠空腹血糖值結果見表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:與對照組相比，PO.05第20天實驗后，各組分別取10只，剝取小鼠體內脂肪(腎周脂肪和生殖器脂肪)，稱重。計算總脂肪重量(等于腎周脂肪重量和生殖器脂肪重量之和)和脂/體比值[等于(總脂肪重量/體重x100)。口服胸腺素al對小鼠脂肪重量的影響結果見表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**:與對照組相比，P<O.01差異極顯著.剩余實驗組小鼠一次性腹腔注射STZ，按100mg/kg劑量，自注射后，每10天測血糖一次。對照組給予相同體積的檸檬酸緩沖液。檢測步驟同實驗組。口服胸腺素al(10d)抵抗STZ誘導糖尿病小鼠效果結果見表4和圖2。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:與對照組相比，P<0.05，差異顯著；**:與對照組相比，PO.01差異極顯著3.將20只小鼠平均分為2組，每組10只，l組皮下途徑給胸腺素al，一組以相同體積檸檬酸緩沖液作為對照組。連續14天，期間每5天稱體重一次，第14天進行糖耐量實驗，而后連續腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg劑量，連續4天，自注射STZ后，每5-10天測體重和血糖，測5次。皮下注射胸腺素al(連續14天)對增強小鼠糖耐量作用的結果見表5和圖3，皮下胸腺素al(預先注射14天)對小鼠抵抗STZ誘導糖尿病的作用見表6和圖4。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:與對照組相比，P<0.05,差異顯著；**:與對照組相比，PO.01差異極顯著30天后眼眶取血，分離血清，置一20。C冰箱，采用ELISA方法檢測其中胰島素水平，胸腺素al對血清胰島素水平的影響結果見圖5。'4.將20只小鼠平均分為2組，每組10只，l組皮下途徑給胸腺素al，一組以相同體積檸檬酸緩沖液作為對照組。給藥的同時腹腔注射STZ，每天一次，按50mg/kg劑量，連續4天，自注射STZ后，每5天測體重和血糖，領!I5次。皮下注射胸腺素al對小鼠抵抗STZ誘導糖尿病的作用(Tal與STZ同時注射)結果見表7和圖6。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*:與對照組3fi比，PO.05,差異顯著；**:與對照組相比，PO.01差異極顯著糖耐量實驗按以下公式計算AUC=0.25x(BSvalueat0hour+4xBSvalueat0.5hours+3xBSvalueat2hours)。本實驗所有數據通過SPSS(version13.0，SPSSInc.)軟件進行分析處理。胸腺素al是ProTaN端前28個肽，研究表明它具備同樣的生物活性。胸腺5肽作為胸腺素的有效成分也表現出與其他胸腺因子類似的調節血糖和保護胰島的功能，因此，本發明證明胸腺素al在糖尿病的預防和治療方面的功能具有科學的理論依據。權利要求1.胸腺素α1用于制備糖尿病藥物。全文摘要胸腺素α1的一種新用途，涉及胸腺素α1。提供胸腺素α1的一種新用途。所述的胸腺素α1用于制備糖尿病藥物。通過動物實驗證實，胸腺素α1不僅能夠減緩小鼠體重的增加，降低正常小鼠空腹血糖值，明顯增強小鼠的糖耐量作用，而且能夠抵抗STZ誘導小鼠糖尿病的發生；此外對于保護胰島細胞結構和胰島素的分泌水平具有重要作用。本發明所述的胸腺素α1可用于維持正常糖代謝，保護胰島細胞結構和功能；通過口服胸腺素α1的方法，還能夠明顯減緩體重增加的功效，因此胸腺素α1可在制備預防糖尿病發生和治療糖尿病的藥物和臨床上應用。文檔編號A61P3/10GK101361962SQ20081007191公開日2009年2月11日申請日期2008年10月7日優先權日2008年10月7日發明者劉升發,吳漢州,周克夫,王世媛,偉韓申請人:廈門大學;廈門伯賽基因轉錄技術有限公司