專利名稱：：半胱氨酸改造的抗muc16抗體和抗體藥物偶聯物的制作方法
技術領域：
：本發明一般涉及用反應性半胱氨酸殘基改造的抗體，且更具體地說，本發明涉及具有治療或診斷應用的抗體。可以使半胱氨酸改造的抗體與化療藥；毒素；親和配體，諸如生物素和4全測標記，諸如焚光團偶聯。本發明還涉及使用抗體和抗體-藥物偶聯物化合物在體外、原位和體內診斷或治療哺乳動物細胞或相關病理性情況的方法。
背景技術：
：已經為靶向治療患有癌癥、免疫學和血管生成性病癥的患者建立了抗體療法。已經將與正常的非癌性細胞相比在癌細胞的表面上特異性表達的跨膜的或別樣的腫瘤相關多肽鑒定為癌癥診斷和抗體療法的細胞靶物。此類腫瘤相關細胞表面抗原多肽，即腫瘤相關抗原(TAA)的鑒定容許特異性靶向癌細胞以便通過基于抗體的療法實現破壞作用。抗體-藥物偶聯物(ADC)即免疫偶聯物在局部遞送細胞毒劑或細月包抑制劑即在癌癥治療中殺死或抑制腫瘤細胞的藥物中的應用(Lambert，J.(2005)Curr.OpinioninPharmacology5:543-549;Wuetal(2005)NatureBiotechnology23(9):1137-1146;Payne,G.(2003)CancerCell3:207-212;Polakis,RArmingantibodiesforcancertherapy.CurrOpinPharmacol5，382-387,2005;SyrigosandEpenetos(1999)AnticancerResearch19:605-614;Niculescu-D歸zandSpringer(1997)Adv.DrugDel.Rev.26:151-172;US4975278)容許將藥物模塊靶向遞送至腫瘤，并在其中發生胞內蓄積，其中系統施用這些未偶聯的藥劑在對試圖消除的腫瘤細胞之外也對正常細胞產生了不可接受水平的毒性(Baldwinetal(1986)Lancetpp.(Mar.15,1986):603-05;Thorpe,(1985)"AntibodyCarriersOfCytotoxicAgentsInCancerTherapy:AReview",于MonoclonalAntibodies'84:BiologicalAndClinicalApplications,A.Pincheraetal(編)，pp.4乃-506)。改進ADC的治療指數(即最高的功效與最低的毒性)的努力已經聚焦于多克隆(Rowlandetal(1986)CancerImmunol.Immunother.，21:183-87)和單克隆抗體(mAb)的選擇性以及藥物連接和藥物釋方文特性(Lambert，J.(2005)Curr.OpinioninPharmacology5:543-549)。抗體藥物偶聯物中所使用的藥物模塊包括細菌蛋白質毒素諸如白喉毒素，植物蛋白質毒素諸如蓖麻毒蛋白，小分子諸如auristatin、格爾德霉素(geldanamycin)(Mandleretal(2000)J.oftheNat.CancerInst.92(19):1573-1581;Mandleretal(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters10:1025-1028;Mandleretal(2002)BioconjugateChem.13:786-791)、美登木素生物石咸(EP1391213;Liuetal(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623)、力口矛J車審素(Lodeetal(1998)CancerRes.58:2928;Hinmanetal(1993)CancerRes.53:3336-3342)、柔紅霉素、多柔比星、曱氨蝶呤、和長春地辛(Rowlandetal(1986)supra)。藥物模塊可實行影響細胞毒性和細胞抑制性機制，包括微管蛋白結合、DNA結合、或拓樸異構酶抑制。有些細胞毒性藥物在偶聯至大的抗體或蛋白質受體配體時趨向于失活或活性降低。已經一夸auristatin月太，auristatinE(AE)和monomethylauristatin(MMAE),多拉司他汀的合成類似物(WO02/088172)作為藥物才莫塊偶聯至多種抗體(Klussman，etal(2004),BioconjugateChemistry15(4):765-773;Doroninaetal(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784;Franciscoetal(2003)Blood102(4):1458-1465;US2004/0018194;WO04/032828;Maoetal(2004)CancerResearch64(3):781-788;Bhaskaretal(2003)CancerRes.63:6387-6394;WO03/043583;US5767237;US6124431;US2005/0238649)。以常規手段(即經由共價鍵的連接)將藥物模塊附著至抗體一般產生不均一的分子混合物，其中藥物模塊附著于抗體上的許多位點。例如，通常經由抗體的通常大量的賴氨酸殘基或通過還原鏈間二硫鍵活化的半胱氨酸疏氫基(硫醇基)將細胞毒性藥物偶聯至抗體，產生不均一的抗體-藥物偶聯物混合物，其含有具有不同的藥物對抗體摩爾比、在不同位點連接的多個種類，每種具有不同的藥動學、功效、和安全性的體內譜(Hambletteta1(2004)12Clin.CancerRes.10:7063-7070;Wangetal(2005)ProteinSci.14:2436-2446)。取決于反應條件，所述不均一的混合物通常含有附著有0個到約8個或更多個藥物模塊的抗體的分布。此外，具有藥物模塊對抗體的特定整數比的偶聯物各亞組是可能的不均一的混合物，其中藥物模塊附著于抗體上的各種位點。分析和制備方法可能不足以分離和表征由偶聯反應產生的不均一混合物中的抗體—藥物偶聯物種類分子。抗體是較大的、復雜的且結構多樣的生物分子，常常帶有許多反應性官能團。它們與接頭試劑和藥物-接頭中間體的反應性取決于諸如pH、濃度、鹽濃度、和共溶劑等因素。此外，多步驟偶聯過程因控制反應條件和表征反應物和中間體方面的困難而可能不可再現。半胱氨酸硫醇基在中性pH具有反應性，這與在接近pH7時質子化和親核性降低的大多數胺不同。由于游離硫醇基(RSH,硫氬基)相對具有反應性，所以帶有半胱氨酸殘基的蛋白質常常以它們作為二硫化物連接的寡聚體的氧化形式存在或具有內部橋接的二硫化物基團。胞外蛋白一般不具有游離疏酉孚基(Garman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London,p.55)。抗體半胱氨酸硫醇基一般對親電子偶聯試劑比對抗體胺或羥基更具反應性，即更具親核性。溶劑可及鏈間二硫鍵半胱氨酸及絲氨酸容許直接偶聯至剩余的半胱氨酸(McDonaghetal(2006)ProteinEng.Des.Sel.19:299-307)。然而，消除這些二石克4建會石皮壞抗體的四級結構，由此擾亂抗體在體內的行為，包括抗體效應器功能的改變(Michaelsenetal(1994)ProcNatlAcadSciUSA91:9243-9247;Romansetal(1977)ProcNatlAcadSciUSA74:2531-2535;Seeganetal(1979)ProcNatlAcadSciUSA76:卯7-911)。已經通過遺傳工程技術將半胱氨酸殘基引入蛋白質以形成與配體的共價附著物或形成新的分子內二硫鍵(Betteretal(1994)J.Biol.Chem.13:9644-9650;Bernhardetal(1994)BioconjugateChem.5:126-132;Greenwoodetal(1994)TherapeuticImmunology1:247-255;Tuetal(1999)Proc.Natl.Acad.SciUSA96:4862-4867;Kannoetal(2000)J.ofBiotechnology,76:207-214;Chmuraetal(2001)Proc.Nat.Acad.Sci.USA98(15):8480-8484;US6248564)。然而，通過將蛋白質的各個氨基酸殘基突變成半胱氨酸氨基酸進行的半胱氨酸硫醇基改造可能存在問題，特別是就未配對的(游離的Cys)殘基或那些相對易于反應或氧化的殘基而言。在蛋白質的濃縮溶液中，無論是在大腸桿菌的周質中，在培養物上清液中，或者是在部分或完全純化的蛋13白質中，蛋白質表面上的未配對的Cys殘基能配對并氧化以形成分子內二硫化物和由此的蛋白質二聚體或多聚體。二硫化物二聚體的形成使得新的Cys沒有與藥物、配體、或其它標記物偶聯的反應性。此外，如果蛋白質以氧化方式在新改造的Cys與已存在的Cys殘基之間形成分子內二斬u鍵，那么這兩個Cys硫醇基對活性位點的參與和相互作用而言都是不可利用的。此外，可以通過錯誤折疊或喪失三級結構使蛋白質失去活性或特異性(Zhangetal(2002)Anal.Biochem.311:1-9)。已經將半胱氨酸改造的抗體設計成Fab抗體片段(thioFab)并表達成全長IgG單克隆(thioMab)抗體(US2007/0092940,通過述及收入其內容)。已經通過接頭在新引入的半胱氨酸硫醇基處用硫醇反應性接頭試劑或藥物-接頭試劑偶聯ThioFab和ThioMab抗體以制備抗體藥物偶聯物(ThioADC)。MUC16是一種肺瘤相關抗原多肽，由人眼表面上皮表達(Arguesoetal(2003)InvestigativeOphthalmology&VisualScience44(6):2487-95),在.支氣管、輸卯管、和子宮的粘膜中表達(Kabawatetal.(1983)InternationalJournalofGynecologicalPathology2:275-85)。有人提出，MUC16的一種功能是在粘膜表面提供針對顆粒和傳染劑的保護性的、潤滑的屏障。高度多態性的MUC16由三個結構域構成，即富含Ser/Thr的N端結構域、重復結構域(ll個到超過60個部分保守的串聯重復，每個平均156個氨基酸)、和C端不重復結構域(其含有跨膜序列和短的胞質尾)。MUC16是高度0-糖基化和N-糖基化的(O'Brienetal(2002)TumourBiol.23:154-169;O'Brienetal(2001)TumourBiol.22:348-366(2001);Fendricketal(1997)TumourBiol.18:278-289;Wongetai(2003)J.Biol.Chem.278:28619-28634;McLemoreetal(2005)biol.Res.Nurs.6:262-267)。自MUC16基因表達的、編碼MUC16多肽的mRNA,在某些類型的人癌性卵巢、乳腺和胰腺腫瘤中，分別與相應的正常人卵巢、乳腺和胰腺組織相比，有顯著的、可再現的和可檢測的過表達(WO2007/001851)。定量分析MUC16表達的多份獨立的和不同類型的癌性人卵巢組織樣品顯示了癌性樣品中MUC16的表達水平是可變的，其中顯著數目的癌性樣品顯示MUC16表達與所分析的正常卵巢組織樣品組的MUC16表達水平均值相比升高至少6倍(至高達大約580倍)。特別地，與正常卵巢組織相比，對多種卯巢癌類型；子宮內膜樣腺癌、漿液性嚢腺癌，包括乳頭狀和透明細胞腺癌，觀察到可檢測的和可再現的MUC16過表達。由于它在某些人腫瘤中過表達，MUC16多肽及編碼該多肽的核酸成為各種哺乳動物組織樣品間定量和定性比較的靶物。可以對MUC16多肽的獨特表達語及編碼該多肽的核酸開發哺乳動物中某些類型的癌性腫瘤的診斷和治療性處理。CA125(癌抗原125(0772P,CA-0772P，CA-125)是由MUC16基因編碼的胞外脫落蛋白(Yinetal(2002)Intl.J.ofCancer98(5):737-740)，而且是例行用于監測卯巢癌患者的血清標志物。CA125是一種苗勒管分化抗原，在上皮卵巢癌細胞中過表達并分泌到血液中，但是它的表達并不完全局限于卵巢癌(Bastetal(1981)J,Clin.Invest68:1331-1337)。血清CA125水平在大約800/0的上皮卵巢癌(EOC)患者中，但在少于l。/。的健康女性中升高(Bastetal.(1983)N.Engi.J.Med.309:883-887)。CA125是存在于腫瘤細胞的細胞表面上的巨型粘蛋白樣糖蛋白，與結合P-半乳糖苷的細胞表面凝集素結合，所述凝集素是參與調控細胞粘附、凋亡、細胞增殖和腫瘤進展的胞外基質的成分(Seele腿eyeretal(2003)JournalofCellScience116(7):1305-1318)。CA125的高血清濃度在漿液性卵巢腺癌中是典型的，而在粘質(mucinous)卵巢癌中不升高。不推薦將CA125用于卵巢癌篩選，因為正常水平不排除腫瘤。然而，CA125檢測是在具有經組織學證實的惡性腫瘤的患者中監測臨床進程和疾病狀態的標準工具。眾多研究證實了CA125水平在監測EOC患者進展中(Bastetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:179-187;Verheijenetal(1999)Sem.CancerBiol.9:117-124;Menonetal(2000)Curr.Opin.Obstet.Gynecol.12:39-42;Meyeretal(2000)Br.J.Cancer82:1535-1538),和作為癌癥血清標志物的有用性。CA125水平的升高通常比臨床檢測早大約3個月。在化療期間，血清CA125水平的變化與疾病進程有關。在新藥物的試驗中，使用CA125作為臨床響應的代用標志物。另一方面，CA125在EOC的初始診斷中沒有用，因為它在許多良性疾患中升高(Bastetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:179-187;Medenetal(1998)Int.J.Biol.Markers13:231-237)。CA125特異性抗體MAb-B43.13(oregovomab，OvaRexMAb-B43.13)作為卵巢癌患者的免疫治療劑，正在進^亍)降床i式馬全(Mobusetal(2003)AmericanJournalofObstetricsandGynecology189(1):28-36;Ehenetal(2005)Internationaljournalofgynecologicalcancer15(6):1023-34)。某些抗MUC16抗體，包括3A5和11D10，已經披露于WO2007/001851;美國流水號11/452，990,2006年6月14日提交，Dennis等，"CompositionsandMethodsfortheDiagnosisandTreatmentofTumor",通過述及而4欠錄其內容。3A5單克隆抗體結合MUC16多肽的多個位點，根據OVCAR-3Scatchard分析，親和力為433pM。已經將3A5和llD10抗MUC16抗體偶聯至auristatin藥物模塊MMAE和MMAF。這些偶聯物在體外抑制腫瘤細胞增殖(WO2007/001851)。將11D10抗MUC16抗體偶聯至美登木素生物堿類DM1藥物模塊(US2005/0276812)。已經將某些抗MUC16抗體變體進行半胱氨酸改造(通過引入半胱氨酸氨基酸單元來進行)并偶聯至DM1(US2007/0092940，通過述及而收錄其內容)。發明概述在一個方面，本發明包括半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列。該半胱氨酸改造的抗MUC16抗體結合MUC16多肽。可制備腫瘤相關抗原(TAA)諸如0772P(CA125,MUC16)多肽，用于使用本領域公知的和例如WO2007/001851中的方法和信息來生成半胱氨酸改造的抗體。該半胱氨酸改造的抗MUC16抗體可通過如下方法來制備，包括用半胱氨酸替換親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸殘基。該半胱氨酸改造的抗MUC16抗體的一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸殘基位于輕鏈或重鏈中。在一個方面，本發明包括測定懷疑含有MUC16蛋白的樣品中測定所述蛋白質的存在的方法，所述方法包括以下步驟將所述樣品暴露于半胱氨酸改造的抗MUC16抗體；并測定所述抗體對所述樣品中所述MUC16蛋白的結合，其中所述抗體對所述蛋白質的結合指示所述樣品中存在所述蛋白質。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體可作為棵抗體(未偶耳關至藥物或標記物沖莫塊)或作為抗體-藥物偶聯物(ADC)使用。可將該半胱氨酸改造的抗MUC16抗體共價附著至auristatin藥物模塊，由此抗體藥物偶聯物得以形成。該抗體-藥物偶聯物可包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)和auristatin藥物模塊(D),其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是經由一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p為l、2、3、或4。Auristatin藥物模塊包括MMAE和MMAF。本發明的另一個方面是抗體-藥物偶聯物化合物的混合物，所述抗體-藥物偶聯物化合物包含結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸、選自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin藥物模塊(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab),其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是經由一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L畫D)pI其中p為l、2、3、或4，且平均藥物栽荷為l-2。Auristatin藥物模塊包括MMAE和MMAF。本發明的一個方面是用于檢測癌細胞的測定法，包括(a)將細胞暴露于半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物；并(b)測定所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物化合物結合所述細胞的程度。本發明的一個方面是藥物配制劑，其包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。本發明的一個方面是抑制細胞增殖的方法，包括用半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物化合物處理細胞培養培養基中的哺乳動物腫瘤細胞，由此所述胂瘤細胞的增殖受到抑制。本發明的一個方面是治療癌癥的方法，包括對患者施用藥物配制劑。可以半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物化合物組合地給患者施用化療劑。本發明的一個方面是制品，其包括藥物配制劑、容器、和包裝插頁或標簽，該包裝插頁或標簽指明所述化合物可用于治療以MUC16多肽過表達為特^正的癌癥。本發明的一個方面是用于制備式I抗體藥物偶聯物化合物的方法，包括以下步驟(a)使半胱氨酸改造的抗體的改造的半胱氨酸基團與接頭試劑反應以形成抗體-接頭中間體Ab-L;并(b)使Ab-L與活化的藥物模塊D反應；由此抗體-藥物偶聯物化合物得以形成；或者包括以下步驟(c)使藥物模塊的親核基團與接頭試劑反應以形成藥物-接頭中間體D-L;并(d)使D-L與半胱氨酸改造的抗體的改造的半胱氨酸基團反應；由此抗體-藥物偶聯物化合物附圖簡述圖1顯示了人源化半胱氨酸改造的抗MUC16抗體A117Cthiohu3A5的重鏈序列SEQIDNO:1和輕鏈序列SEQIDNO:2。圖2顯示了嵌合半胱氨酸改造的抗MUC16抗體A117Cthioch3A5的重鏈序列SEQIDNO:3和輕鏈序列SEQIDNO:4。圖3顯示了人源化曲妥單抗(trastuzumab)輕鏈(HuTMAb-LC，SEQIDNO:5)、人源化標準3A5抗MUC16輕鏈(Hu3A5-LC,SEQIDNO:2)、和嵌合標準3A5抗MUC16輕鏈(Ch3A5-LC,SEQIDNO:4)序列的比對。編號方式遵循順序編號》見則。圖4顯示了人源化曲妥單抗重鏈(HuTMAb-HC,SEQIDNO:6)、人源化標準3A5抗MUC16重鏈(Hu3A5-HC,SEQIDNO:7)、和嵌合標準3A5抗MUC16重鏈(Ch3A5-HC,SEQIDNO:8)序列的比對。編號方式遵循順序編號規則。圖5顯示了半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物(ADC)的繪圖，其中藥物模塊附著至輕鏈(LC-ADC;重鏈(HC-ADC);和Fc區(Fc-ADC)中的改造的半胱氨酸基團。圖6a顯示了以下步驟(i)還原半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(ThioMab)中的半胱氨酸二硫化物加合物(adduct)及鏈間和鏈內二硫化物；(ii)部分氧化，即再氧化以重新形成鏈間和鏈內二硫化物；并(iii)偶聯再氧化的抗體與藥物—接頭中間體以形成半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物(ADC)。圖6b顯示了還原的抗體的再氧化的時間過程。將曲妥單抗還原并在陽離子交換柱上于pH5.5純化。頂圖a顯示了還原的抗體在時間為O分鐘時的反相圖譜。保留時間7分鐘處的三個峰(從左到右)為輕鏈(LC),重鏈(HC)和少量未完全還原的HC+LC。容許純化的、還原的抗體在pH7再氧化，并采集等分試樣，作為時間的函數。中圖b顯示了在90分鐘內大部分輕鏈和重鏈被再氧化以形成含有2條LC和2條HC的完整抗體(大約保留時間10分鐘峰)。在180分鐘反應時間點沒有看到另外的完整抗體形成(底圖c)。圖7a顯示了偶聯反應產物的兩幅HIC(疏水相互作用層析)層析圖(頂)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，3.1平均MMAE/3A5;和(底)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.5平均MMAE/3A5，其中stdch3A5是稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。將樣品注射到丁基HICNPR柱上并以0.8ml/min用0至70。/。B的線性梯度洗脫(緩沖液A:含1.5M硫酸銨的50mM磷酸鉀pH7，緩沖液B:50mM磷酸鉀pH7,20%異丙醇)。使用配備有多波長檢測儀和Chemstation軟件的AgilentIIOO系列HPLC系統來解析和定量抗體中的抗體種類。基于LC/MS分析來指派峰身份。為相應的峰指明了DAR值。圖7b顯示了圖7a中分析條件下大規模thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE偶聯反應的HIC(疏水相互作用層析)層析圖，其中平均藥物載荷值為1.9。圖8a顯示了還原和去糖基化后偶聯反應產物的質譜分析(頂)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE;和(底)thioch3A5畫MC-vc-PAB畫MMAE。圖8b顯示了抗體中用于細胞毒性藥物附著至TDC-Fab的區域的定位作圖。頂圖(a)顯示了MC-vc-PAB-MMAE-偶聯Fab的還原的、變性的輕鏈和重鏈部分的280nm吸光譜。中圖(b)部分中輕鏈和底圖(c)部分中重鏈的解巻積質量(deconvolutedmass)與只在重鏈上標記的藥物一致。在(c)中觀察到的質量24189源自MMAE-C02的損失(減去762道爾頓)，這是該藥物的特征性碎裂。圖8c顯示了肽作圖-TDC-Fab中含有細胞毒性藥物的肽的鑒定。未偶聯的(頂圖a)和已偶聯的(中圖b)Thio-3A5和TDC的肽圖是自馬來酰亞氨基化的純化的Fab的胰蛋白酶消化物生成的。用MC-vc-PAB-MMAE標記的肽具有升高的疏水性，而且預期在層析圖中較晚洗脫。四種藥物偶聯肽(用*標記的)在梯度結束時洗脫。它們還能通過在所有含有MC-vc-PAB-MMAE的質i普中觀察到的特征性內部來源的石爭裂離子(in-sourcefragmentationion)(m/z718.5)而被鑒定為含有細胞毒性藥物的肽。底圖(c)顯示了自未偶聯的和已偶聯的消化物提取的離子層析圖的覆蓋圖。最強的峰與偶聯物消化物的晚洗脫峰一致。所有四個峰被鑒定為位于Fab-HC中第114位中突變的半胱氨酸附近的完全或部分胰蛋白酶切割片段。29.05分鐘處主峰中的m/z離子解巻積而得出質量3962道爾頓，這是肽1":99-120+l藥物的預期質量。含有藥物的肽質沒有定位至該蛋白質的任何其它區域。頂圖(a)中用箭頭標記的峰是馬來酰亞胺標記的肽HC99-120。圖9匯總了通過標準人源化3A5-VC-MMAE偶聯物(stdhu3A5-VC-MMAE)和兩種相應的thio偶聯物(thiohu3A5-VC-MMAE)制備物的串聯液相層析和質語(LC-MS)分析檢測到的主要種類。在還原性條件("還原(DTT)")下(用以破壞鏈間二硫4建)和在天然條件下("完整的")分析蛋白19質。圖IO顯示了體外細胞增殖測定法的結果圖，其中表達(PC3/MUC16)和不表達(PC3親本)MUC16的腫瘤細胞用不同濃度(O.l至lOOOOngADC每ml)的以下各項處理(A)stdhu3A5(v4b.52)-MC-vc-PAB-MMAE，3.5MMAE/Ab加載，PC3/MUC16;(B)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.9MMAE/Ab加載，PC3/MUC16;(C)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.60MMAE/Ab加載，PC3/MUC16;(D)stdhu3A5(v4b.52)畫MC-vc-PAB-MMAE,3.5MMAE/Ab加載，PC3親本；(E)thiohu3A5-MC畫vc-PAB-MMAE,1.9MMAE/Ab加載，PC3親本；和(F)thiohu3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.60MMAE/Ab加載，PC3親本。來自接受沒有ADC的培養基的細胞的數據以0.46ng/mL繪圖。stdch3A5是稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。圖11顯示了體外細胞增殖測定法的結果圖，其中腫瘤細胞用不同濃度(1.4至9000ngADC每ml)的以下各項處理(A)stdch3A5-MC-vc-PAB陽MMAE,3.1MMAE/Ab加載，PC3/MUC16細胞；(B)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.6MMAE/Ab加載，PC3/MUC16細胞(C)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.1MMAE/Ab力口載，PC3/neo細胞；(D)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.6MMAE/Ab力口載，PC3/neo細胞；(E)stdch3A5-MC-VC-PAB-MMAE,3.1MMAE/Ab加載，OVCAR-3細胞；(F)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE，1.6MMAE/Ab加載，OVCAR-3細胞。stdch3A5是稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而thioch3A5是半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。來自接受沒有ADC的培養基的細胞的數據以0.46ng/mL繪圖。圖12顯示了在大鼠中單次施用0.5mg/kgthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE和stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE后血漿清除隨時間的藥動學圖，通過總抗體和ADC測量。圖13顯示了ch3A5-VC-MMAE和thiach3A5-VC-MMAE在細胞毒性藥物的1934ug/m"暴露時在大鼠中的毒性，通過嗜中性粒細胞(左上)、血清AST(右上)、和血小板(右下)測量。圖14顯示了服用以下各項的大鼠(6只/組)的體重隨時間的變化媒介(琥珀酸鹽i爰沖液)；24.19mg/kg=1934ug/m2ch3A5-VC-MMAE;49.99mg/kg=1934ug/m2thioch3A5-VC-MMAE。圖15顯示了服用以下單劑后具有OVCAR-3乳房脂肪墊腫瘤的SCID米色小鼠中體內腫瘤體積均值隨時間的變化媒介(10mL/kg琥珀酸鹽緩沖液)；6mg/kg=328jng/m2stdhu3A5隱MC-vc-PAB誦MMAE,3.5MMAE/Ab加載；或6mg/kg=150pg/m2thiohu3A5-MC畫vc-PAB-MMAE,1.6MMAE/Ab加載。圖16顯示了服用以下單劑后具有OVCAR-3乳房脂肪墊腫瘤的SCID米色小鼠中體內腫瘤體積均值隨時間的變化A)媒介(PBS);B)ADC緩沖液；C)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,1.5mg/kg;D)stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.0mg/kg;E)stdch3A5-MC畫vc-PAB-MMAE,6.0mg/kg;F)thioch3A5-MC陽vc-PAB-MMAE，1.5mg/kg;G)thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE,3.0mg/kg;H)thioch3A5-MC-vc-PAB匿MMAE,6.0mg/kg。圖17顯示了來自在獼猴中進行的安全性研究的數據，其中在第1天和第22天服用標準抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC,藥物暴露為120(mg/m2藥物(5.9mg/kg抗體)；和thio抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC(TDC),藥物暴露為1200、2400和3600Pg/m2。在服藥后8、22(第二劑之前)、32、和43天測量嗜中性粒細胞水平。將嗜中性粒細胞水平相對于在給定時間點用媒介處理的動物中的相應水平標準化。發明詳述詳細內容參照本發明的某些實施方案，其實施例在附帶的結構和通式中例示。盡管結合列舉的實施方案描述了本發明，但是應理解它們并非指定用于將本發明限定到那些實施方案。相反，本發明覆蓋所有的備選、變型和等同技術方案，它們均包括在如權利要求定義的本發明范圍內。等同的許多方法和物質。本發明決不限于所述的方法和物質。定義除非另有定義，本文中所使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義，而且符合Singletonetal(1994)DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology,第2版，J.Wiley&Sons,21NewYork,NY;及Janeway，C.,Travers,P.，Walport，M.，Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,NewYork。本文的術語"抗體"以其最廣泛的含義使用并且特別覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出所需的生物活性(Miller等(2003)Jour,ofImmunology170:4854-4861)。抗體可以為鼠、人、人源化、嵌合的抗體或來源于其它物種。抗體為能夠識別和結合特異性抗原的蛋白質(Janeway,C.,Travers，R，Walport,M.,Shlomchik(2001)ImmunoBiology,5thEd"GarlandPublishing,NewYork).靶抗原一般具有由多種抗體的CDR識別的大量結合位點，也稱作表位。特異性結合不同表位的各抗體具有不同的結構。因此，一種抗原可以具有一種以上相應的抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分即含有抗原結杏位點的分子，所述抗原結合位點免疫特異性結合所關注耙標的抗原或其部分，這類靶標包括，但不限于癌細胞或產生與自身免疫性疾病相關的自身免疫抗體的細胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、類另U(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亞類。免疫球蛋白可以來源于任意的物種，諸如人、鼠或家兔。關千不同類的抗體的結構和特性參見例如BasicandClinicalImmunology,第8版，DanielRStites，AbbaI.TerrandTristramG.Parslow(編)，Appleton&Lange,Norwalk,CT，1994,第71頁和第6章。"抗體片段"包含全長抗體的一部分，該部分通常指所述全長抗體的抗原結合區或可變區。其抗原結合區或可變區。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；樣i抗體(minibody)(US5641870,Example2;Zapataetal(1995)ProteinEng.8(10):1057-1062);Olafsenetal(2004)ProteinEng.Design&Sel.17(4):315-323);由Fab表達文庫生成的片段；抗獨特型(抗Id)抗體；CDR(互補決定區)；和以免疫特異性方式結合癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意各項的表位結合片段；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。術語"單克隆抗體，，在用于本文時指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即構成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變形式。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一抗原性位點。另外，與包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體的優勢在于它們可以在不受其它抗體污染的情況中合成。修飾語"單克隆，，指示抗體從基本上同質的抗體群獲得的特征，不應解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，有待依照本發明使用的單克隆抗體可以通過首次由Kohleretal.(1975)256:495記載的雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(參見例如US4,816,567;US5,807,715)。"單克隆抗體"也可以使用Clacksonetal.(1991)A^"w352:624-628;Marksetal.(1991)/Afo/.Bfo/.222:581-597中記載的4支術/人噬菌體抗體庫分離。可以修飾編碼抗體的DNA以生成嵌合或融合抗體多肽，例如通過用人重鏈和輕鏈恒定域(CH和CL)序列替代同源鼠序列(US4816567;及Morrison,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA,81:6851(1984)),或者通過融合免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的整個或部分編碼序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗體的恒定域，或者用它們替代抗體的一個抗原結合位點的可變域以創建嵌合二價抗體，其包含對一種抗原具有特異性的抗原結合位點和對不同抗原具有特異性的另一抗原結合位點。"天然抗體，，指通常由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈構成的約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白。在輕鏈和重鏈Fab的可變域以及恒定域之間保持的數項疏水性相互作用之外，每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈間有變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規律的鏈內二硫鍵。每條重鏈在一端具有可變域(VH),接著是多個恒定域。每條輕鏈在一端具有可變域(vo,而另一端是恒定域。輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域排列在一起，而輕鏈的可變域與重鏈的可變域排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈與重鏈可變域之間形成界面。單克隆抗體在本文中明確包括"嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現出期望的生物學活性(US4,816,567;Morrisonetal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(例如舊大陸猴類(OldWorldMonkey)、猿等)的可變域抗原結合序列和人恒定區序列的"靈長類化"抗體。非人(例如嚙齒類)抗體的"人源化，，形式指最低限度包含衍生自非人抗體的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區殘基用具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)(諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類動物)的高變區殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(FR)殘基用相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體抗體中沒有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環對應于非人免疫球蛋白的高變環，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫琢蛋白恒定區(Fc),通常是人免疫球蛋白的恒定區。Fc片段包含通過二硫鍵和數個氨基酸殘基之間的疏水相互作用保持在一起的所有兩條重鏈的羧基末端部分。抗體的效應器功能是由Fc區中的序列決定的，該區還是受到在某些類型的細胞上找到的Fc受體(FcR)所識別的部分(Jonesetal(1986)Nature321:522-525;Riechmannetal(1988)Nature332:323-329;Presta,(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596;Verhoeyenetal(1988)Science,239:1534-1536;Simsetal(1993)丄Immunol.151:2296;Chothiaetal(1987)J.Mol.Biol.,196:901)。其它方法孑吏用自特定輕鏈或重鏈亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(Carteretal(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285;Prestaetal(1993)J.Immunol.151:2623)。"人抗體，，指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應的氨基酸序列和/定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。可得到能夠在免疫后在沒有內源免疫球蛋白生成的情況中生成人抗體完整全集的轉基因動物(例如小鼠)(Jakobovitsetal(1993)Proc.Natl,Acad.Sci.USA,90:2551;Jakobovitsetal(1993)Nature,362:255-258;Bruggemannetal(1993)YearinImmuno.7:33;US5545806;US5569825;US5591669;US5545807;及WO97/17852)。"完整抗體"在本文中指包含VL和VH結構域以及輕鏈恒定域(CO和重鏈恒定域Ch1、Ch2和Ch3的抗體。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列變體。完整抗體可具有一項或多項"效應器功能"，指那些可歸于抗體Fc區(天然序列Fc區或氨基酸序列變體Fc區)的生物學活性。抗體效應器功能的例子包括Clq結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；和細胞表面受體(諸如B細胞受體)下調。術語"氨基酸序列變體"指具有在一定程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基S^f列變體會與至少一種天然序列多肽的受體結合域或與至少一種天然受體的配體結合域擁有至少約70%序列同一性，而且優選的是，它們會是在序列方面與此類受體或配體結合域至少約80%、更優選至少約90%同源的序列。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內的某些位置擁有替代、刪除、和/或插入。氨基酸以慣用名、單字母和三字母代碼來指代。"序列同一性，，定義為在比對序列并在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性后，氨基酸序列變體中同樣的殘基的百分比。比對的方法和計算機程序是本領域公知的。一種這樣的計算機程序是由Genentech公司編寫的"Align2"，其已經于1991年12月IO日連同用戶文檔一起提交給美國版權局(UnitedStatesCopyrightOffice,Washington,DC20559),且其代碼可見于WO2007/001851。術語"Fc受體"或"FcR"指結合抗體Fc恒定區的受體。優選的FcRA天然序列人FcR。此外，優選的FcR是能結合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FcyRI、FcYRII和FqRni亞類的受體，包括這些受體的各等位變體和各可變剪接形式。Fc,II受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基酸序列，區別主要在于其胞質結構域。活化受體FcyRIIA在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FqRIIB在其胞質結構域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(綜述參見Dagron，(1997)」""w.Aw/wmw"o/.15:203-234)。FcR的綜述參見RavetchandKinet,(1991)iev./附7wm"o/.9:457-492;Capel"a/.,(1994)/m畫/7ome決c^4:25-34;及deHaasa/.,(1995)■/丄a6.C7/".Med.126:330-341。術語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來將會鑒定的。該術語還包括新生兒受體，FcRn，其負責將母體IgG轉移給胎兒(Guyer""/.，(1976)//mmimo/.117:587及Kim(1994)丄/mmwno/.24:249)。術語"可變的"指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變域。它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作高變區的三個區段。可變域中更加高度保守的部分稱作框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個FR,它們大多采取P-折疊片構象，通過形成環狀連接且在有些情況中形成p-折疊片結構一部分的三個高變區連接。每條鏈中的高變區通過FR非常接近地保持在一起，并與另一條鏈的高變區一起促成抗體的抗原結合位點的形成(參見Kabat(1991)iSfe《we"c&so/尸ro/e/zzso//wwwwo/og/ca/第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.)。恒定域不直接參與抗體與抗原的結合，但展現出多種效應器功能，諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術語"高變區"、"HVR"或"HV"在用于本文時指抗體可變域(區)中序列上高度可變和/或形成結構上定義的環的區域。通常，抗體包含六個高變區三個在VH中(Hl、H2、H3),三個在VL中(Ll、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區的敘述。Kabat互補決定區(CDR)是以序列變異性為基礎的且是最常用的(Kabat"a/.,Se《we"cesq/"尸rate/m/mmw"o/og/ca//"femst,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))，而Chothia指結構環的位置(ChothiaandLesk(1987)Mo/.所o/.196:901-917)。"接觸"高變區是以對可獲得的復合物晶體結構的分析為基礎的。下文記錄了這些高變區中每一個的殘基。除非另有說明，會采用依照Kabat蛋白質比對序列數據庫的Kabat編號方式(WuandKabat(1970)丄Exp.Med.132:211-250;JohnsonandWu(2000)Nuc.AcidsRes.28(1):214-218)。高變區位置通常如下氨基酸24-34(HVR-Ll)，氨基酸49-56(HVR-L2),氨基酸89-97(HVR-L3),氨基酸26-35A(HVR-H1)，氨基酸49-65(HVR-H2),和氨基酸93-102(HVR-H3)。高變區還可包括如下"延伸的高變區"VL中的氨基酸24-36(Ll)和氨基酸46-56(L2)。對于這些定義中的每一個，可變域殘基是依照Kabat等，見上文編號的。"改變的高變區"就本文目的而言指其中包含一處或多處(例如1處至約16處)氨基酸替代的高變區。"未修飾的高變區"就本文目的而言指具有與衍生它的非人抗體相同的氨基酸序列的高變區，即其中缺少一處或多處氨基酸替代的高變區。術語"如Kabat中的可變域殘基編號方式"或"如Kabat中的氨基酸位置編號方式，，及其變化形式指Kabat等，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》，第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中用于抗體重鏈可變域或輕鏈可變域編輯的編號系統。使用此編號系統，實際的線性氨基酸序列可以包含較少的或另外的氨基酸，對應于可變域FR或CDR的縮短或插入。例如，重鏈可變域可以包含H2殘基52后的單一氨基酸插入(依照Kabat的殘基52a)和重鏈FR殘基82后的插入殘基(例如依照Kabat的殘基82a、82b和82c等)。給定抗體的Kabat殘基編號可以通過將抗體序列與"標準"Kabat編號序列對比同源區來確定。"結合親和力，，通常指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間全部非共價相互作用總和的強度。除非另有說明，在用于本文時，"結合親和力"指反映結合對的成員(例如抗體與抗原)之間l:l相互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(Kd)來表述。親和力可通過本領域知道的常用方法來測量，包括本文中所描述的那些。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原且趨于容易解離，而高親和力抗體和力的多種方法，其中任一種都可用于本發明的目的。下文描述了具體的示例性實施方案。"抗原"指抗體能選擇性結合的預定多肽、碳水化合物、核酸、脂質、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。"框架區，，或"FR，，殘基指可變域中那些除此處定義的高變區殘基以外的殘基。"人共有框架"指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列選集中最常見的氨基酸殘基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列選集來自可變區序列亞型。通常，序歹'J亞型是i口Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)中的亞型。在一個實施方案中，對于VL,亞型是如Kabat等人中的亞型Kl。在一個實施方案中，對于VH，亞型是如Kabat等人，見上文中的亞型III。"VH亞型m共有框架，，包含從Kabat等人的可變重鏈亞型m中的氨基酸序列獲得的共有序列。"VL亞型I共有框架，，包含從Kabat等人的可變輕鏈K亞型I中的氨基酸序列獲得的共有序列。"Fv"是包含完整抗原識別和抗原結合位點的最小抗體片段。該區域由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的二聚體組成。正是在這種構造中，每個可變域的三個高變區相互作用而在VH-VL二聚體表面上限定了抗原結合位點。六個高變區一起i武予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變域(或是只包含對抗原特異性的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結合抗原的能力，只是親和力低于完整結合位點。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在于重鏈CH1結構域的羧基末端增加了少數殘基，包括來自抗體4交鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學偶聯。根據其恒定域的氛基酸序列，來自任何脊推動物物種的抗體的"輕鏈"可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡巾自(K)和拉姆達(人)。"單鏈Fv，，或"scFv"抗體片段包含抗體的Vh和Vl結構域，其中這些結構域存在于一條多肽鏈上。優選的是，FV多肽在VH與VL結構域之間進一步包含多肽接頭，其使得scFv能夠形成結合抗原的期望結構(Pliickthun，于《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》，第113巻，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，NewYork,第269-315頁，1994)。術語"雙抗體，，指具有兩個抗原結合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VJ中包含相連的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結構域之間不能配對，迫使這些結構域與另一條鏈的互補結構域配對，從而產生兩個抗原結合位點(EP404,097;WO93/11161;Hollinger"a/.(1993)Prac.廳.園90:6444-6448)。"游離半胱氨酸，，指已經工程改造入親本抗體的、具有硫醇官能基(-SH)的、且沒有配對或以其它方式成為分子內或分子間二硫橋一部分的半胱氨酸殘基。術語"硫醇反應性值(thiolreactivityvalue)"是游離半胱氨酸氨基酸的反應性的定量表征。硫醇反應性值指經過半胱氨酸工程改造的抗體中與硫醇反應性試劑反應的游離半胱氨酸氨基酸的百分比，且換算成最大值l。例如，經過半胱氨酸工程改造的抗體上與石克醇反應性試劑(諸如生物素-馬來酰亞胺試劑)以100%產率反應(以形成生物素標記的抗體)的游離半胱氨酸氨基酸具有1.0的硫醇反應性值。已工程改造入相同或不同親本抗體、與硫醇反應性試劑以80%產率反應的另一個半胱氨酸氨基酸具有0.8的硫醇反應性值。28已工程改造入相同或不同親本抗體、完全不能與硫醇反應性試劑反應的另一個半胱氨酸氨基酸具有O的硫醇反應性值。特定半胱氨酸的疏醇反應性值的測定可以通過ELISA測定法、質譜、液相層析、放射自顯影、或其它定量分析測試來進行。容許捕捉經過半胱氨酸工程改造的抗體及比較和定量半胱氨酸反應性的硫醇反應性試劑包括生物素-PEO-馬來酰亞胺((+)-生物素基-3-馬來酰亞氨基丙酰氨基-3,6-二d惡辛烷二胺((+)-biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3,6-dioxaoctainediamine),Oda等(2001)NatureBiotechnology19:379-382，PierceBiotechnology,Inc.)、生物素-BMCC、PEO-吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和生物素-HPDP(PierceBiotechnology,Inc.)、及Na-(3-馬來酰亞氨基丙酰基)生物胞素(MPB,MolecularProbes,Eugene,OR)。生物素化、雙功能和多功能接頭試劑的其它商業來源包括MolecularProbes(Eugene,OR)和Sigma(St.Louis,MO)。"親本抗體"指包含其中一個或多個氨基酸殘基有待用一個或多個半胱氨酸殘基替換的氨基酸序列的抗體。親本抗體可以包含天然的或野生型的序列。親本抗體可具有相對于其它天然的、野生型的、或修飾形式的抗體而言的現有氨基酸序列修飾(諸如添加、刪除和/或替代)。親本抗體可以針對感興趣的耙抗原，例如生物學重要的多肽。還涵蓋針對非多肽抗原(諸如腫瘤相關糖脂抗原；參見US5091178)的抗體。"分離的"抗體指已經鑒定且自其天然環境的成分分開和/或回收的抗體。其天然環境的污染性成分指將會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質，可包括酶、激素、和其它蛋白質性質或非蛋白質性質的溶質。在優選的實施方案中，將抗體純化至(l)根據Lowry法的測定，抗體重量超過95%，最優選重量考馬斯藍或優選的銀染色，達到同質。既然抗體天然環境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。"結合，，靶分子或感興趣抗原(例如MUC16或CA125抗原)的抗體指能夠以足夠親和力結合該抗原，使得該抗體在靶向表達該抗原的細胞中是有用的的。若抗體是結合MUC16多肽的抗體，則它通常會優先結合MUC16,而且可以是不顯著與其它蛋白質發生交叉反應的抗體。在此類實施方案中，根據非MUC16蛋白的程度(例如結合內源受體的細胞表面)會小于對MUC16的結合的10%。"處理"或"治療"或"緩和"指治療性處理及預防性或防范性措施二者，其中目標是預防或減緩(減輕)所針對的病理學狀況或紊亂。需要治療的受試者包括早就患有紊亂的受試者以及傾向于患上紊亂的受試者或要預防紊亂的受試者。如果在依照本發明的方法接受治療量的抗CA125/0772P抗體諸如半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物后，患者在如下一項或多項中顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，那么受試者或哺乳動物成功"治療"了表達CA125/0772P多肽的癌癥癌細胞數減少或癌細胞消失；腫瘤體積縮小；癌細胞浸潤到周圍器官中，包括癌傳播到軟組織和骨中受到抑制(即一定程度的減緩，優選停止)；腫瘤轉移受到抑制(即一定程度的減緩，優選停止)；腫瘤生長受到一定程度的抑制；和/或與特定癌癥有關的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發病率和死亡率降低；及生命質量提高。就半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物可預防癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞而言，它可能是抑制細胞的和/或毒害細胞的。這些體征或癥狀的減輕還可以由患者感受到。用于評估疾病的成功治療和改善的上述參數可以容易地通過內科醫師所熟悉的常規流程來測量。對于癌癥治療，可通過例如評估疾病進展時間(TTP)和/或測定響應速率(RR)來測量功效。轉移可通過分期測試(stagingtest)來測定，及通過骨掃描及鈣水平和其它酶的測試以測定是否傳播到骨。還可進行CT掃描以查明是否傳播到骨盆及該區域中的淋巴結。分別使用胸腔X射線和通過已知方法進行的肝酶水平測量來查明是否轉移到肺和肝。用于監測疾病的其它常規方法包括經直腸超聲檢查(TRUS)和經直腸針吸活組織檢查(TRNB)。術語"癌癥，，和"癌性"指或描述哺乳動物中特征通常為細胞生長不受調節的生理狀況。"腫瘤，，包含一個或多個癌性細胞，而且指所有贅生性細胞生長和增殖，無論是惡性的或者是良性的，及所有癌前或癌性細胞和組織。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴樣惡性腫瘤。此類癌癥的更具體例子包括卵巢癌、鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌("NSCLC")、肺的腺癌和肺的鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌包括胃腸癌、胰腺癌(包括胰腺的腺癌)、成膠質細胞瘤、宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、以及頭和頸癌。"過表達"抗原性受體的癌指與同一組織類型的非癌性細胞相比，在其細胞表面上具有顯著更高水平的受體諸如MUC16的癌。此類過表達可以是由基因擴增或者是由轉錄或翻譯提高引起的。可在診斷或預后測定法中通過評估細胞表面上存在的受體蛋白質水平的升高(例如通過免疫組織化學測定法；IHC)來確定受體過表達。或者/另外，可測量細胞中受體編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH;參見WO98/45479)、Southem印跡、Northern印跡、或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，諸如實時定量逆轉錄酶PCR(qRT-PCR)。術語"細胞增殖性病癥"和"增殖性病癥"指與一定程度的異常細胞增殖有關的病癥。在一個實施方案中，細^^增殖性病癥指癌癥。術語"治療有效量"指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物(例如半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物或化療劑)的量。在癌癥的情況中，治療有效量的藥物可減少癌細胞的數目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即一定程度的減緩，優選阻止)癌細胞浸潤入周圍器官；抑制(即一定程度的減緩，優選阻止)胂瘤轉移；一定程度的抑制腫瘤生長；和/或一定程度的減輕一種或多種與癌癥有關的癥狀。根據藥物可阻止現有癌細胞生長和/或殺死現有癌細胞的程度，它可以是細胞抑制性的和/或細胞毒性的。術語"細胞抑制性的"指限制細胞功能的效果，諸如限制細胞生長或細胞增殖。對于癌癥療法，功"化療齊'j"為可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的實例包4舌Erlotinib(TARCEVA,Ge顧tech/OSIPharm.)、Bortezomib(VELCADE,MilleniumPharm.)、氟維司群(Fulvestrant)(FASLODEX⑧，Astrazeneca)、Sutent(SU11248，Pfizer)、來曲唑(LetrozoIe)(FEMARA⑧，Novartis)、甲石黃酸伊馬^^尼(Imatinibmesylate)(GLEEVEC⑧，Novartis)、PTK787/ZK222584(Novartis)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)(Eloxatin,Sanofi)、5-FU(5-氟尿嘧啶(5-fluorouraci1))、亞葉酸(Leucovorin)、雷帕霉素(Rapamycin)(Sirolimus,RAPAMUNE,Wyeth)、Lapatinib(TYKERB,GSK572016,GlaxoSmithKline)、Lonafarnib(SCH66336)、Somfenib(BAY43-9006,BayerLabs.)、卡培他濱(capecitabine)(XELODA,Roche)、多西他塞(docetaxel)(TAXOTERE)、和Gefitinib(IRESSA,Astrazeneca)、AG1478、AG1571(SU5271;Sugen);烷化劑類(alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酸義克基酯類(alkylsulfonates),^者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)矛口艱泊舒凡(piposulfan);氮丙口定類(aziridines),i者i口苯佐替;泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)和烏5離替;泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙才掌石危X石岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝內酯類(acetogenin)(尤其是布4^也辛(builatacin)和布ji^也辛酮(buliatacinone));喜才對》威(camptothecin)(包4舌合成類似物托泊替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；隱藻素類(cryptophycins)(特別是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾4留塞f各素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每纟帛4卬素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards)，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、月旦石奔酰胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、異環磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美'法侖(melphalan)、#f氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾酉享(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦月妄(trofosfamide)、尿口密口定氛齊(uracilmustard);亞石肖脈類(nitrosoureas),i者i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如力。利車霉素(calicheamicin),尤其是力口利車霉素yll和加利車霉素coll(Angew(1994)Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186);蒽環類抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;二膦酸鹽類(bisphosphonates)，i者如氯膦酸鹽(clodronate);i矣斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酉交(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、力文線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噪吟霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧咬(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蝶呤、±萊酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌p令類似物，諸如氟達4立濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、碌b。米嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌口令(thioguanine);嘧口定類似、物，i者如安西他濱(ancitabine)、阿4U包苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿普(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表石克力食醇(epitiostanol)、美名,烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧卩定(eniluracil);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達曲沙(edatraxate);;也石粦酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine);;i也p丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋4妄(elliptiniumacetate);epothilone;依4乇才各魯(etoglucid);》肖酉交4家；,5脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物堿類(maytansinoids),諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol);安絲菌素(ansamitocin);米才乇胍月宗(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫艱達醇(mopidamol);二胺硝吖咬(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);。比柔比星(pirambicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酉l(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK⑧多糖復合物(JHSNatural33Products,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);蟲累;J走4者(spirogermanium);纟田交鏈孑包菌酉同酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine);達卡巴口秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛矛醇(mitolactol);口底泊澳》克(pipobroman);gacytosine;阿斗唐月包苦(arabinoside)("Ara-C");環磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANEtm不含克列莫佛(Crem叩hor)、清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6ne-PoulencRorer,Antony,France);笨丁酸氮芥(chlorambucil);GEMZAR⑧吉西他濱(gemcitabine);6-硫鳥噤呤(thioguanine);3克基口票p令(mercaptopurine);曱氨蟲某口令(methotrexate);4白類似、物，i者^口力i頁4白(cisplatin)和卡4白(carboplatin);長春石咸(vinblastine);4白；依才乇泊苦(etoposide)(VP-16);異環磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新堿(vincristine);NAVELBINE長春瑞濱(vinorelbine);能滅瘤(novantrone);替尼泊芬(teniposide);依達曲沙(edatrexate);道i若霉素(daunomycin);氨基蟲菜口令(aminopterin);希羅達(xeloda);尹本膦@史鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類維A酸(retinoids)，諸如維A酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine);任何上述物質的藥學可4妻受鹽、酸或書f生物。"化療劑"的該定義還包括(i)起調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥，諸如抗雌激素藥和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、雷洛昔芬(mloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);(ii)抑制在腎上腺中調節雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏羅哇(vorozole)、FEMARA⑧來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole);(iii)抗雄激素類，i者如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞4木(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；(iv)芳香酶抑制劑；(v)蛋白激酶抑制劑；(vi)脂質激酶抑制劑；(vii)反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉粘著細胞增殖的信號途經中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf和H-Ras;(viii)核酶，諸如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME⑧核酶)和HER2表達抑制劑；(ix)疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN⑧疫苗、LEUVECTIN㊣疫苗和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓樸異構酶l抑制劑；ABARELIXrmRH;(x)抗血管發生劑，諸如貝伐單抗(bevacizumab)(AVASTIN,Genentech);及(xi)任何上述物質的藥學可4妻受鹽、酸或衍生物。術語"細胞因子"是由一種細胞群釋放，作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白質的通稱。此類細胞因子的例子有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。細胞因子中包括生長激素，諸如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-a和-(3;穆勒氏(Mullerian)抑制性物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；激活素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO);神經生長因子，諸如NGF-P;血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)，諸如TGF-a和TGF-[3;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細胞生成素(EPO);骨誘導因子(osteoinductivefactor);干擾素，諸如干擾素-a、-卩和-y;集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF);白介素(IL),諸如IL-1、IL-lot、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-ll、IL-12;腫瘤壞死因子，-漆如TNF-a或TNF-卩；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白質及天然序列細胞因子的生物學活性等效物。術語"標記物，，指可共價附著于抗體并發揮如下功能的任何模塊(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標記物相互作用以改變由第一或第二標記物提供的可檢測信號，例如FRET(熒光共振能量轉移)；(iii)穩定與抗原或配體的相互作用或提高與之結合的親和力；(iv)通過電荷、疏水性、形狀或其它物理參數影響遷移率例如電泳遷移率或細胞通透性；或(v)提供俘獲模塊，以調控配體親和力、抗體/抗原結合、或離子絡合。短語"藥學可接受鹽"在用于本文時指ADC的藥學可接受的有機或無機鹽。例示性的鹽包括但不限于硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖酸鹽、甲酸鹽、苯曱酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對曱苯磺酸鹽和樸酸鹽(即U，-亞曱基-雙-(2-羥基-3-萘曱酸鹽))。藥學可接受鹽可能牽涉包含另一種分子，諸如乙酸鹽離子、琥珀酸鹽離子或其它抗衡離子。抗衡離子可以是穩定化合物電荷的任何有機或無機模塊。另外，藥學可接受鹽可以在其結構中具有超過一種帶電荷原子。在多種帶電荷原子作為藥學可接受鹽的組成部分的情況中可以具有多種抗衡離子。因此，藥學可接受鹽可具有一種或多種帶電荷原子和/或一種或多種抗衡離子。"藥學可接受溶劑化物"指一個或多個溶劑分子和ADC的結合。形成藥學可接受溶劑化物的溶劑的例子包括但不限于水、異丙醇、乙醇、曱醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。"載體"在用于本文時包括藥劑學可接受的載體、賦形劑或穩定劑，它們在所采用的劑量和濃度對暴露于其的細胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學可接受的載體是pH緩沖水溶液。生理學可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS⑧。下列縮寫在本文中有使用，而且具有所規定的定義Boc指N-(叔丁氧羰基)，cit指瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)，dap指dolaproine,DCC指l,3-二環己基碳二亞胺，DCM指二氯曱烷，DEA指二乙胺，DMSO指二曱亞石風，DTNB指5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，DTPA指二乙烯三胺五乙酸，DTT指二硫蘇糖醇，Fmoc指N-(9-芴基曱氧羰基)，gly指甘氨酸，HOBt指l-羥基苯并三唑，HPLC指高壓液相層析，Mtr指4-茴香基二苯基曱基(或4-曱氧基三苯曱基)，PAB指對氨基苯曱基氨基曱酰基，PBS指磷酸鹽緩沖鹽水(pH7),PEG指聚乙二醇，MC指6-馬來酰亞氨基己酰基，phe指L-苯丙氨酸，SEC指大小排阻層析，TFA指三氟乙酸，TLC指薄層層析，UV指紫外線，而val指纈氨酸。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體本發明的化合物包括半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其中任何形式的野生型或親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸被半胱氨酸氨基酸替換。改造的半胱氨酸氨基酸是游離的半胱氨酸，不是鏈內或鏈間二硫化物單元的一部分。可以對任何形式的抗MUC16抗體進行如此改造，即突變。例如，可以改造親本Fab抗體片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中稱為"ThioFab"。類似地，可以改造親本單克隆抗體以形成"ThioMab"。應當注意，單位點突變在ThioFab中產生單個改造的半胱氨酸殘基，而單位點突變在ThioMab中產生兩個改造的半胱氨酸殘基(由于IgG抗體的二聚體特性)。本發明的半胱氨酸改造抗MUC16抗體包括單克隆抗體，人源化的或嵌合的單克隆抗體，及抗體的抗原結合片段、融合多肽和類似物，其優先結合細胞結合MUC16多肽(cell-associatedMUC16polypeptide)。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體保留它們野生型、親本抗MUC16抗體對應物的抗原結合能力。如此，半胱氨酸改造的抗MUC16抗體能夠結合MUC16抗原，包括受體蛋白0772P(CA125,MUC16，Genbank登錄號AF361486),如以下文獻中所記載的YinetalJ.(2001)Biol.Chem.276(29):27371-27375);WO2004045553(權利要求14);WO200292836(權利要求6;圖12);WO200283866(權利要求15;第116-121頁)；US2003124140(實施例16);Gross-references:GI:34501467;AAK74120.3;AF361486—1。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包含一個或多個具有還原的硫氫(硫醇)基的游離的半胱氨酸氨基酸，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體結合MUC16多肽。在一個實施方案中，半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是如下方法制備的，其包括用半胱氨酸替換親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸殘基。可以對具有替換的("改造的")半胱氨酸(Cys)殘基的突變體評估新引入的、改造的半胱氨酸硫醇基團的反應性。硫醇反應性值是范圍為0到1.0的相對數值術語，而且可以對任何半胱氨酸改造的抗體測量該值。本發明的半胱氨酸改造的抗體的硫醇反應性值可以在0.6到1.0;0.7到1.0;或0.8到1.O的范圍內。在一個方面中，本發明涉及一種分離的半胱氨酸改造抗MUC16抗體，其包含由如下核苷酸序列所編碼的氨基酸序列，該核香酸序列能與編碼下列各項的DNA分子的互補鏈發生雜交(a)半胱氨酸改造抗體，其具有如本文中所公開的全長氨基酸序列，(b)半胱氨酸改造抗體氨基酸序列，其缺乏如本文中所公開的信號肽，(c)跨膜的半胱氨酸改造抗體蛋白的胞外結構域，其帶有或不帶有如本文中所公開的信號肽，(d)由任何在本文中所公開的核酸序列所編碼的氨基酸序列，或(e)如本文中所公開的全長的半胱氨酸改造抗體氨基酸序列的任何其它明確限定的片段。在一個方面中，本發明提供了一種分離的半胱氨酸改造抗MUC16抗體，其不帶有N末端信號序列和/或不帶有起始曱硫氨酸，并且是由編碼如本文中所描述的氨基酸序列的核苷酸序列所編碼的。其產生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在適于表達半胱氨酸改造抗體的條件下培養包含含有合適的編碼核酸分子的載體的宿主細胞和從該細胞培養物中回收所述半胱氨酸改造抗體。本發明的另一個方面提供了一種分離的半胱氨酸改造抗MUC16抗體，其或是跨膜結構域刪除的或是跨膜結構域失活的。其產生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在適于表達半胱氨酸改造抗體的條件下培養包含含有合適的編碼核酸分子的載體的宿主細胞和從該細胞培養物中回收所述半胱氨酸改造抗體。在其它實施方案中，本發明提供了分離的抗MUC16嵌合半胱氨酸改造抗體，其包含與異源(非MUC16)多肽融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗體。此類嵌合分子的例子包括與異源多肽(諸如例如表位標簽序列或免疫球蛋白Fc區)融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗體。半胱氨酸改造抗MUC16抗體可以是單克隆抗體、抗體片段、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、或竟爭性抑制抗MUC16多肽抗體與其相應抗原表位結合的抗體。本發明的抗體可以任選地偶聯至生長抑制劑或細胞毒劑，諸如毒素，包括例如auristatin、抗生素、放射性同位素、核溶酶等。本發明的抗體可以任選地在CHO細胞或細菌細胞中產生，且優選地抑制它們所結合的細胞的生長或增殖或誘導與它們所結合的細胞的死亡。為了診斷目的，本發明的抗體可以帶上可檢測標記物、附著至固體支持物、等等。在本發明的其它實施方案中，本發明提供了包含編碼任何本文所述半胱氨酸改造抗MUC16抗體的DNA的載體。還提供了包含任何此類載體的宿主細胞。舉例而言，宿主細胞可以是CHO細胞、大腸桿菌細胞或酵母細胞。用于產生任何本文所述多肽的方法有進一步的提供，且包括在適于表達期望多肽的條件下培養宿主細胞和從該細胞培養物中回收所述期望多肽。親本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗體結合MUC16多肽或MUC16多肽變體，其記載于"CompositionsandMethodsfortheDiagnosisandTreatmentofTumor"，WO2007/001851,Dennisetal，美國流水號11/452990，2006年6月14日提交，Genentech,Inc.)且記載為0772P、卵巢癌抗原CA125、或MUC16人類，及記載于Genbank登錄號AF361486。交叉引用GI:34501467;AAK74120.3;AF361486一1;Swiss-Prot條目Q8WX17。MUC16多肽變體指與WO2007/001851中披露的MUC16或CA125/0772P多肽序列具有至少約80。/。氨基酸序列同一性的MUC16/CA125/0772P多肽，其為(i)全長天然序列；(ii)缺少信號肽的多肽序列；(iii)有或無信號肽的胞由只代表全長MUC16/CA125/0772P多肽完整編碼序列一部分的核酸編碼的那些)。此類MUC16多肽變體包括例如如下多肽，其中在全長天然氨基酸序列的N端或C端添加或刪除了一個或多個氨基酸殘基。通常，MUC16多肽變體會與全長天然序列MUC16多肽序列、缺少信號肽的MUC16多肽序列、有或無信號肽的MUC16多肽胞外結構域、或全長MUC16多肽序列的任何其它具體限定的片段具有至少約80%氨基酸序列同一性，或者至少約81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%，88%,89%，90%，91%，92%,93%，94%,95%,96%,97%，98%,或99%氨基酸序列同一性。通常，MUC16多肽變體的長度為至少約10個氨基酸，或者長度為至少約20,30，40，50,60,70,80,90，100，110，120,130,140,150,160,170，180，190,200,210,220，230，240,250,260,270,280,2卯，300，310，320，330,340,350,360,370,380，390，400,楊，420,430,440,450,460,470,480,490，500,510,520,530，540,550，560,570,580，590,600個氨基酸，或更多。任選地，MUC16變體多肽會具有不超過一處與天然MUC16多肽序列相比的保守氨基酸替代，或者不超過2，3，4，5,6,7,8,9,或10處與天然MUC16多肽序列相比的保守氨基酸替代。MUC16多肽可以通過在以下各項中重組表達來制備(i)大腸桿菌，用pBR322載體；(ii)哺乳動物細胞，諸如人HEK293細胞(ATCCCCL1573)、COS(猿成纖維細胞，SV-40)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，用pRK5載體；(iii)酵母，諸如酵母菌抹AB110;或(iv)桿狀病毒感染的昆蟲細胞(WO2007/001851)。天然或重組MUC16多肽可通過蛋白質純化領域中的多種標準技術來純化。例如，使用對感興趣MUC16多肽特異性的抗體通過親和免疫層析來純化pro-MUC16多肽、成熟MUC16多肽、或pre-MUC16多肽。一4殳而言，通過將抗MUC16多肽抗體共價偶聯至活化后的層析樹脂來構建免疫親和柱。MUC16多肽可以作為與異源多肽的融合多肽而重組生產，所述異源多肽可以是在成熟蛋白質或多肽的N-末端具有特定切割位點的信號序列或其它多肽。或者，MUC16多肽可以作為與信號序列和容許純化MUC16融合多肽的異源多肽序列的融合多肽來生產，此類異源多肽序列的例子有多組氨酸(HiS6或His8)、人IgGFc、FLAG表位(KDYKDDDDK)、和gD表位(KYALADASLKMADPNRFRGKDLPVL)。信號序列可以是載體的構件，或者它可以是插入載體的編碼抗MUC16抗體或MUC16多肽的DNA的一部分。信號序列可以是原核信號序列，選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩定的腸毒素II前導序列。為了酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉化酶前導序列、a因子前導序列(包括糖酵母和克魯維酵母的a-因子前導序列(US5,010,182)、或酸性磷酸酶前導序列、白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導序列(EP0362179)、或WO90/13646中描述的信號。在哺乳動物細胞表達中，可以使用哺乳動物信號序列來指導蛋白質的分泌，諸如來自相同或相關物種的分泌型多肽的信號序列，以及病毒分泌前導序列。"表達MUC16的細胞"或在細胞表面上或以分泌形式表達內源或轉染的MUC16多肽。"表達MUC16的癌，，包含在細胞表面上存在MUC16多肽或生成和分泌MUC16抗原性多肽的細胞的癌。"表達MUC16的癌"任選在其細胞表面上生成足夠水平的MUC16多肽，使得抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物可與其結合并可對癌發揮治療效果。過表達MUC16多肽的癌指與同一組織40類型的非癌性細胞相比，在其細胞表面上具有顯著更高水平的MUC16多肽或生成和分泌顯著更高水平的MUC16多肽的癌。此類過表達可以是由基因擴增或者是由轉錄或翻譯提高引起的。可在臨床設置中通過評估細胞表面上存在的或細胞分泌的MUC16蛋白質水平的升高(例如通過免疫組織化學測定法，使用針對分離的MUC16多肽制備的抗MUC16抗體，所述多肽可使用重組DNA技術從編碼MUC16多肽的分離的核酸制備；FACS分析；等)來確定MUC16多肽過表達。或者/另外，可測量細胞中編碼MUC16多肽的核酸或mRNA的水平，例如通過焚光原位雜交(FISH)，使用對應于編碼MUC16的核酸或其互補鏈的基于核酸的探針(WO98/45479);Southern印跡；Northern印跡；或聚合酶鏈式反應(PCR)技術，諸如實時定量逆轉錄酶PCR(qRT-PCR)。還可使用基于抗體的測定法，通過測量生物學流體諸如血清中的脫落抗原來檢測MUC16多肽過表達(US4，933，294;WO91/05264;US5,401,638;Siasetal.,(1990)J.Immunol.Methods132:73-80)。可涵蓋多種其它體內測定法。或者，可將患者身體內的細胞暴露于任選用可檢測標記物例如放射性同位素標記的抗體，并且可評估抗體與患者體內細胞的結合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活組織檢查切片。親本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗體能夠結合、優選特異性結合MUC16多肽，如本文中所描述的。MUC16結合寡肽可使用眾所周知的技術無需過多實驗就得以鑒定。在這點上，注意到用于對寡肽文庫篩選能夠特異性結合多肽靶物的寡肽的技術是本領域眾所周知的(US5556762;US5750373;US4708871;US4833092;US5223409;US5403484;US5571689;US5663143;WO84/03506;WO84/03564;Geysenetal(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:3998-4002;Geysenetal(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:178-182;Geysenetal"于SyntheticPeptidesasAntigens,130-149(1986);Geysenetal.,丄Immunol.Meth.，102:259-274(1987);Schoofsetal.,J.Immunol"140:611-616(1988);Cwirla,S.E.etal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6378;Lowman,H.B.etal.(1991)Biochemistry,30:10832;Clackson，T.etal.(1991)Nature,352:624;Marks,J.D.etal.(1991)J.Mol.Biol"222:581;Kang，A.S.etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8363;及Sm他，G,P.(1991)CurrentOpin.Biotechnol.,2:668)。本發明的親本和半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、人的、雙特異性的、或異源偶聯的抗體。涵蓋各種形式的人源化抗MUC16抗體。例如，人源化抗體可以是抗體片,丈，諸如Fab。或者，人源化抗體可以是完整抗體，諸如完整IgGl抗體。雙特異性抗MUC16抗體指對至少兩種不同表位具有結合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗MUC16抗體可結合本文所述MUC16多肽的兩種不同表位。其它此類抗體可將MUC16結合位點與針對另一種蛋白質的結合位點組合。或者，可以將抗MUC16臂與結合白細胞上觸發分子(諸如T細胞受體分子(例如CD3)或IgG的Fc受體(FcyR)諸如FcYRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16))的臂組合，從而將細胞防御機制聚焦和定位于表達MUC16的細胞。雙特異性抗體還可用于將細胞毒劑定位于表達MUC16的細胞。這些抗體擁有MUC16結合臂及結合細胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干擾素-a、長春花生物堿(vincaalkaloid)、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可將雙特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。全長雙特異性抗體的傳統生成基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millsteinetal(1983)Nature305:537-539)。異源偶聯抗MUC16抗體也在本發明的范圍內。異源偶聯抗體由兩種共價連接的抗體構成。此類抗體建議例如用于將免疫系統細胞靶向不想要的細胞(US4，676,980)及用于治療HIV感染(WO91/00360;WO92/200373;EP03089)。可以在體外使用合成蛋白質化學的已知方法來制備抗體，包括那些涉及交耳關劑的方法。本發明的抗MUC16抗體可以是具有三個或更多抗原結合位點(例如四價抗體)的多價抗體，其可容易地通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達來生成。多價抗體可包含二聚化結構域和三個或更多抗原結合位點。優選的二聚化結構域包含(或由其組成)Fc區或鉸鏈區。在這種情況中，抗體可包含Fc區及Fc區氨基末端的三個或更多抗原結合位點。本文中優選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，但優選四個抗原結合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可變域，VD2是第二可變域，Fc是Fc區的一條多肽鏈，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或l。例如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區鏈。本文中的多價抗體優選進一步包含至少兩條(且優選四條)輕鏈可變域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變域多肽。本文涵蓋的輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，且任選進一步包含CL結構域。可以通過在Fc區中引入一處或多處氨基酸替代來修飾抗MUC16抗體的效應器功能。此類修飾可增強抗MUC16抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴'性細胞毒性(CDC)。如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)。參閱Caronetal(1992)J.ExpMed.176:1191-1195及Shopes,B.J.(1992)Immunol.148:2918-2922。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗MUC16抗體還可使用異雙功能交聯劑來制備，如Wolffetal(1993)CancerResearch53:2560-2565中所記載的。或者，可改造抗體，其具有雙重Fc區，并可由此具有增強的補體溶解和ADCC能力(Stevensonetal(1989)Anti-CancerDrugDesign3:219-230)。可以通過摻入補救受體結合表位(例如抗體片段)來調控抗MUC16抗體的血清半衰期(US5,739,277)。在用于本文時，術語"補救受體結合表位"指IgG分子(例如IgG,、IgG2、IgG3、或IgGjFc區中負責提高IgG分子體內血清半衰期的表位。通過標準竟爭結合分析和表位作圖(WO2007/001851),包括通過經改造而表達MUC16的完整PC3細胞上的直接熒光進行的交叉阻斷研究(使用PANDEX篩選以來對熒光定量(Fendly等(1990)CancerResearch50:1550-1558)),確定了結合MUC16表位的單克隆抗體(包括3A5)。通過標準流式細胞術分析測定出單克隆抗體3A5對OVCAR-3、OVCA432和SK-OV-3細胞的結合與這三種具體細胞系每一種中MUC16mRNA的表達水平(通過標準定量PCR分析測定的)平行。更具體的說，根據標準定量PCR分析的測定，OVCAR-3、OVCA-432和SK-OV-3細胞分別表達高、中和低水平的MUC16mRNA。流式細胞術分析顯示了單克隆抗MUC16抗體3A5定量地結合那些細胞系且與那些細胞系中MUC16mRNA的相對量平行。圖3顯示了人源化曲妥單抗(抗HER2)輕鏈(HuTMAb-LC,SEQIDNO:5)。人源化std(標準，親本)3A5抗MUC16輕鏈(Hu3A5-LC，SEQIDNO:2)、和嵌合std(標準，親本)3A5抗MUC16輕鏈(Ch3A5-LC,SEQIDNO:4)序列(WO2007/001851，通過述及收入本文)的比對。編號方式遵循連續編號失見則。圖4顯示了人源化曲妥單抗重鏈(HuTMAb-HC,SEQIDNO:6)、人源化std3A5抗MUC16重鏈(Hu3A5-HC,SEQIDNO:7)、和嵌合std3A5抗MUC16重鏈(Ch3A5-HC,SEQIDNO:8)序歹'KWO2007/001851,通過述及收入本文)的比對。編號方式遵循連續編號M^則。標記連續編號第281位的標簽實際上是278(Kabat275;Eu279)。使用3A5單克隆抗體(WO2007/001851;SambrooketalMolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress,1989;Ausubeletal.,CurrentProtocolsofMolecularBiology,Unit3.16,JohnWileyandSons,1997)實施了免疫組織化學分析。單克隆抗體3A5強烈結合20種人子宮內膜樣腺癌肺瘤樣品中的16種、25種人漿液性卵巢嚢腺癌樣品中的24種、和10種人透明細胞卵巢腫瘤樣品中的5種。單克隆抗體3A5內在化進入細胞，3A5就結合該細胞表面上的MUC16多肽。具體而言，將OVCAR-3細胞與單克隆抗體3A5和熒光右旋糖苷一起溫育18小時，然后用熒光素標記的抗3A5抗體定量檢測細胞所結合的3A5。這些分析證明了抗體3A5與右旋糖苷共定位，表明3A5抗體進入所溫育細胞的亞細胞組分，包括這些細胞的溶酶體隔室。對抗MUC16抗體的修飾5,364,934所述的保守和非保守突變的任何技術和指導方針。變異可以是編碼抗體或多肽的一個或多個密碼子的替代、刪除或插入，其導致氨基酸序列相對于天然序列抗MUC16抗體的改變。任選的是，變異是通過抗MUC16抗體的一個或多個結構域中至少一個氨基酸為任何其它氨基酸所替代。變異可使用本領域知道的方法來進行，諸如寡核香酸介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描、及PCR誘變。可對克隆的DNA進行定點誘變(Carteretal(1986)Nucl.AcidsRes,,13:4331;Zolleretal(1987)Nucl.AcidsRes"10:6487)、盒式誘變(Wellsetal(1985)Gene，34:315)、卩艮制性選才奪誘變(restrictionselectionmutagenesis)(Wellsetal(1986)Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA,317:415)或其它已知技術以產生抗MUC16抗體變體DNA。氨基酸改變可改變抗MUC16抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數目或位置或者改變膜錨定特征。其它修飾包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基分別脫酰胺為谷氨酰和天冬氨酰殘基，脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的oc-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties,(1983)W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86)，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。抗MUC6抗例如，在與全長抗MUC16抗體比較時，抗MUC16抗體片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少內部殘基。某些片段缺少對于抗MUC16抗體的期望生物學活性不是至關重要的氨基酸殘基。抗MUC16抗體片段可通過多種常規技術中的任一種來制備。期望肽片段可化學合成。一種備選方法牽涉通過酶促消化產生抗體片段，例如通過用已知在由特定氨基酸殘基限定的位點處切割蛋白質的酶處理蛋白質，或者通過用合適的限制酶消化DNA，并分離期望片段。還有一種合適的技術涉及分離并通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增編碼期望抗體或其片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCRMUC16抗體共享至少一種生物學和/或免疫學活性。特別優選的一類替代變體涉及替代人源化抗體或人抗體的一個或多個高變區殘基。通常，選擇用于進一步開發的所得變體相對于產生它們的抗體將具有改進的生物學特性。產生此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示進行的親和力成熟。簡而言之，將數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，在各個位點產生所有可能的氦基酸替代。如此產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內包裝的M13基因III產物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(例如結合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒定對抗原結合有重要貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析抗原-抗體復合物的晶體結構以鑒定抗體和人MUC16多肽之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述技術進行替代的候選位點。一旦產生此類變體，如本文所述對該組變體進行篩選，可選^^在一種或多種相關測定法中有優良特性的抗體用于進一步的開發。本發明范圍內所包括的對抗MUC16抗體的另一類共價修飾包括改變抗體或多肽的天然糖基化樣式，即刪除一個或多個在天然序列抗MUC16抗體中發現的碳水化合物模塊(moiety)(或是通過消除潛在糖基化位點，或是通過以化學和/或酶促手段刪除糖基化)，和/或添加一個或多個在天然序列抗MUC16抗體中不存在的糖基化位點。另外，修飾包括天然蛋白質糖基化中的定性改變,牽涉所存在的多種碳水化合物模塊的本質和比例的改變。抗體和其它多肽的糖基化通常或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側鏈的識別序列。由此，多肽中這些三肽序列其中任一的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗MUC16抗體中添加糖基化位點通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽序列而4更利地完成(用于N-連接的糖基化位氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用于O-連接的糖基化位點)。可任選通過DNA水平的變化來改變抗MUC16抗體的氨基酸序列，特別是通過在預先選擇的堿基處突變編碼抗MUC16抗體的DNA，從而產生將翻譯成期望氨基酸的密碼子。增加抗MUC16抗體上糖模塊的數目的另一種方法是通過使糖苷與多肽化學或酶促偶聯。本領域對此類方法有描迷，例如1987年9月11日公開的WO87/05330,和AplinandWriston，CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。去除抗MUC16抗體上存在的糖模塊可通過化學或酶促方法來實現，或者通過編碼充當糖基化靶物的氨基酸殘基的密碼子的突變替代來實現。化學脫糖基化技術是本領域已知的，而且描述于例如Hakimuddinetal.,Arch.Biochem.Biophys.259:52(1987)和Edgeetal.，Anal.Biochem.118:131(1981)。酶促切割糖模塊可通過使用多種內切和外切糖苷酶來實現，如Thotakuraetal.,(1987)Meth.E譜mol.138:350所述。對抗MUC16抗體的另一類共價修飾包括，以US4,640,835;US4，496，689;US4,301,144;US4,670,417;US4,791,192或US4，179,337所述方式，將抗體或多肽與多種非蛋白質性質的聚合物之一連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亞烷基(polyoxyalkylene)。抗體或多肽還可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術公開于例^口Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed.，1980。還可以形成嵌合分子的方式修飾本發明的抗MUC16抗體，所述嵌合分子包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的抗MUC16抗體。在一個實施方案中，此類嵌合分子包括帶有標簽多肽的抗MUC16抗體的融合物，所述標簽多肽提供了抗標簽抗體可選擇性結合的表位。表位標簽通常位于抗MUC16抗體的氨基或羧基末端。此類表位標記形式的抗MUC16抗體的存在可使用針對所述標簽多肽的抗體來檢測。而且，表位標簽的提供使抗MUC16抗體易于使用抗標簽抗體或另一類結合所述表位標簽的親和基質通過親和純化來純化。多種標簽多肽及其各自抗體是本領域公知的。例子包括多組氨酸(poly-his)或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽；流感HA標簽多肽及其抗體12CA5(Fieldetal.,(1988)Mol.Cell.Bio.8:2159-2165);c-myc標簽及其抗體8F9，3C7,6E10,G4，B7和9E10抗體(Evanetal.,(1985)MolecularandCellularBiology5:3610-3616);及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體(Paborskyetal.,(1990)ProteinEngineering3(6):547-553)。其它標簽多肽包括Flag肽(Hoppetal.,(1988)BioTechnology6:1204-1210);KT3表位肽(Martinetal.,(1992)Science255:192-194);a-微管蛋白表位肽(Skinneretal.,(1991)J.Biol.Chem.266:15163-15166);及T7基因10蛋白肽標簽(Lutz-Freyermuthetal.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6393-6397)。在一個備選實施方案中，嵌合分子可包括抗MUC16抗體與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區域的融合物。對于二價形式的嵌合分子(也稱為"免疫粘附素，，)，此類融合物可以是與IgG分子Fc區的融合。Ig融合物優選包含用可溶形式(跨膜結構域刪除或失活)的抗MUC16抗體置換Ig分子內至少一個可變區的替代。在一個特別優選的實施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgGl分子的鉸鏈區、CH2區和CH3區，或者鉸鏈區、CH,區、CH2區和CH3區(US5,428,130)。抗MUC16抗體的制備可通過多種方法制備編碼本發明的親本抗MUC16抗體和半胱氨酸改造抗MUC16抗體的氨基酸序列變體的DNA，包括但不限于自天然來源分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況中)、通過定點誘變(或寡核芬酸介導的誘變)(Carter等(1985)NucleicAcidsRes.13:4431-4443;Ho等(1989)Gene(Amst.)77:51-59;Kunkel等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488;Liu等(1998)J.Biol,Chem.273:20252-20260)、PCR誘變(Higuchi，(1990)于PCRProtocols,pp.177-183,AcademicPress;Ito等(1991)Gene102:67-70;Bernhard等(1994)BioconjugateChem,5:126-132;及Vallette等(1989)Nuc.AcidsRes.17:723-733)和對較早制備的編碼多肽的DNA的盒式i秀變(Wells等(1985)Gene34:315-323)來制備。誘變方案、試劑盒和試劑可通過商業途徑獲得，例如QuikChange⑧多重定點誘變試劑盒(Stratagene，LaJolla，CA)。還可以使用雙鏈質粒DNA作為^f莫板通過基于PCR的誘變通過寡核苷酸介導的誘變來生成單一誘變(Sambrook和Russel,(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版;Zoller等(1983)MethodsEnzymol.100:468-500;Zoller,M.J.和Smith，M(1982)Nucl.AcidsRes.10:6487-6500)。還可以通過限制性片段操作或通過使用合成寡核苷酸的交疊延伸PCR構建重組抗體的變體。誘變引物編碼半胱氨酸密碼子替換物。標準誘變技術可以用于產生編碼此類突變型半月先氨酉殳改造4元體的DNA(Sambrook等，MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y"1989;及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWiley-Interscience,NewYork,N.Y.,1993)。噬菌體展示技術(McCafferty等，(1990)Nature348:552-553)可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變域(V)基因全集生成抗MUC16人抗體和抗體片段。依照這種技術，將抗體可變域基因以符合讀碼框的方式克隆入絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因得到選擇。如此，噬菌體模擬B細胞的一些特性(Johnson等(1993)CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571;Clackson等(1991)Nature,352:624-628;Marks等(1991)J.Mol.Biol.222:581-597;Griffith等(1993)EMBOJ.12:725-734;US5565332;US5573905;US5567610;US5229275)。抗MUC16抗體可以使用已知的寡肽合成方法來化學合成，或者可以使用重組技術來制備和純化。適宜的氨基酸序列或其部分可以使用固相技術通過直接肽合成來生成(Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,(1969)W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA;Merrifield，(1963)J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154)。體外蛋白質合成可以使用手動技術或通過自動化來進行。自動化固相合成可以例如采用受t-BOC或Fmoc保護的氨基酸并使用AppliedBiosystems肽合成儀(FosterCity,CA)依照制造商的說明書來進行。抗MUC16聯合以生成期望的抗MUC16抗體或MUC16多肽。已經開發了用于生成抗體片段的多種技術。傳統上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(Morimoto等(1992)JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117;及Brennan等(1985)Science,229:81)，或者直接由重組宿主細胞生成這些片段。Fab、Fv和scFv抗MUC16抗體片段都可在大腸桿菌中表達及由大腸桿菌分泌，如此容許容易地生成大量的這些片段。可以從上文討論的噬菌體抗體庫中分離抗體片段。或者，可以直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學偶聯以形成F(ab')2片段(Carter等(1992)Bio/Technology10:163-167),或者，直接從重組宿主細胞培養物分離F(ab')2片段。抗MUC16抗體可以是單鏈Fv片段(scFv)(WO93/16185;US5571894;US5587458)。抗MUC16抗體片段還可以是"線性抗體"(US5,641,870)。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。或轉染的細胞來生成抗MUC16抗體。編碼抗MUC16抗體的DNA可以得自認為具有抗MUC16抗體mRNA且以可檢測水平表達之的組織制備的cDNA文庫。因而，人抗MUC16抗體或MUC16多肽DNA可以方便地得自自人組織制備的cDNA文庫。抗MUC16抗體編碼基因還可以得自基因組文庫或已知的合成規程(例如自動化核酸合成)。可以用設計用于鑒定目的基因或由其編碼的蛋白質的探針(諸如至少約20-80個堿基的寡核苷酸)篩選文庫。用選定探針篩選cDNA或基因組文庫可寸吏用才示)隹；危禾呈進4亍，i者長口Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,斤述。分離編石馬抗MUC16抗體或MUC16多肽的基因的一種備選方法是PCR方法學(Sambrook等，見上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)。49將宿主細胞用本文所述用于抗MUC16抗體或MUC16多肽生成的表達或克隆載體轉染或轉化，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼期望序列的基因而恰當調整的常規營養培養基中培養。培養條件，諸如培養基、溫度、pH等等，可以由本領域技術人員無需過多實驗就選擇。通常，用于使細胞培養物生產力最大化的原理、方案和實用技術可參見MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,ed"IRLPress,1991和Sambrook等，見上文。適于克隆或表達本文載體中的DNA的宿主細胞包括原核生物、酵母、或高等真核細胞。合適的原核生物包括但不限于真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌抹是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K1Z菌抹MM294(ATCC31，446);大腸桿菌Xl776(ATCC31,537);大腸桿菌菌4朱W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合適的原核生物宿主細胞包括腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(^C/76TZ'C/^)例如大腸埃希氏菌(大腸桿菌)(￡.co//)、腸桿菌屬(五"fera6acter)、歐文氏菌屬(五nWm'a)、克雷伯氏菌屬(尺/e&zW/a)、變形菌屬(尸rafe^)、沙門氏菌屬(Sfl/mowe〃a)例如鼠傷寒沙門氏菌(Sa/,wo"e〃a(V//2z'wmWww)、沙雷氏菌屬(Serra"a)例如粘質沙雷氏菌()、和志賀氏菌屬(幼/ge〃a),以及芽孢桿菌屬(Sa"7//)諸如枯草芽孢桿菌(及和地衣芽孢桿菌U./,c/zew/o腦^)(例如1989年4月12日出版的DD266，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)、々支單胞菌屬(尸化z^omo"w)諸如銅綠假單胞菌(Paerwg/"osa)、和鏈霉菌屬(5^eptom7cM)。這些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是用于重組DNA產物發酵的例示性宿主菌抹。優選的是，宿主細胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌抹W3110可以修飾，在編碼對宿主而言內源的蛋白質的基因中產生遺傳突變，此類宿主的例子包括大腸桿菌W3110菌抹1A2，其具有完整基因型to"A大腸桿菌W3110菌抹9E4，其具有完整基因型to"J;^r;大腸桿菌W3110菌抹27C7(ATCC55,244),其具有完整基因型to"Jp/wJ￡/5^rgf/ac^^ow/r^"";大腸桿菌W3110菌抹37D6，其具有完整基因型to"^p&3p/2a4￡75rgF-/ac」7(59ow;7V&7z7vG&"大腸牙干菌W3110菌抹40B4,它是具有非卡那霉素抗性&g尸刪除突變的菌4朱37D6;及具有突變型周質蛋白酶(US4,946,783)的大腸桿菌菌抹。或者，體外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反應也是合適的。全長抗體、抗體片段及抗體融合物蛋白質可在細菌中制備，特別是在不需要糖基化和FC效應器功能時，諸如當治療用抗體與細胞毒劑(例如毒素)偶聯且免疫偶聯物自身顯示出腫瘤細胞破壞的效力時。全長抗體在循環中具有較長半衰期。使用例如抗體片段和多肽在細菌中的表達及用于優化表達和分泌的翻譯起始區(TIR)和信號序列(US5,648,237;US5,789,199;和US5,840,523),大腸桿菌中的制備可以更快且更加省錢。表達后，從大腸桿菌細胞糊在可溶性級分中分離抗體，并且可例如才艮據同種型通過蛋白A或G柱來純化。最終的純化可以與用于純化例如在CHO細胞中表達的抗體的方法類似地進行。除了原核生物以外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母也是編碼抗MUC16抗體或MUC16多肽的載體的合適克隆或表達宿主。釀酒糖酵母)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(5b/2z'zoacc/aramyces尸om6e)(Beach和Nurse,(1981)Nature290:140;EP139,383);克魯維酵母屬(尺/甲e薩戸s)宿主(US4,943,529;Fleer等，(l"l)Bio/Technology9:968-975)諸如例如乳酸克魯維酵母(I/ac/^)(MW98-8C,CBS683，CBS4574;Louvencourt等，(1983)J.Bacteriol.154(2):737-742)、脆壁克魯維酵母(K/rag/fc)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(尺.k/gfln'c""(ATCC16,045)、威克克魯維酵母(Kw/cfera脂7)(ATCC24,178)、Kwa/ft7(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(Kdmsc^fe'/aram)(ATCC36,906;VandenBerg等，(1990)Bio/Technology8:135)、耐熱克魯維酵母(Kf/zwmoto/erara)、和馬克思克魯維酵母(Kmarx/a"^);亞羅酵母屬(Kwrow/a)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(戶Zc/n'a/xwto"^)(EP183,070;Sreekrishna等，(1988)J.BasicMicrobiol.28:265-278);假絲酵母屬();瑞氏木霉(7Wc/zocfem2areesZa)(EP244,234);粗4造月永孑包菌(A^Mms;oracra"a)(Case等，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:5259-5263);許旺酵母屬(&/7麗朋/。/^，")諸如許旺酵母(5"c/2麗朋/ow少cesocc油虛/k)(EP394,538);和絲狀真菌諸如例如脈孢菌屬(7Vewms:;ora)、青霉屬(Pe"/"7/z'w/w)、彎頸霉屬(ro(y/oc/aAwm)(WO91/00357)、和曲霉屬(A/^^〃w)宿主諸^口4勾巢曲霉(爿."/dw/am1)(Balance等,(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289;Tilburn等，(1983)Gene26:205-221;Yelton等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474)和黑曲霉(Am'ger)(Kelly和Hynes,(1985)EMBOJ.4:475-479)。曱基營養型酵母(Methylotropicyeast)適于本發明，包括但不限于能夠在曱醇上生長的、選自以下屬的酵母漢遜氏酵母屬(//a""肌/a)、假絲酵母屬(Ca"&Wa)、克勒克氏酵母屬(尺/oecfera)、畢赤氏酵母屬(尸/c/7/a)、糖酵母屬OSacc/^rawyce力、球擬酵母屬(rora/o戸&)、和紅酵母屬(i/z。(iofc)rw/(3)。適用于表達糖基化抗MUC16抗體或MUC16多肽的宿主細胞還可衍生自多細胞生物體。無脊推動物細胞的例子包括昆蟲細胞諸如果蠅S2和夜蛾Sf9,以及植物細胞諸如棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、煙草的細胞培養物。。已經鑒定了許多桿狀病毒抹和變體及相應的允許的昆蟲宿主細胞，它寸門來自i者^口草i也夜蛾65poJop&ra(毛蟲)、》矣及4尹蟲iL4etfes(蟲文子)、白纟丈4尹蟲i^4e(ies<3/6o//cfz^(蟲丈子)、黑腹果蟲U3rasop/n7ame/a"ogaWer(果蜆)、和家蠶Bom^;xmon'等宿主。公眾可獲得多種病毒抹用于轉染，例如苜蓿尺蟲芰(爿wtograp/zaca//orm.ca」NPV的L-1變體和家蠶C6om6yxNPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發明用作本文的病毒，特別是用于轉染草地夜蛾細月包。有用的哺乳動物宿主細胞系的例子是用SV40轉化的猴腎CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養中生長而亞克隆的293細胞，Graham等,(1977)J.GenVirol.36:59);幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO，Urlaub等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216);小鼠塞托利(sertoli)細胞(TM4，Mather,(1980)Biol.Reprod.23:243-251);猴腎細胞(CV1,ATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCK，ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138，ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，(1982)AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68);MRC5細胞;FS4細月包;和人肝瘤系(HepG2)。用上述用于抗MUC16抗體生成的表達或克隆載體轉化宿主細胞，并在為了誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼期望序列的基因而恰當調整的常規營養培養基中培養。可以將編碼抗MUC16抗體或MUC16多肽的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入復制型載體用于克隆(DNA擴增)或表達。載體可以是例如質粒、粘粒、病毒顆粒、或噬菌體的形式。可以通過多種規程將適宜的核酸序列插入載體中。在體外或在體內對胂瘤細胞的生長抑制可以以本領域已知的多種方式來測定，諸如與未處理的腫瘤細胞相比，在體外或在體內將表達MUC16的腫瘤細胞的細胞增殖抑制約25-100%,或約30-100°/。，或約50-100%或70-100%。可通過本領域已知的方法例如使用內源性或在用MUC16基因轉染后表達MUC16多肽的細胞，來評估抗MUC16抗體的體外生長抑制效果。例如，可將適宜的肺瘤細胞系和MUC16轉染細胞用不同濃度的抗MUC16單克隆抗體處理幾天(例如2-7天)，并用結晶紫或MTT染色，或者通過一些其它比色測定法來分析。降低的信號指示生長抑制。或者，可測量細胞存活力，即用抗MUC16抗體或藥物偶聯物處理細胞幾天，然后將細胞與測定細胞數目(與ATP含量成比例的，例如通過使用諸如CellTiterGlo(Promega,Madison，WT)等試劑進行的發光測定法)的試劑一起溫育。測量增殖的另一種方法是通過比較在存在或缺乏抗MUC16抗體時所處理細胞的SH-胸苷攝取。處理后，收獲細胞并在閃爍計數器中對摻入DNA的放射性的量定量。對增殖的抑制會通過放射性的降低來證明。為了選擇誘導細胞死亡的抗MUC16抗體，可以相對于對照評估膜完整性的喪失，例如通過碘化丙啶(PI)、臺盼藍或7AAD攝取所指示的。適宜的陽性對照包括用已知抑制所選細胞系生長的生長抑制性抗體處理該細胞系。可在細胞培養物中在抗體濃度為約0.005-30)ag/ml或約0.03nM至200nM時測量生長抑制，其中在使腫瘤細胞暴露于抗體后1-10天測量生長抑制。如果以約lpg/kg至約100mg/kg體重施用抗MUC16抗體導致在自首次施用抗體起約5天至3個月內、優選約5至30天內腫瘤體積縮小或腫瘤細胞增殖降低，那么該抗體是體內生長抑制性的。半胱氨酸改造抗MUC16抗體的制備本發明的設計、選擇和制備方法能夠得到具有親電子官能度(functionality)反應性的半胱氨酸改造抗MUC16抗體。這些方法進一步能夠獲得抗體偶聯物化合物，諸如在指定的、設計的、選擇性的位點上具有藥物分子的抗體-藥物偶聯物(ADC)化合物。抗體表面上的反應性半胱氨酸殘基容許通過硫醇反應性基團，諸如馬來酰亞胺或由代乙酰基特異性地偶聯藥物模塊。Cys殘基的硫醇官能度與馬來酰亞胺基團的親核反應性高于蛋白質中任何其它氨基酸官能度，諸如賴氨酸殘基的氨基或N-末端氨基約1000倍。硤乙酰基和馬來酰亞胺試劑中的硫醇特異性官能度可以與胺基團反應，但需要更高的pH09.0)和更長的反應時間(Garman,1997，Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London)。可以通過才示),Ellman觀'J定'法來估計蛋白質中游離硫醇的量。免疫球蛋白M為二硫化物連接的五聚體的例子，而免疫球蛋白G為內部二硫橋將各亞基鍵合在一起的蛋白質的例子。在諸如這種蛋白質中，用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或硒醇還原二硫鍵(Singh等(2002)Anal.Biochem.304:147-156)是產生反應性游離硫醇所需的。這種方法可以導致抗體的三級結構和抗原結合特異性喪失。PHESELECTOR(用于選擇反應性硫醇的噬菌體ELISA)測定法容許以ELISA噬菌體形式檢測抗體-Fab中反應性半胱氨酸基團，由此輔助半胱氨酸改造抗體的設計(US2007/0092940)。在孔表面上包被半胱氨酸改造抗體與之結合的抗原，隨后與展示半胱氨酸改造的Fab的噬菌體顆粒一起溫育，添加HRP標記的二抗，并才全測吸光度。可以以快速、有力和高流通量方式篩選噬菌體上展示的突變蛋白。可以使用與從抗體或其它蛋白質的隨機蛋白質-噬菌體文庫鑒定游離Cys摻入的適當反應性位點相同的方法生成半胱氨酸改造抗體的文庫并且進行結合選擇。這項技術包括使噬菌體上展示的半胱氨酸突變蛋白與也為硫醇反應性的親和試劑或報告基團反應。鑒定trastuzsumab-Fab中的重鏈A114CKabat編號方式(A121C連續編號方式)變體是例示性的。可以高效地搜索整個Fab分子以鑒定更多的帶有反應性硫醇基團的ThioFab變體。采用參數，表面可及分數(fractionalsurfaceaccessibility)來鑒定和量化溶劑對多肽中氨基酸殘基的可及性。將表面可及性表述為可以由溶劑分子，例如水接觸的表面積(A2)。水占據的空間近似為1.4A半徑球體。軟件為自由可獲得的或可許可的(SecretarytoCCP4,DaresburyLaboratory,Warrington,WA44AD,UnitedKingdom,Fax:(+44)1925603825,或通過因特網www.ccp4.ac.uk/dist/h加l/INDEX.html)，如使用計算具有已知X射線晶體學衍生坐標的蛋白質的每個氨基酸的表面可及性的算法的晶體學程序CCP4Suite("TheCCP4Suite:ProgramsforProteinCrystallography"(1994)Acta.Cryst.D50:760-763)。執行表面可及性計算的兩種例示性軟件模塊為"AREAIMOL，，和"SURFACE"，其基于B丄ee和F.M.Richards(1971)J.Mol.Biol.55:379-400的算法。AREAIMOL將蛋白質的溶劑可及表面定義為探針球(probesphere)(代表溶劑分子)在蛋白質的VanderWaals表面上翻轉時其中心的位置。AREAIMOL如下計算溶劑可及表面積，即在關于每個原子的擴充球體上產生表面點(距原子中心的距離等于原子和探針半徑的總和)，并且消除那些位于與相鄰原子相關的等同球體內的點。AREAIMOL找到了PDB坐標文件中原子的溶劑可及面積并概括了殘基、鏈和整個分子的可及面積。可以將各原子的可及面積(或面積差)存儲成假擬-PDB輸出文件。AREAIMOL假設了每個成分的單一半徑并僅識別有限數量的不同成分。AREAIMOL和SURFACE報導了絕對可及性，即平方埃(A)數。通過參比多肽內氨基酸相關標準狀態來計算表面可及分數。參比狀態為三肽Gly-X-Gly,其中X為感興趣的氨基酸，且參比狀態應為"擴展的"構象，即像那些在P鏈中的構象。擴展的構象使X的可及性達到最大值。用計算的可及面積除以Gly-X-Gly三肽參比狀態中的可及面積并報告商數，其為可及性分數。可及性百分比為可及性分數乘以IOO。計算表面可及性的另一種例示性算法基于程序xsae的SOLV模塊(Broger,C.,F.Hoffman-LaRoche，Basel),它基于多肽的X射線坐標計算氨基酸殘基對水球體的可及性分數。可以使用可得到的晶體結構信息來計算抗體中每個氨基酸的表面可及性分數(Eigenbrot等(1993)JMolBiol.229:969-995)。編碼半胱氨酸改造抗體的DNA易于使用常規規程來分離和測序(例如通過使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞充當此類DNA的來源。一旦分離，可以將DNA置入表達載體，然后轉染入原本不生成抗體蛋白質的宿主細胞，諸如大腸桿菌細月包、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或其它哺乳動物宿主細胞，諸如骨髓瘤細胞(US5807715;US2005/0048572;US2004/0229310),以獲得單克隆抗體在重組宿主細胞中的合成。鑒定了不干擾抗體效應器功能的位點，并用半胱氨酸殘基替代它們以進行位點特異性標記。抗體Fab的恒定區(CL和CH!)是對于此目的理想定位的，因為此結構域在抗原結合中或在Fc-效應器功能中沒有明顯作用(Jefferis,R."Structure-functionrelationshipsoftheIgGsubclasses,"inTheHumanIgGSubclasses.PergamonPress,,Oxford;1990)。使用基于PHESELECTOR噬菌體55展示的方法來篩選Fab表面上的反應性半胱氨酸，鑒定了變體LC-V110C(Kabat編號方式)和HC-A114C(Kabat編號方式，相當于Eu編號方式中的A118C和連續編號方式中的A117C，對于抗MUC16抗體而言)，以及其它變體是適合于抗體-Fab的位點特異性標記的(Junutula,J.R.etal.(2008)"Rapididentificationofreactivecysteineresiduesforsite-specificlabelingofantibody-Fabs，，JImmunolMethods332:4-52)。在設計和選擇后，可如下生成具有改造的、高度反應性的未配對的Cys殘基的半胱氨酸改造抗體，例如ThioFab:(i)在細菌例如大腸桿菌系統(Skerra等(1993)Curr.OpinioninImmunol.5:256-262;Pliickthun(1992)Immunol.Revs.130:151-188)或哺乳動物細胞培養物系統(WO01/00245)例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中表達；和(ii)使用常用的蛋白質純化技術純化(Lowman等(1991)J.Biol.Chem.266(17):10982-10988)。改造的Cys硫醇基團與親電子的接頭試劑和藥物-接頭中間體起反應而形成半胱氨酸改造抗體-藥物偶聯物和其它經標記的半胱氨酸改造抗體。半胱氨酸改造抗體的和存在于親本抗體中的、配對并形成鏈間和鏈內二石克鍵的Cys殘基不具有任何反應性硫醇基團(除非用還原劑處理)且不與親電子的接頭試劑或藥物-接頭中間體起反應。新近改造的Cys殘基可以保持不配對，而且能夠與親電子的接頭試劑或藥物-接頭中間體(諸如藥物-馬來酰亞胺)起反應(即偶聯)。例示性的藥物-接頭中岡體包括MC-MMAE、MC-MMAF、MC-vc-PAB-MMAE、和MC-vc-PAB-MMAF。重鏈和輕鏈中經改造的Cys殘基的結構位置依照連續編號系統來編號。此連續編號系統與自N末端起始的Kabat編號系統(Kabat等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)有關，與Kabat編號方案(底行)的區別在于標示為a、b、c的插入。使用Kabat編號系統，實際的線性氨基酸序列可包含減少的或添加的氨基酸，對應于可變域FR或CDR中的縮短或插入。經半胱氨酸改造的重^1變體位點通過連續編號方式和Kabat編號方案來標示。在一個實施方案中，通過包括下列步驟的方法制備半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(a)用半胱氨酸替代親代抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸殘基；和(b)通過使半胱氨酸改造的抗MUC16抗體與巰基-反應試劑反應測定半胱氨酸改造的抗體的巰基反應性(thiolreactivity)。半胱氨酸改造的抗體可以比親代抗體更具與巰基-反應試劑的反應性。游離半胱氨酸氨基酸殘基可以位于重鏈或輕鏈中或恒定域或可變域(區)中。還可以通過用一個或多個半胱氨酸氨基酸替代抗體片段的氨基酸來改造抗體片段，例如Fab,以便形成半胱氨酸改造的抗體片段。本發明的另一個實施方案提供了制備半胱氨酸改造的抗MUC16抗體的方法，包4舌(a)將一個或多個半胱氨酸氨基酸引入親代抗MUC16抗體以便生成半胱氨酸改造的抗MUC16抗體；和(b)測定半胱氨酸改造的抗體與巰基-反應試劑的巰基反應性；其中半胱氨酸改造的抗體比親代抗體更具與巰基-反應試劑的反應性。制備半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(a)可以包含(i)誘變編碼半胱氨酸改造的抗體的核酸序列；(ii)表達半胱氨酸改造的抗體；和(iii)分離和純化半胱氨酸改造的抗體。制備半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(b)可以包含表達選自噬菌體或噬菌粒顆粒的病毒顆粒上的半胱氨酸改造的抗體。制備半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(b)還可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗體與巰基-反應性親和試劑反應而生成親和標記的半胱氨酸改造的抗體；和(ii)測定親和標記的半胱氨酸改造的抗體與俘獲介質的結合。本發明的另一個實施方案為篩選帶有高反應性的未配對的半胱氨酸氨基酸的半胱氨酸改造的抗體的巰基反應性的方法，包含(a)將一個或多個半胱氨酸氨基酸導入親代抗體以便產生半胱氨酸改造的抗體；(b)使半胱氨酸改造的抗體與巰基-反應性親和試劑反應而生成親和標記的半胱氨酸改造的抗體；和(c)測定親和標記的半胱氨酸改造的抗體與俘獲介質的結合；和(d)測定半胱氨酸改造的抗體與巰基-反應試劑的巰基反應性。篩選半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(a)可以包含(i)誘變編碼半胱氨酸改造的抗體的核酸序列；(ii)表達半胱氨酸改造的抗體；和(iii)分離和純化半胱氨酸改造的抗體。篩選半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(b)可以包含表達選自噬菌體或噬菌粒顆粒的病毒顆粒上的半胱氨酸改造的抗體。篩選半胱氨酸改造的抗體的方法的步驟(b)還可以包含(i)使半胱氨酸改造的抗體與巰基-反應性親和試劑反應而生成親和標記的半胱氨酸改造的抗體；和(ii)測定親和標記的半胱氨酸改造的抗體與俘獲介質的結合。3A5IgG變體的半胱氨酸改造通過本文所述半胱氨酸工程改造方法，在重鏈117(抗MUC163A5抗體的連續編號方式)位點處將半胱氨酸導入全長、人源化和嵌合親本單克隆抗MUC163A5抗體，以給出A117Cthiohu抗MUC163A5人源化變體(其具有重鏈序列SEQIDNO:l和輕鏈序列SEQIDNO:2，圖1)和A117Cthioch抗MUC163A5嵌合變體(其具有重鏈序列SEQIDNO:3和輕鏈序列SEQIDNO:4，圖2)。通過含lmM半胱氨酸的培養基中的瞬時發酵，在CHO(中國倉鼠卵巢)細胞中表達這些半胱氨酸改造的單克隆抗體。通過流式細胞術在OVCAR-3細胞(其表達內源MUC16)上比較人源化thio抗MUC16半胱氨酸改造的抗體和標準3A5IgG的親和力，連續稀釋抗體直至觀察到降低的變化(areducedshift);選擇結合條件使得在整個滴定中抗體相對于細胞結合位點過量。使用焚光抗人Fc二抗檢測所結合的抗體。流式細胞術直方圖顯示了在飽和(400ng/mL)和亞飽和(25ng/mL)濃度發生的結合。在所分析的所有抗體濃度，這兩種抗MUC16變體，即標準和thio,給出等同的結合，提示等同的對抗原的親和力。在所測試的每個濃度，thio抗MUC16抗體像標準(親本)抗MUC16抗體一樣有效地結合OVCAR-3細胞。使用MUC16胞外結構域(ECD)—部分進行的表面等離振子共振分析也證實了thio3A5抗MUC16抗體對此抗原的高親和力(KD=116pM)。比較有高或低/無MUC16表達(根據RT-PCR研究)的細胞，thio抗MUC16抗體結合表達MUC16的細胞，但不結合MUC16陰性細胞系。因此，HC-A118處的替代不影響抗原結合。依照一個實施方案，人源化3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包含一個或多個具有游離半胱氨酸氨基酸的如下可變區重鏈序列(SEQIDNO:9-17,表l)。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>依照一個實施方案，嵌合3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包含一個或多個具有游離半胱氨酸氨基酸的如下重鏈可變區序列(SEQIDNO:18-26,表2)。表2:預測ch3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體變體的連續、Kabat和Eu編號方式的重鏈比4交<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>依照一個實施方案，人源化3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包含一個或多個具有游離半胱氨酸氨基酸的如下輕鏈可變區序列(SEQIDNO:27-33,表3)。表3:hu3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體變體的連續和Kabat編號方式的輕鏈比較序列連續編號Kabat編號SEQIDNO:SLSAS^GDRVTV15CVI5C27EIKRTGAAPSVV110CV110C28TVAAPGVFIFPS114CS114C29FIFPPGDEQLKS121CS121C30DEQLK￡GTASVS127CS127C31VTEQDGKDSTYS168CS168C32GLSSPGTKSFNV205CV205C33依照一個實施方案，嵌合3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體包含一個或多個具有游離半胱氨酸氨基酸的如下輕鏈可變區序列(SEQIDNO:34-40,表4)。表4:ch3A5半胱氨酸改造的抗MUC16抗體變體的連續和Kabat編號方式的輕鏈比較序列連續編號Kabat編號SEQIDNO:FLSVS^GGRVTL15CL15C34EIKRTQAAPSVV110CV110C35TVAAPGVFIFPS114CS114C36FIFPPGDEQLKS121CS121C37DEQLK^GTASVS127CS127C38VTEQDGKDSTYS168CS168C39GLSSP^TKSFNV205CV205C40經過標記的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體半胱氨酸改造的抗MUC16抗體可以位點特異性地和有效地與硫醇反應性試劑偶聯。硫醇反應性試劑可以是多官能接頭試劑(multifimctionallinkerreagent);捕捉(即親和、標記)試劑(例如生物素4妄頭試劑)；檢測標記物(例如熒光團試劑)；固相固定化試劑(例如SEPHAROSEtm、聚苯乙烯、或玻璃)；或藥物-接頭中間體。硫醇反應性試劑的一個例子是N-乙基馬來酰亞胺(NEM)。在一個例示性的實施方案中，ThioFab與生物素-接頭試劑反應得到生物素化的ThioFab,通過這種方式可以;險測和測量改造的半胱氨酸殘基的存在和反應性。ThioFab與多官能接頭試劑反應得到帶有可以與藥物模塊試劑或其它標記物進一步反應的官能化接頭的ThioFab。ThioFab與藥物-接頭中間體反應得到ThioFab藥物偶聯物。本文所述例示性方法一般可應用于鑒定和生產抗體，并且更一般地通過應用本文所述的設計和篩選步驟用于其它蛋白質。此類辦法可應用于偶聯其它硫醇反應性試劑，其中反應性基團是例如馬來酰亞胺、碘乙酰胺、吡。定基二碌i/f匕物、或其它石克醇反應性偶聯配偶體(Haugland,2003,MolecularProbesHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,MolecularProbes,Inc.;Brinkley,1992,BioconjugateChem.3:2;Garman,1997,Non-RadioactiveLabelling:APracticalApproach,AcademicPress,London;Means(1990)BioconjugateChem.1:2;Hermanson,G.inBioconjugateTechniques(1996)AcademicPress,SanDiego,pp.40-55,643-671)。硫醇反應性試劑可以是藥物模塊；熒光團，諸如熒光染料，像熒光素或若丹明；用于成像的螯合劑或放射性治療金屬；肽基或非肽基標記物或檢測標記；或清除改性劑(clearance-modifyingagent)，諸如聚乙二醇的各種異構體；結合第三種成分的肽或另一種碳水化合物或親脂性試劑。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體的用途半胱氨酸改造的抗MUC16抗體及其抗體-藥物偶if關物和標記的偶聯物可用作治療和/或診斷試劑。本發明進一步提供了預防、管理、治療或改善與MUC16相關病癥有關的一種或多種癥狀的方法。具體而言，本發明提供了預防、管理、治療、或改善與細胞增殖性病癥有關的一種或多種癥狀的方法，諸如例如印巢癌、宮頸癌、子宮癌、胰腺癌(包括胰腺的腺癌)、肺癌和乳腺癌。本發明還進一步提供了診斷MUC16相關病癥或發生此類病癥的素因的方法，以及鑒定優先結合細胞結合(cell-associated)MUC16多肽的抗體和抗體的抗原結合片段的方法。本發明的另一個實施方案致力于半胱氨酸改造的抗MUC16抗體用于制備藥物的用途，所述藥物在MUC16相關病癥的治療中是有用的。61半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物通過在限定的位點處附著藥物模塊及近乎均一的化學計量(藥物/抗體比，p值)，半胱氨酸改造的抗MUC16抗體解決了抗體-藥物偶聯物異質性的問題。另外，偶聯條件導致對所有天然免疫球蛋白二石克鍵的保留。本發明的一個方面是抗體-藥物偶聯物化合物，其包含半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)和auristatin藥物模塊(D)，其中半胱氨酸改造的抗體經由一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D;該化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p為l,2,3,或4;且其中所述半胱氨酸改造的抗體是通過如下方法制備的，即包括用一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸替換親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸殘基。在將單個半胱氨酸突變改造入抗MUC16親本抗體以形成半胱氨酸改造的抗MUC16抗體時，由于重鏈和輕鏈的對稱本質，導致兩個游離的半胱氨酸氨基酸。圖5顯示了半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物(ADC)的實施方案，其中auristatin藥物模塊附著至輕鏈(LC-ADC)、重鏈(HC-ADC)、和Fc區(Fc-ADC)中的改造的半胱氨酸基團。常規的抗體-藥物偶聯策略產生對靶細胞有活性但可能也產生系統毒性的偶聯物的異質混合物。半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶耳關物的潛在優點包括安全性改善(治療指數更大)、PK參數改善、穩定性更大和結合的保留(由于抗體鏈間二硫鍵的保留)、藥物偶聯位點確定、和更近乎均一的產物混合物。事實上，與標準抗MUC16ADC相比，thio抗MUC16ADC在臨床前動物模型中展現出更大的治療窗(大約四倍)。在比較匹配的IgG抗體(mg/kg)劑量水平時，我們的數據顯示了thio和標準MUC16ADC在小鼠異種移植物中有等同的功效，然而在大鼠中，68.6mg/kg(2820嗎/m2MMAE)劑量的thioADC產生與16.6mg/kg(1500嗎/m2MMAE)劑量的標準ADC相似的毒性。在比較細胞毒性藥物劑量(嗎/m2)時，與標準ADC相比，thioADC既更加安全又更加有效。thioADC勝過標準ADC的所得益處會是在有效(mg/kg)劑量的ADC降低MMAE暴露。繼而，改善的對thioADC的耐受性能容許更高的劑量水平(以mg/kg抗體計)及為患有更具挑戰性的惡性腫瘤(例62療益處。藥物模塊式I的抗體-藥物偶聯物(ADC)的Auristatin藥物模塊包括多拉司他汀、auristatins(US5635483;US5780588;US5767237;US6124431)、及其類似物和衍生物。已經證實多拉司他汀和auristatins干擾微管動力學、GTP水解、及核和細胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.AgentsandChemother.45(12):3580-3584)并且具有抗癌(US5663149)和抗真菌活性(Pettit等(1998)Antimicrob.AgentsChemother.42:2961-2965)。多拉司j也汀或auristatin藥物才莫塊的不同形式可以通過肽藥物模塊的N(氨基)末端或C(羧基)末端共價附著至抗體(WO02/088172;Doronina等(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784;Francisco等(2003)Blood102(4):1458-1465)。例示性的auristatin實施方案包才舌N-末端連接的monomethylauristatin藥物模塊DE和DF,其4皮露在下列文獻中WO2005/081711;Senter等，ProceedingsoftheAmericanAssociationforCancerResearch,Volume45,AbstractNumber623，2004年3月28日提交，明確將這些文獻各自全部披露的內容引入本文作為參考。例示性的auristatin藥物模塊包括MMAE和MMAF。式I的抗體-藥物偶聯物(ADC)的auristatin藥物模塊(D)包括monomethylauristatin藥物模塊MMAE和MMAF。MMAE或MMAF藥物模塊的N-末端經接頭共價附著至抗體的改造的半胱氨酸。MMAEMMAF其它例示性的auristatin藥物模塊包括在五肽auristatin藥物模塊的C末端具有苯丙氨酸羧基修飾的單曱基纈氨酸化合物(WO2007/008848)和在五肽auristatin藥物模塊的C末端具有苯丙氨酸側鏈修飾的單曱基纈氨酸化合物(WO2007/008603)。典型地，可以通過在兩個或多個氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵制備基于肽的藥物模塊。例如，可以按照肽化學領域眾所周知的液相合成法制備這類肽4定(參見E.Schr6der和K.Liibke,"ThePeptides",volume1,pp76-136,1965AcademicPress)。接頭"接頭"、"接頭單元"、或"連接"指包含使抗體共價附著于藥物模塊的共價鍵或原子鏈的化學模塊。在各個實施方案中，接頭以L表示。"接頭，，(L)為可用于連接一個或多個藥物模塊(D)和抗體單元(Ab)而形成通式I的抗體-藥物偶聯物(ADC)的雙功能或多功能模塊。可以使用具有供結合藥物和抗體用的反應性官能度的接頭而便利地制備抗體-藥物偶聯物(ADC)。半胱氨酸改造抗體(Ab)的半胱氨酸硫醇可以與接頭試劑、藥物模塊或藥物-接頭中間體的親電子官能團形成鍵。一方面，接頭具有反應性位點，該位點具有與存在于抗體上的親核半胱氨酸具有反應性的親電子基團。抗體的半胱氨酸硫醇與接頭上的親電子基團具有反應性并且與接頭形成共價鍵。有用的親電子基團包括但不限于馬來酰亞胺和卣代乙酰胺基團。接頭包括二價基，諸如亞烴基(alkyldiyl)、亞芳基、亞雜芳基；模塊，諸如-(012、0(012)。-、烷氧基重復單元(例如聚亞乙基氧基(polyethylenoxy)、PEG、聚亞曱基氧基(polymethyleneoxy))和烷氨基(例如聚乙烯氨基，Jeffamine);及二酸酯和酰胺，包括琥珀酸酯、琥珀酰胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯和己酰胺。半胱氨酸改造抗體與接頭試劑或藥物-接頭中間體，與親電子官能團諸如馬來酰亞胺或a-卣代羰基依照Klussman等(2004)Bio—ugateChemistry15(4):765-773，766頁上的偶聯方法和依照實施例3的方案起反應。接頭可以由一種或多種接頭構件構成。例示性的接頭構件包括6-馬來酰亞氨基己酰基("MC，，)、馬來酰亞氨基丙酰基("MP")、纈氨酸-瓜氨酸("val-cit"或"vc")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe"或"af，)、對氨基千氧羰基("PAB")、N-琥珀酰亞氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯("SPP")、N-琥珀酰亞氨基4-(N-馬來^L亞氨基曱基)環己烷-l羧酸酯("SMCC")、和N-琥珀酰亞氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯曱酸酯("SIAB")、亞乙基氧基-CH2CH20-作為一個或多個重復單元("EO，，或"PEO")。本領域知道別的接頭構件，本文中也描述了一些。在一個實施方案中，ADC的接頭L具有通式64—A「Ww—Yy—其中-A-為共價附著于抗體(Ab)半胱氨酸硫醇的延伸物(stretcher)單元；a為0或l;每個-W-獨立為氨基酸單元；w獨立為0-12的整^t;-Y-為共價附著于藥物模塊的間隔物(spacer)單元；且y為0、l或2。延伸物單元當存在時，延伸物單元(-A-)能夠連接抗體單元與氨基酸單元(-W-)。在這方面，抗體(Ab)具有能與延伸物單元的親電子官能團形成鍵的游離半胱氨酸硫醇基團。式n和III描繪了式I中的例示性延伸物單元，其中Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定義且R"為選自下列的二價基(CH2》、C3-Cs碳環基、-(CH2》、亞芳基、(CH2)廣亞芳基、-亞芳基-(CH2)「、(CH2)「(C3-Cs碳環基)、(C3-Cs碳環基)-(CH2)r、CVC8雜環基、(CH2)r-(C3-Q雜環基)、-(C3-Q雜環基)-(CH2)「、-(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-、-(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)「CH2-、-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、_(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2_、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-、-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-和-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2》-；其中Rb為H、C廣C6烴基(烷基)、苯基或芐基；且r獨立地為范圍l-10的整數。亞芳基包括通過從芳族環體系中除去兩個氫原子而衍生的6-20個碳原子的二價芳族烴基。典型的亞芳基包括但不限于衍生自苯、取代的苯、萘、蒽、聯苯等的基團。雜環基包括一個或多個環原子為雜原子(例如氮、氧和硫)的環體系。雜環基包含1-20個碳原子和1-3個選自N、O、P和S的雜原子。雜環可以為具有3-7個環成員的單環(2-6個碳原子和l-3個選自N、O、P和S的雜原子)或具有7-10個環成員的雙環(4-9個碳原子和l-3個選自N、O、P和S的雜原子)，例如雙環[4,5],[5,5]，[5，6]或[6,6]體系。雜環記載于Paquette,LeoA.;"PrinciplesofModernHeterocyclicChemistry",W.A.Benjamin,NewYork,1968,特別是l,3,4,6,7，和9章；"TheChemistryofHeterocyclicCompound,AseriesofMonographs",JohnWiley&Sons,NewYork，1950至今，4爭別是巻13，14,16，19,和28;及J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。舉例而言而非限制，雜環的例子包括吡咬基、二氬吡。定基、四氬吡。定基(哌啶基)、5塞唑基、四氫噻吩基(tetrahydrothiophenyl)、硫氧化的四氪謹>分基、嘧啶基、呋喃基、漆吩基(thienyl)、p比咯基、p比峻基、咪唑基、四唑基、苯并吹喃基、硫雜萘基(thianaphthalenyl)、卩引咮基、indolenyl、唾啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡p各淋基、四氬咬喃基、雙-四氮吹喃基(bis-tetrahydrofuranyl)、四氪吡喃基、雙-四氫吡喃基(bis-tetrahydr叩yranyl)、四氮p奎啉基、四氫異p奎淋基、十氫會啉基、八氫喹啉基、吖辛因基(azocinyl)、三嗪基、6H-l，2,5-噻二嗪基、2H,6H-l,5,2-二噻。秦基、噻吩基、噻蒽基、吡喃基、異苯并呋喃基、色烯基、a占噸基、酚卩惡噻基(phenoxathinyl)、2H-吡咯基、異p塞唑基、異0惡唑基、吡,基、噠嗪基、吲嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹。秦基、酞。秦基、萘。定基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、4Ah-^唑基、口卡唑基、P-啼啉基、菲啶基、吖啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、呋咱基、吩0惡嗪基、異色滿基、色滿基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌。秦基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、奎寧環基、嗎啉基、a惡唑烷基、笨并三唑基、苯并異D惡唑基、羥吲哚基、苯并D惡唑啉基和靛紅酰基(isatinoyl)。碳環基包括具有3-7個碳原子(作為單環)或7-12個碳原子(作為雙環)的飽和或不飽和環。單環碳環具有3-6個環原子，更通常地為5或6個環原子。雙環碳環具有7-12個環原子，例如排列成雙環[4，5]，[5,5],[5,6]或[6,6]體系，或者9或10個環原子，排列成雙環[5,6]或[6,6]體系。單環碳環的例子包括環丙基、環丁基、環戊基、l-環戊-l-烯基、l-環戊-2-烯基、l-環戊-3-烯基、環己基、l-環己-l-烯基、1-環己-2-烯基、l-環己-3-烯基、環庚基和環辛基。才艮據式IADC的所有例示性實施方案諸如n-VI應當理解，即使在未明確表述的情況中，有l-4個藥物模塊與抗體連接(p=1-4),這取決于改造的半胱氨酸殘基的數目。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>一種例示性式II延伸物單元衍生自馬來酰亞氨基-己酰基(MC),其中R<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>一種例示性式n延伸物單元衍生自馬來酰亞氨基-丙酰基(mp),其中r'7<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>另一種例示性式II延伸物單元，其中R"為-(CH2CH20)r-CH2-且r為2:〇另種例示性式II延伸物單元，其中R17為-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r—CH2—,其中Rb為H且每個r為2:O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage67</formula>另一種例示性式III延伸物單元，其中R17為-(CH2)5O在另一個實施方案中，延伸物單元通過抗體的改造半胱氨酸的硫原子與延伸物單元的石克原子之間的二石克4建與半胱氨酸改造抗MUC16抗體連接。該實施方案的代表性延伸物單元以式IV描繪，其中R17、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y》。上文所定義。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>在又一個實施方案中，延伸物的反應性基團含有能與抗體的游離半胱氨酸硫醇形成鍵的硫醇反應性官能團。硫醇反應性官能團的例子包括但不限于馬來酰亞胺；a-卣代乙酰基；活化的酯類，諸如琥珀酰亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯；酸酐類；酸性氯化物或酰基氯類(acidchloride);磺酰氯類；異氰酸酯類和異硫氰酸酯類。該實施方案的代表性延伸物單元以式Va和Vb描繪，其中-R17-、Ab-、-W-、-Y-、-D、w和y如上文所定義。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>在另一個實施方案中，接頭可以為樹狀類型接頭(dendritictypelinker),其用于通過分支的多功能接頭模塊將超過一個藥物模塊共價附著于抗體(Sim等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768;King(2002)TetrahedronLetters43:1987-1990)。樹狀接頭能增加藥物與抗體的摩爾比，即載荷，它與ADC的效能相關。如此，如果半胱氨酸改造抗體僅攜帶一個反應性半胱氨酸硫醇基團，那么可以通過樹狀接頭附著眾多藥物模塊。氨基酸單元接頭可以包含氨基酸殘基。如果存在，那么氨基酸單元(-Ww-)使本發明的半胱氨酸改造抗體-藥物偶聯物(ADC)的抗體(Ab)與藥物模塊(D)連接。-Ww-為二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、十一肽或十二肽單元。包含氨基酸單元的氨基酸殘基包括那些天然存在的以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。各個-W-單元獨立地具有如下所示的方括號內的通式，且w為范圍0-12的整數其中1119為氫、曱基、異丙基、異丁基、仲丁基、千基、對羥基千基、-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2SCH3、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、-(CH2)3NHC(=NH)NH2、-(CH2)3NH2、-(CH2)3NHCOCH3、-(CH2)3NHCHO、-(CH2)4NHC(=NH)NH2、-(CH2)4NH2、-(CH2)4NHCOCH3、-(CH2)4NHCHO、-(CH2)3NHCONH2、-(CH2)4NHCONH2、-CH2CH2CH(OH)CH2NH2、2-吡咬基曱基-、3-吡咬基曱基-、4-。比。定基曱基-、苯基、環己基、H當R"不為氫時，R"所附著的碳原子為手性的。1119所附著的各個碳原子獨立地以(S)或(R)構型或外消旋混合物附著。氨基酸單元如此可以為對映體方面純的、外消旋的或非對映異構體的。例示性的-Ww-氨基酸單元包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括纈氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。例示性的三肽包括甘氨酸-纈氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。構成氨基酸接頭構件的氨基酸殘基包括天然存在的氨基酸，以及次要氨基酸和非天然存在的氨基酸類似物，諸如瓜氨酸。可以用一種或多種酶(包括腫瘤相關蛋白酶)酶促切割氨基酸單元，以釋放藥物模塊(-D),其在一個實施方案中在體內釋放時被質子化以提供藥物69(D)。可以在特定酶(例如肺瘤相關蛋白酶，組織蛋白酶B、C和D,或纖溶酶蛋白酶)的酶促切割的逸擇性方面設計和優化氨基酸接頭構件。間隔物單元在氨基酸單元存在時(w=1-12),間隔物單元(-Yy-)(在存在時，y=l或2)使氨基酸單元(-Ww-)與藥物模塊(D)連接。或者，在氨基酸單元不存在時，間隔物單元使延伸物單元與藥物才莫塊連接。在氨基酸單元和延伸物單元都不存在時(w,y二O),間隔物單元還4吏藥物模塊與抗體單元連接。間隔物單元有兩大類自我犧牲的(self-immolative)和非自我犧牲的。非自我犧牲的間隔物單元為部分或所有間隔物單元在從抗體-藥物偶聯物或藥物模塊-接頭切割(特別是酶促切割)氨基酸單元后保持與藥物模塊結合的間隔物單元。當含有甘氨酸-甘氨酸間隔物單元或甘氨酸間隔物單元的ADC通過腫瘤細胞相關蛋白酶、癌細胞相關蛋白酶或淋巴細胞相關蛋白酶進行酶促切割時，甘氨酸-甘氨酸-藥物模塊或甘氨酸-藥物模塊從Ab-Aa-Ww-上切割下來。在一個實施方案中，在靶細胞內發生獨立的水解反應，其切割甘氨酸-藥物模塊的鍵并孝奪力丈藥物。在另一個實施方案中，-Yy-為對氨基芐基氨基甲酰基(PAB)單元，其亞苯基部分被Qm取代，其中Q為-C，-Cs烴基(烷基，alkyl)、-0-(C,-C8烴基(烷基，alkyl))、-鹵素、-硝基或-氰基；且m為范圍0-4的整數。'非自我犧牲的間隔物單元(-Y-)的例示性實施方案為:-Gly-Gly-;-Gly-;-Ala-Phe-;-Val-Cit-。在一個實施方案中，提供了藥物模塊-接頭或ADC或其藥學可接受的鹽或溶劑化物，其中間隔物單元不存在(y二O)。或者，含有自我犧牲的間隔物單元的ADC能釋放-D。在一個實施方案中，-Y-為通過PAB基團的氨基氮原子連接至-Ww-,且通過碳酸酯、氨基曱酸酯或醚基團直接連接至-D的PAB基團，其中ADC具有如下例示性結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage70</formula>其中Q為-C,-Cs烴基(烷基，alkyl)、-0-(C,-C8烴基(烷基,alkyl))、-鹵素、一硝基或-氰基；m為范圍0-4的整數；且p范圍為l-4。自我犧牲的l'曰—團似的芳族化合物，諸如2-氨基咪唑-5-曱醇衍生物(Hay等(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9:2237)、雜環PAB類似物(US2005/0256030)、卩-葡糖苦酸(WO2007/011968)、和鄰位或對位氨基千基乙縮醛。可以使用在酰胺鍵水解時進行環化的間隔物，諸如取代和未取代的4-氨基丁酸酰胺類(Rodrigues等(1995)ChemistryBiology2:223)、適當取代的雙環[2.2.1]和雙環[2.2.2]環體系(Storm等(1972)J.Amer.Chem.Soc.94:5815)和2-氨基苯基丙酸酰胺類(Amsberry等(1990)J.Org.Chem.55:5867)。消去在甘氨酸上取代的含胺藥物(Kingsbury等(1984)J.Med.Chem.27:1447)也是可用于ADC的自我犧牲的間隔物的例子。例示性的間隔物單元(-Yy-)以式X-XII表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage71</formula>樹狀接頭在另一個實施方案中，接頭L可以為樹狀類型接頭(dendritictypelinker),其用于通過分支的多功能接頭模塊將超過一個藥物模塊共價附著于抗體(Sun等(2002)Bioorganic&MedicinalChemistryLetters12:2213-2215;Sun等(2003)Bioorganic&MedicinalChemistry11:1761-1768)。樹狀接頭能增加藥物與抗體的摩爾比，即載荷，它與ADC的效能相關。如此，如果半胱氨酸改造抗體僅攜帶一個反應性半胱氨酸硫醇基團，那么可以通過樹狀接頭附著眾多藥物模塊。分支的樹狀接頭的例示性實施方案包括2,6-雙(羥甲基)-對甲酚和2,4，6-三(羥曱基)-酚樹狀聚物單元(dendrimerunit)(WO2004/01993;Szalai等(2003)J.Amer.Chem.Soc.125:15688-15689;Shamis等(2004)J.Amer.Chem.Soc.126:1726-1731;Amir等(2003)Angew.Chem.Int.Ed.42:4494-4499)。在一個實施方案中，間隔物單元為分支的雙(羥曱基)苯乙烯(BHMS),它可以用于摻入和釋放眾多藥物，其具有如下結構CH2(OC)n——D其包含2-(4-氨基亞千基)丙烷-l，3-二醇樹狀聚物單元(WO2004/043493;deGroot等(2003)Angew.Chem,Int.Ed.42:4490-4494),其中Q為-C,-C8烴基(烷基，alkyl),-O-(C,匿Q烴基(烷基,alkyl))、-卣素、-硝基或-氰基;m為范圍0-4的整數;n為0或l;且p范圍為l-4。式I抗體-藥物偶聯物化合物的例示性實施方案包括XIIIa(MC)、XIIIb(val-cit)、XIIIc(MC-val-cit)、和XIIId(MC-val-cit-PAB):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>式Ia抗體-藥物偶聯物化合物的其它例示性實施方案包括XIVa-e:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage72</formula>其中R獨立為H或C廣C6烴基(烷基，alkyl);且n為l-12。在另一個實施方案中，接頭具有反應性官能團，該反應性官能團具有與存在于抗體上的親電子基團具有反應性的親核基團。抗體上有用的親電子基團包括但不限于醛和酮羰基。接頭的親核基團的雜原子能與抗體上的親電子基團反應并且與抗體單元形成共價鍵。接頭上有用的親核基團包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯和芳基酰肼。抗體上的親電子基團提供了用于附著接頭的便利位點。典型地，可以通過在兩個或更多氨基酸和/或肽片段之間形成肽鍵來制備73XIVbXIVcXIVdXIVe一(CH2CH20)n—肽類型的接頭。例如，可以按照肽化學領域眾所周知的液相合成法(E.Schr6der和K.Liibke(1965)"ThePeptides",巻l,pp76-136,AcademicPress)來制備此類肽鍵。可以通過包括間隔物、延伸物和氨基酸單元的反應的任意組合或順序來裝配接頭中間體。間隔物、延伸物和氨基酸單元可以采用本質上為親電子、親核或游離基的反應性官能團。反應性官能團包括但不限于羧基、羥基、對硝基苯基碳酸根、異硫氰酸根和離去基團，諸如O-曱磺酰基、O-曱苯磺酰基、-Cl、-Br、-I;或馬來酰亞胺。在另一個實施方案中，接頭可以用調節溶解性或反應性的基團取代。例如，帶電荷的取代基，諸如磺酸根(-S(V)或銨可以增加試劑的水溶性并且有利于接頭試劑與抗體或藥物模塊的偶聯反應，或有利于Ab-L(抗體-接頭中間體)與D的偶聯反應或D-L(藥物-接頭中間體)與Ab的偶聯反應，這取決于用于制備ADC的合成途徑。4妻頭試劑可以使用多種雙功能接頭試劑來制備包含抗體和auristatin的偶聯物，諸如N-琥珀酰亞氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環己烷-l-羧酸酯(SMCC),亞氨基^Ut(IT),亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對-疊氮苯曱酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如l，5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。對本發明的抗體藥物偶聯物有用的接頭試劑包括但不限于BMPEO、BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo醫KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、及SVSB(琥珀酰亞氨基-(4-乙烯基砜)笨曱酸酯)；并且包括雙馬來酰亞胺試劑DTME、BMB、BMDB、BMH、BMOE、1,8-雙-馬來酰亞氨基二甘醇(BM(PEO)2)和l,ll-雙-馬來酰亞氨基三甘醇(BM(PEO)3),它們可購自PierceBiotechnology,Inc.、ThermoScientific(Rockford,IL)、及其它試劑供應商。雙馬來酰亞胺試劑容許將抗體的半胱氨酸殘基的游離硫醇基團按照依次或同時的方式附著至含硫醇藥物模塊、標記物或接頭中間體。除馬來酰亞胺外的其它與抗體、奈莫柔74比星(nemorubicin)代謝物和類似物藥物模塊、或接頭中間體的硫醇基團具有反應性的官能團包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡咬基二硫化物、異氰酸根和異硫氰酸根。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>還可以通過其它商業來源獲得或按照下列文獻中所述的規程合成有用的接頭試劑Toki等(2002)J.Org.Chem.67:1866-1872;Walker,M.A.(1995)丄Org.Chem.60:5352-5355;Frisch等(1996)BioconjugateChem,7:180-186;US6214345;WO02/088172;US2003130189;US2003096743;WO03/026577;WO03/043583;和WO04/032828。具有馬來酰亞胺延伸物和對氨基芐基氨基曱酰基(PAB)自我犧牲間隔物的例示性纈氨酸-瓜氨酸(val-cit或vc)二肽接頭試劑具有如下結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>具有馬來酰亞胺延伸物單元和PAB自我犧牲間隔物單元的例示性phe-lys(Mtr，單-4-曱氧基三苯曱基)二肽接頭試劑可以按照Dubowchik等(l"7)TetrahedronLetters,38:5257-60所述制備且具有如下結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage75</formula>例示性的藥物-接頭中間體包括:MC-val-cit匿PAB-MMAFMC-val-cit-PAB-MMAEMC-MMAEMC-MMAF本發明的例示性抗體-藥物偶4關物化合物包括oAb-MC-vc-PAB-MMAFAb-MC-MMAEAb-MC畫MMAF其中Val為纈氨酸；Cit為瓜氨酸；p為l、2、3或4;且Ab為半胱氨酸改造抗MUC16抗體。半胱氨酸改造抗MUC16抗體-藥物偶聯物的制備可以通過數種途徑，采用本領域技術人員公知的有機化學反應、條件和試劑來制備式I的ADC,包括(1)使半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸基團與接頭試劑反應，從而通過共價鍵形成抗體-接頭中間體Ab-L，隨后與活化的藥物模塊D反應；和(2)使藥物模塊的親核基團與接頭試劑反應，從而通過共價鍵形成藥物-接頭中間體D-L，隨后與半胱氨酸改造抗體的半胱氨酸基團反應。偶聯方法(1)和(2)可以與各種半胱氨酸改造抗體、藥物模塊和接頭一起使用以制備式I的抗體-藥物偶聯物。抗體半胱氨酸硫醇基團為親核性的并且能夠與接頭試劑和藥物-接頭中間體上的親電子基團反應而形成共價鍵，所述親電子基團包括(i)活性酯類，諸如NHS酯類、HOBt酯類、卣代曱酸酯類和酸性氯化物類；(ii)烴基和千基卣化物，諸如鹵代乙酰胺類；(iii)醛類、酮類、羧基和馬來酰亞胺基團；和(iv)通過碌^化物交換的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。藥物模塊上的親核基團包括但不限于胺、硫醇、羥基、酰肼、肟、肼、縮氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼基團，它們能夠與接頭模塊和接頭試劑上的親電子基團反應而形成共價一建。可以如下使半胱氨酸改造抗體變成反應性的以便偶聯接頭試劑，即用還原劑，諸如DTT(Cleland氏試劑，二硫蘇糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)處理(Getz等(1999)Anal.Biochem.273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MA)，接著再氧化以再形成鏈間和鏈內二硫鍵(實施例2)。例如，在37。C用約50倍過量的TCEP將在CHO細胞中表達的全長半胱氨酸改造的單克隆抗體(ThioMab)還原3小日于以還原半胱氨酸和谷胱甘肽加合物中的二硫鍵，其可以在新引入的半胱氨酸殘基與存在于培基中的半胱氨酸之間形成。此部分還原破壞鏈間二硫鍵但不破壞鏈內二硫鍵，接著可進行滲濾。用10mM乙酸鈉，pH5稀釋還原后的ThioMab并且加載至10mM乙酸鈉，pH5中的HiTrapS柱上并且用含有0.3M氯化鈉的PBS洗脫。在室溫用稀(200nM)石危酸銅(CuS04)水溶液重新建立親本Mab中存在的半胱氨酸殘基之間的二石克鍵過夜。或者，脫氫抗壞血酸(DHAA)是有效的氧化劑，用于在半胱氨酸加合物的還原性切割之后重新建立半胱氨酸改造抗體的鏈內二硫化物基團，如SDS-PAGE分析所證明的。可以使用本領域公知的其它氧化劑，即氧化性試劑和氧化性條件。環境空氣氧化也是有效的。這種溫和的部分再氧化步驟有效地高保真度地形成鏈內二硫鍵并保護新引入的半胱氨酸殘基的硫醇基團。加入相對于抗體約3倍過量的(相對于新引入的半胱氨酸殘基約1.5倍過量的)藥物-接頭中間體，例如MC-vc-PAB-MMAE，混合并且在室溫;改置約l小時，以進行偶3關并形成3A5抗MUC16抗體-藥物偶聯物。將偶聯混合物進行凝膠過濾、加載和通過HiTrapS柱洗脫以除去過量的藥物-接頭中間體和其它雜質。附圖6a顯示了制備由細胞培養物表達的用于偶聯的半胱氨酸改造抗體的一般方法。當細胞培養基含有半胱氨酸時，可以在新引入的半胱氨酸氨基酸和培養基中的谷胱甘肽或半胱氨酸之間形成二硫化物加合物。必須將半胱氨酸加合物(描繪為圖6a中的例示性ThioMab(左)中的環)還原以生成具有偶聯反應性的半胱氨酸改造抗體。將半胱氨酸加合物，可能還有多個鏈間二硫鍵用還原劑諸如TCEP還原性切割以產生還原形式的抗體。在部分氧化條件下，用硫酸銅、DHAA、或暴露于環境氧而重新形成配對半胱氨酸殘基之間的鏈間二硫鍵。新引入的、改造的和未配對的半胱氨酸殘基仍然可用于與接頭試劑或藥物-接頭中間體反應而形成本發明的抗體偶聯物。哺乳動物細胞系中表達的ThioMabs通過-S-S-鍵形成產生外部偶聯至改造的Cys的Cys加合物。因此，純化的ThioMabs如實施例2所述通過還原和再氧化規程處理以產生反應性ThioMabs。這些ThioMabs用于偶聯含有馬來酰亞胺的細胞毒性藥物、熒光團和其它標記物。圖6b顯示了還原的抗體的再氧化的時間過程。將曲妥單抗還原并在陽離子交換柱上于pH5.5純化。頂圖a顯示了還原的抗體在時間為O分鐘時的反相圖語。保留時間7分鐘處的三個峰(從左到右)為輕鏈(LC),重鏈(HC)和少量未完全還原的HC+LC。容許純化的、還原的抗體在pH7再氧化，并采集等分試樣，作為時間的函數。中圖b顯示了在90分鐘內大部分輕鏈和重鏈被78再氧化以形成含有2條LC和2條HC的完整抗體(大約保留時間10分鐘峰)。在180分鐘反應時間點沒有看到另外的完整抗體形成(底圖c)。對半胱氨酸改造的抗體藥物偶聯物反應的分析顯示了相對于通過還原鏈間或鏈內二硫鍵，接著(標準ADC)與硫醇反應性藥物接頭中間體偶聯而制備的抗體藥物偶聯物降低的異質性。圖7a顯示了標準嵌合3A5與MC-vc-PAB-MMAE的偶聯產物的HIC(疏水相互作用層析)分析(頂)。HIC分析基于每個抗體的藥物數目將ADC分開。得到了每個抗體的藥物數目不同的多組ADC的分布，其中ADC攜帶O個(12%)、l個(3%)、2個(43%)、3個(3%)、4個(32%)、6個(6%)和8個(1%)個MMAE每個3A5抗體。在每個組內存在假定的別的異質性，即MMAE在八個鏈間二硫鍵的任一個處連接至3A5。這些種類中的一些可通過質譜來檢測，但是無法通過HIC層析來解析。比較而言，圖7a還顯示了半胱氨酸改造的嵌合3A5與MC-vc-PAB-MMAE的偶聯產物的HIC分析(底)。得到了異質性較低的產物(ADC混合物)分布和較低的平均藥物負荷值(p,平均藥物/抗體)。產物混合物主要是單一種類，即2個MMAE每個3A5(60%)，其中藥物附著于重鏈中的每一A117C半胱氨酸突變位點。不完全的反應導致約32%的一個MMAE每個抗體和7。/。的為偶聯抗體。檢測不到負荷更高的ADC。圖7b顯示了圖7a中分析條件下大規模thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE偶聯反應的的HIC(疏水相互作用層析)層析圖，其中平均藥物負荷值為1.9個MMAE每個thioch3A5。圖8a顯示了還原和去甲基化后標準(親本)嵌合3A5與MC-vc-PAB-MMAE的偶聯產物的質譜分析，顯示了結合至重鏈(HC)和輕鏈(LC)的藥物的相對量(頂)。大約一半的輕鏈偶聯有一個藥物。重鏈具有O個、l個、2個、和3個藥物的分布。在每個可檢測質量內存在^Jt的別的異質性，即MMAE在鏈間二硫鍵的任一個處連接至3A5。比較而言，圖8a還顯示了半胱氨酸改造的嵌合3A5與MC-vc-PAB-MMAE的偶聯產物的質譜分析(底)。如預期的，輕鏈不攜帶MMAE。大多數重鏈偶聯有一個MMAE,其經由A117C半胱氨酸突變位點，如圖8b和8c中所描繪的。標準和thioADC在LC/MS分析前去糖基化和還原。標準ADC的解巻積質譜(頂，圖8a)展示了輕鏈上零個或一個藥物的種類及重鏈上零個、一個、兩個、或三個藥物的種類，而thioADC只展示了重鏈上一個藥物的種類，指示thioADC的更多同質性，正如預79期的。抗體中用于細胞毒性藥物附著至TDC-Fab的區域的定位作圖。頂圖(a)顯示了MC-vc-PAB-MMAE-偶聯Fab的還原的、變性的輕鏈和重鏈部分的280nm吸光譜。中圖(b)部分中輕鏈和底圖(c)部分中重鏈的解巻積質量與只在重鏈上標記的藥物一致。在(c)中觀察到的質量24189源自MMAE-C02的損失(減去762道爾頓)，這是該藥物的特征性碎裂。圖8c顯示了肽圖-TDC-Fab中含有細胞毒性藥物的肽的筌定。未偶聯的(頂圖a)和已偶聯的(中圖b)Thio-3A5和TDC的肽圖是自馬來酰亞氨基化的純化的Fab的胰蛋白酶消化物生成的。用MC-vc-PAB-MMAE標記的肽具有升高的疏水性，而且預期在層析圖中較晚洗脫。四種藥物偶聯肽(用*標記的)在梯度結束時洗脫。它們還能通過在所有含有MC-vc-PAB-MMAE的質譜中觀察到的特征性內部來源的石卒裂離子(in-sourcefragmentationion)(m/z718.5)而被鑒定為含有細胞毒性藥物的肽。底圖(c)顯示了自未偶聯的和已偶聯的消化物提取的離子層析圖的覆蓋圖。最強的峰與偶聯物消化物的晚洗脫峰一致。所有四個峰被鑒定為位于Fab-HC中第1M位中突變的半胱氨酸附近的完全或部分胰蛋白酶切割片段。29.05分鐘處主峰中的m/z離子解巻積而得出質量3962道爾頓，這是肽1^099-120+l藥物的預期質量。含有藥物的肽質沒有定位至該蛋白質的任何其它區域。頂圖(a)中用箭頭標記的峰是馬來酰亞胺標記的肽HC99-120。造的)ADC。由于鏈間二硫鍵的損失，標準ADC顯示出多個種類，如圖9a中所描繪的。圖9b比4交了通過標準Hu3A5-VC-MMAE和兩種ThioHu3A5-VC-MMAE制備物的串聯液相層析和質譜(LC-MS)檢測到的主要種類。在層析分析前，將樣品或是用DTT處理(用以還原性切割二硫鍵)或是保持完整。用常規方法制備的Hu3A5-VC-MMAE產生廣泛的種類分布，反映了偶聯過程的異質性和鏈間二硫鍵的損失。比較而言，ThioHu3A5-VC-MMAE的兩種制備物都近乎同質得多，而且檢測到的種類代表或是完整的未偶聯抗體(攜帶所有正常二硫鍵)或是在改造的半胱氨酸處(沒有在其它位點)與接頭-藥物偶聯的抗體。篩選方法
技術領域：
：本發明的又一個實施方案致力于測定懷疑含有MUC16/CA125/0772P多肽的樣品中MUC16/CA125/0772P多肽的存在的方法，其中該方法包括使所述樣品暴露于結合MUCi6/CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物，并測定半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物與樣品中MUC16/CA125/0772P多肽的結合，其中存在有所述結合表明樣品中存在MUC16/CA125/0772P多肽。任選地，所述樣品可包含懷疑表達MUC16/CA125/0772P多肽的細胞(其可以是癌細胞)。所述方法中所采用的半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物可任選地可纟企測地標記、附著至固體支持物、等等。本發明的另一個實施方案致力于診斷哺乳動物中腫瘤的存在的方法，其中該方法包括(a)使包含得自哺乳動物的組織細胞的測試樣品接觸結合CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物，并(b)檢測半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物與測試樣品中的CA125/0772P多肽之間復合物的形成，其中形成了復合物表明哺乳動物中存在腫瘤。任選地，半胱氨酸改造抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物是可檢測地標記的、附著至固體支持物的、等等，和/或組織細胞的測試樣品得自懷疑具有癌性腫瘤的個體。體外細胞增殖測定法本發明的一個實施方案致力于抑制表達MUC16多肽的細胞生長的方法，其中該方法包括使細胞接觸針對MUC16多肽的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物，引起對表達MUC16的細胞生長的抑制。所述細胞可以是癌細胞，而且半胱氨酸改造的抗體或其抗體藥物偶聯物對MUC16多肽的結合引起表達MUC16多肽的細胞死亡或抑制表達MUC16多肽的細胞的增殖。一般而言，通過下列步驟測定抗體-藥物偶聯物(ADC)的細胞毒性或細胞生長抑制活性使表達MUC16多肽的哺乳動物細胞在細胞培養基中暴露于ADC;將細胞培養約6小時-約5天的時間；和測定細胞存活率。對于細胞增殖測定法有用的哺乳動物細胞包括(1)表達MUC16多肽的細胞系OVCAR-3;(2)改造成在其細胞表面上穩定表達MUC16多肽一部分的PC3衍生的細胞系多肽的親本PC3細胞系；和(4)不表達MUC16多肽但攜帶用于驅動外源MUC16表達的載體的PC3細胞系(PC3/neo)。基于細胞的體外試驗用于測定存活率(增殖)、細胞毒性和本發明ADC的程序性細胞死亡誘導(胱天蛋白酶活化)。通過細胞增殖試驗測定抗體-藥物偶聯物的體外功效(附圖lO和ll,實施Madison,WI)基于鞘翅目(Co/eop,era)焚光素酶(US5583024;US5674713;US5700670)的重組表達的同質性試驗方法(homogeneousassaymethod)(Mendozaetal(2002)CancerRes.62:5485-5488)。該細胞增殖試驗基于對存在的ATP進行定量測定了培養物中存活細胞的數量，其中存在的ATP為代謝活性細胞的指示劑(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;US6602677)。來自體外細胞增殖測定法的結杲顯示于圖lO和ll，并證明了每一種半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物在OVCAR-3和PC3/MUC16細胞(即在細胞表面上表達MUC16多肽的細胞)中引起顯著水平的細胞死亡，而在親本PC3和PC3/neo細胞(在細胞表面上不表達MUC16多肽)中沒有^見察到任何抗體的顯著細胞殺傷。這些數據證明了所測試的偶聯物能夠結合在細胞表面上表達的MUC16多肽并在體外引起那些細胞的死亡。藥動學-血清清除和穩定性通過單個靜脈內推注劑量注射入Sprague-Dawley大鼠后測量抗體和藥物偶聯物的血清濃度，分析了抗MUC16抗體-藥物偶聯物的體內部署。攜帶至少一個細胞毒性藥物的抗體-藥物偶聯物的濃度以ELISA測量，其使用MUC16胞外結構域(ECD)蛋白進行捕捉及使用抗MMAE和辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗小鼠Fc抗體進行檢測。血清中的總Ch3A5和ThioCh3A5濃度以ELISA測量，其使用MUC16ECD進行捕捉及使用抗人FcHRP進行檢測。此測定法測量任何抗MUC16抗體，有和無偶聯的MMAE均可。這些測定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀釋度1:10。這些測定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀釋度1:10。使用具有IV推注輸入、一階消除(firstorderelimination).和宏觀速率常數(macro-rateconstant)的兩隔室片莫型(Model8,WinNonlinProv.5.0.1,PharsightCorporation,MountainView,CA)分析了來自82每只動物的血清濃度時間數據。擬合的整體優度基于預測估值、預測的標準誤差、和主要和次要參數的變異系數的百分比，以及對觀察的和預測的濃度-時間數據之間的參差圖的審查。個別主要PK參數包含分別與CX和P階段有關的零-時間截距(A和B),及微-速率常數(micro-rateconstants)(cx和(3)。使用了以下建模選項使用WinNonlin來確定初始估值；通過預測濃度平方的倒數(l/f)來對濃度加權；使用Nelder-Mead最小化算法。在大鼠中進行的28天藥動學分析的結果顯示于圖12。給大鼠服用0.5mg/kg體重的thioch3A5-VC-MMAE或ch3A5-VC-MMAE。在服藥后5分鐘、l小時、6小時、24小時、及2,3，4,8，11,15,21,和28天自大鼠收集血清。就總抗體而言或就藥物-抗體偶聯物而言，thioch3A5-VC-MMAE顯示出體內清除的較慢動力學。此行為對于改善治療惡性腫瘤或其它病癥的過程中對治療劑的暴露，同時降低細胞毒性藥物經由快速清除途徑(包括代^t)清除的潛在有害效應可能是有利的。在急性毒性大鼠模型中評估半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物的安全性。通過用ADC處理雌性Sprague-Dawley大鼠并隨后4企查和分析對各種器官的影響來調查ADC的毒性。基于總體觀察(體重)、臨床病理學參數(血清化學和血液學)和組織病理學，可觀察、表征、和測量ADC的毒性。發現在等同的劑量水平，與半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物相關的急性毒性比相應的標準抗體-藥物偶聯物少。通過在第l天單次注射stdch3A5-VC-MMAE(24.19mg/kg=1934mg/m2),thioch3A5-VC-MMAE(49.99mg/kg=1934mg/m2),和乂t照J某介物，在青年雌性大鼠(100-125g)中進行了12天急性毒性研究。stdch3A5指稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而thioch3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。每天測量體重。在第5天和第12天進行臨床化學、血清酶和血液學分析；以帶組織學評估的完全尸檢結束。毒性信號包括體重減輕的臨床觀察。通過血清中升高的肝酶來測量肝毒性，包括天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、和g-谷氨酰轉移酶(GGT)。通過白細胞(主要是粒細胞(嗜中性粒細胞))和/或血小板的消減及淋巴樣器官累及(即萎縮或凋亡活性)動物毒性83來觀察血液淋巴毒性。發現，與用i某介物處理的動物相比，半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物不引起血清AST水平或循環血小板或嗜中性粒細胞水平的可檢測變化。這些發現呈現于圖13。相反，標準抗MUC16抗體-藥物偶聯物在相同的細胞毒性藥物劑量和在抗體劑量的一半引起瞬時AST升高及循環嗜中性粒細胞和血小板消減(在第5天觀察到)。還觀察到血清AST和GGT的升高。半胱氨酸改造的抗體偶聯技術表現出改善抗體-藥物偶聯物在嚙齒類模型中的安全性。在大鼠中，單劑16.6mg/kg標準抗MUC16ADC(等同于1500嗎/1112藥物暴露)在第5天引起循環嗜中性粒細月包和其它白血球的明顯消減(服藥后四天；圖13)，接著在第12天發生補償性反彈。此標準ADC劑量還導致肝酶天冬氨酸轉氨酶血清水平的輕度升高(AST;圖13)和瞬時體重減輕(圖14)。當劑量增加50%時(24.5mg/kgADC;2250嗎/m2MMAE)，AST水平受到更加深刻的影響。在該劑量，六只大鼠中有三只未能存活至研究結束(第12天)。相反，36.4mg/kg的thio抗MUC16ADC(等同于1500(iig/m2藥物暴露)沒有產生不利效果，所有參數與用i^某介物處理的動物本質上相同。一劑68.6mg/kg的thio抗MUC16ADC(2820嗎/1112藥物)產生與使用四分之一該劑量的標準抗MUC16抗體-藥物偶聯物觀察到的毒性幾乎等同的毒性。重要的是，雖然最高的thio抗MUC16ADC劑量(100.8mg/kg;4150嗎/1112藥物)確實產生了明顯的效果，但是不利效果的總體情況與在較高的標準抗MUC16ADC劑量(24.5mg/kgADC;2250嗎/m2MMAE)所觀察到的相當類似。在使用嵌合偶聯物進行的預備研究中觀察到相同的趨勢。認為相對于只服用媒介物的動物服用ADC后動物的體重減輕或體重變化是全身或局部毒性的總體和一般指標。圖14顯示了12天里的體重(克)變化。接受半胱氨酸改造的偶聯物的大鼠的體重以與用々某介物處理的動物相同的速率增加，而接受標準抗體-藥物偶聯物的大鼠經歷瞬時體重減輕或體重增加延遲。還在獼猴中評估標準和thio抗MUC16抗體-藥物偶聯物的安全性。雖然大鼠和猴類都表達受到3A5抗體識別的MUC16,但是獼^f吳抗原在一級序列方面與人抗原更加相似。在竟爭性結合測定法中，單抗3A5對CA125的結合受到相似濃度的人和猴MUC16ECD蛋白質的抑制(IC50分別為0.76nM和1.89nM),但是來自大鼠MUC16ECD的竟爭效率低得多(IC50為13.5nM)。大鼠和獼猴都對抗體-MMAE偶聯物敏感。在獼猴中進行的初步研究本質上回應了大鼠中的發現。在服用標準和thio抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC的靈長類動物中最顯著的不利事件是可逆的嗜中性粒細胞降低。雖然標準抗MUC16-MC-vc-PAB-MMAEADC在1200昭/1112藥物(5.9mg/kg抗體)的藥物暴露誘導了明顯降低，但是thioADC在1200嗎/n^藥物(12.8mg/kg抗體)沒有產生明顯的不利事件，嗜中性粒細胞計數緊緊跟蹤假處理的動物(圖17)。動物在第l天和第22天服藥。第22天的嗜中性粒細胞水平在第二劑之前(pre-seconddose)。將劑量倍增至25.6mg/kg;2400嗎/1112藥物導致嗜中性粒細胞計數降低，其是完全可逆的。甚至更高劑量的thio抗MUC16ADC(38.4mg/kg;3600嗎/1112藥物)沒有產生嗜中性粒細胞減少之外的明顯影響，嗜中性粒細胞減少比在中等劑量水平更加明顯但仍然是可逆的。重要的是，在已知表達MUC16的器官(包括角膜、肺、輸印管、和子宮)中沒有觀察到毒性。在服用TDC的猴中唯一值得注意的組織病理學發現是最低限度至輕度的骨髓髓細胞生成增加和最低限度至輕度的胸腺淋巴消減，這與嗜中性粒細胞降低一致且指示再生應答。這些結果證明了在臨床前模型中，thioADC比標準ADC更安全，即使在細胞毒性藥物劑量(及等同(ig/m"的基礎上比較時。體內活性測定法通過將癌細胞的同種異體移植物或異種移植物植入嚙齒類動物中并用ADC處理肺瘤，在體內測量了半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物的功效。預期會有各種結果，這取決于細胞系、ADC對癌細胞上存在的受體的抗體結合的特異性、劑量給藥方案、和其它因素。使用表達中等水平MUC16的轉基因外植體小鼠模型測量ADC的體內功效。將受試者用ADC處理一次并監觀'J3-6周以測量腫瘤倍增時間、細胞殺傷對數、和腫瘤縮小。進行跟蹤劑量-響應和多劑量實馬全。圖15和16顯示了與標準偶聯物相比，半胱氨酸改造的抗MUC16藥物偶聯物針對移植入雌性SCID小鼠乳房脂肪墊中的OVCAR-3腫瘤細胞的活性。建立腫瘤，并容許其生長至150-200mr^體積(使用測徑器測量)，之后在第0天進行單次處理。使用測徑器依照公式V(mm3)=0.5AXB^則量腫瘤體積，其中A和B分別是長的和短的直徑。在腫瘤體積達到3000mrr^之前或者在腫瘤顯示出即將形成潰瘍的征候時，對小鼠施以安樂死。自每個實驗組(每組IO只小鼠)收集的數據表述為均值+SE。圖15顯示了6mg/kg劑量的stdhu3A5-VC-MMAE(328mg/m2藥物劑量)和thiohu3A5-VC-MMAE(150mg/m2藥物劑量)的相當的活性。圖16比較了嵌合偶聯物，施加1.5、3、和6mg/kg的劑量；半胱氨酸改造的和標準的偶聯物在每個劑量水平展現出相當的活性。數據以表的形式總結如下。圖15的表PR媒介物(PBS)0stdhu3A5-VC-PAB-MMAE8ThioHu3A5-VC-PAB-MMAE8*stdhu3A5指稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而ThioHu3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。圖16的表PRCR媒介物(PBS)00ADC緩沖液00stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE10stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE26stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE46thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE11thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE43thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE37*stdch3A5指稱作3A5的親本嵌合抗MUC16抗體，而thioch3A5指半胱氨酸改造的嵌合抗MUC163A5抗體。在每個IgG劑量水平，針對卯巢癌的移植物異種移植模型，thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE至少像stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE—才羊有活性，在1.5mg/kg(thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的MMAE劑量為35pg/m2，而stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的MMAE劑量為71[ig/m2)4是供部分功效，而在3mg/kg(69比141j_ig/m2MMAE)和6mg/kg(139比283嗎/m2MMAE)近乎完全消除鐘瘤。就MMAE劑量而言，thioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE的效力大約兩倍于stdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE。在任何劑量水平都沒有觀察到任一偶聯物的不利效果。治療方法CRmg/kg|ig/m2藥物/抗體0———063283.5061501.6mg/kgfig/m2藥物/抗體1.5713.■1141.162833,.11.5351,.53691,561391586本發明的另一個實施方案致力于治療性處理具有癌性腫瘤(其包含表達MUC16/CA125/0772P多肽的細胞)的哺乳動物的方法，其中該方法包括對哺乳動物施用治療有效量的結合MUC16/CA125/0772P多肽的半胱氨酸改造的抗體或其抗體藥物偶聯物，由此導致對腫瘤的有效治療性處理。本發明的另一個實施方案致力于治療或預防與改變的、優選升高的MUC16/CA125/0772P多肽表達或活性有關的細胞增殖性病癥的方法，該方法包括對需要此類治療的受試者施用有效量的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物。一種例示性的細胞增殖性病癥是癌癥。對細胞增殖性病癥的優選治療或預防可以是用半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物直接殺死表達MUC16/CA125/0772P多肽的細胞或抑制表達MUC16/CA125/0772P多肽的細胞生長或拮抗MUC16/CA125/0772P多肽的細胞生長增強活性的結果。本發明的又一個實施方案致力于使半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物結合表達MUC16/CA125/0772P多肽的細胞的方法，其中該方法包括在適合半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶if關物結合所細胞與所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物接觸并容許它們之間的結合。在優選的實施方案中，半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物是用對于定性和/或定量測定半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物結合細胞的位置和/或量而言有用的分子或化合物標記的。本發明的其它實施方案致力于半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物在制備藥物中的用途，所迷藥物可用于(i)癌癥或腫瘤的治療性處理或診斷性檢測，或(ii)細胞增殖性病癥的治療性處理或預防。本發明的另一個實施方案致力于抑制癌細胞生長的方法，其中所述癌細CA125/0772P多肽可以由癌細胞自身表達，或者由生成對癌細胞具有生長增強效應的多肽的細胞表達)，其中該方法包括使MUC16/CA125/0772P多肽與半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體藥物偶聯物接觸，由此拮抗MUC16/CA125/0772P多肽的生長增強效應，并繼而抑制癌細胞的生長，由此癌細胞的生長得到抑制。87本發明的另一個實施方案致力于治療性處理哺乳動物中的腫瘤的方法，效應，其中該方法包括對哺乳動物施用治療有效量的結合MUC16/CA125/0772P多肽的抗MUC16半胱氨酸改造的抗體或其抗體藥物偶聯物，由此拮抗所述MUC16/CA125/0772P多肽的生長增強效應并導致對腫瘤的有效治療性處理。抗體、其抗體片段、和其偶聯物識別釋放入胞外流體中的質膜MUC16蛋白的胞外表位。本發明進一步提供了使用抗體、抗體片段和偶聯物檢測、監測和治療惡性腫瘤(諸如乳腺癌或卵巢癌)的方法。本發明的抗體-藥物偶聯物(ADC)可用于治療各種疾病或病癥，例如特征為MUC16腫瘤抗原過表達的。例示性的疾患或過度增殖性病癥包括良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴樣惡性腫瘤。其它包括神經元的、神經膠質的、星形膠質細胞的、下丘腦的、腺體的、巨噬細胞的、上皮的、基質的、囊胚腔的、炎性的、血管發生性的和免疫學的(包括自身免疫性的)病癥。可以在具有腫瘤的高級靈長類和人體臨床試驗中進一步測試在動物模型和基于細胞的試驗中鑒定的ADC化合物。可以設計臨床試驗以便評價ADC與已知治療方案的組合的功效，所述的已知治療方案諸如包括已知化療劑和/或細胞毒性劑的放療和/或化療。一4殳而言，所治療的疾病或病癥為過度增殖性疾病，諸如癌癥。癌癥的實例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或'淋巴樣惡性腫瘤。更具體地說，這類癌癥包括卵巢癌；鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌，包括胃腸癌；胰腺腺癌、成膠質細胞瘤；宮頸癌；肝癌(livercancer);膀胱癌；肝細胞癌(hepatoma);乳腺癌；結腸癌；直腸癌；結直腸癌；子宮內膜癌或子宮癌；唾液腺癌；腎癌；前列腺癌、外陰癌；曱狀腺癌；肝癌(hepaticcarcinoma);肚門癌；陰莖癌和頭頸部癌。為了預防或治療疾病，ADC的適當劑量取決于如上述定義的所治療的疾病類型、疾病的嚴重程度和時程、給予所述分子是為了預防還是為了治療目的、先前的治療、患者的臨床病史和對抗體的反應以及主治醫師的判定。將所述的分子適當對患者給予一次或在一系列治療過程中給予。根據疾病類型和嚴重程度的不同，對患者給藥的分子的初始候選劑量約為l(ig/kg-1588mg/kg(例如O.1-20mg/kg)，例如，無論是通過一次或多次分開的給藥，還是通過連續輸注。典型的每日劑量可以在約lpg/kg-100mg/kg或更大的范圍，這取決于上述因素。對患者給予的典型的ADC的劑量在約O.l-約10mg/kg患者體重的范圍。為了在幾天或幾天以上時程中反復給藥，根據病情的不同，將治療持續至對疾病癥狀的所需抑制發生為止。典型的給藥方案包含給予約4mg/kg的起始負荷劑量，隨后給予約2mg/kg抗MUC16抗體的每周維持劑量。其它劑量方案也是有用的。該療法的進展易于通過常規技術和測定法(包括超聲成像)監測。抗體-藥物偶聯物的給藥可以通過適合于所治療疾病的任意途徑給予本發明的抗體-藥物偶聯物(ADC)。一般通過腸胃外途徑給予ADC,即輸注、皮下、腹膜內、肌肉內、靜脈內、真皮內、鞘內和硬膜外。藥物配制劑本發明的治療性抗體-藥物偶聯物(ADC)通常與藥學上可接受的腸胃外媒介物一起配制成單位劑量無菌可注射形式的藥物配制劑供腸胃外施用，即快速灌注(bolus)、靜脈內注射、腫瘤內注射。任選將具有所需純度的抗體-藥物偶聯物(ADC)與藥學上可接受的稀釋劑、載體、賦形劑或穩定劑混合(Remington'sPharmaceuticalSciences(1980)16thedition,Osol,A.Ed.)成凍干劑型或水溶液形式。可接受的稀釋劑、載體、賦形劑和穩定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，并且包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、擰檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基芐基銨；氯己雙銨；苯扎氯銨、千索氯銨；苯、丁醇或千醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基笨曱酸曱酯或對羥基苯曱酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(低于約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖類、二糖類和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬復合物(例如Zn-蛋白質復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN1^、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。活性藥物成分還可包載于例如通過凝聚技術或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統中(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術7>開于Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.Ed.(1980)。可以制備持續釋放制劑。持續釋放制劑的合適例子包括含有ADC的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是定型產品的形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酉旨)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)及聚-D—(—)_3—羥基丁酸。制劑包括某些適合于上述給藥途徑的制劑。可以便利地將制劑制成單位劑型(unitdosageform)并且可以通過制藥領域眾所周知的任意方法制備。藥物制備的各種才支術和圉己制一4殳在iem/"gto"SP/7arwace""ca/5We"c&s(MackPublishingCo.,Easton，PA)中找到。這類方法包括使活性組分與構成一種或多種輔助組分的載體混合的步驟。一般而言，通過均勻和緊密混合活性組分與液體載體或細粉固體載體或它們兩者，且然后，如果必要，使產物成形來制備產品。本發明的含水混懸液含有活性物質與適合于制備含水混懸液的賦形劑的混合。這類賦形劑包括懸浮劑，諸如羧曱基纖維素鈉、交聯羧甲纖維素、聚維酮、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠；和分散劑或濕潤劑，諸如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)、烯化氧與脂肪酸(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)的縮合產物、環氧乙烷與長鏈脂族醇(例如十七碳乙烯氧基鯨蠟醇)的縮合產物、環氧乙烷與來源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產物(例如聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯)。含水混懸液還可以含有一種或多種防腐劑，諸如對羥基苯曱酸乙酯或對羥基苯曱酸丙酯；一種或多種著色劑；一種或多種矯味劑；和一種或多種增甜劑，諸如蔗ADC的藥物組合物可以為無菌可注射制劑形式，諸如無菌可注射含水或油混懸液。可以按照本領域公知的方法，使用上述那些合適的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配制混懸液。無菌可注射制劑還可以為在無毒性非腸道可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸液，諸如在1,3-丁-二醇中的溶液或制備成凍干紛。在可以使用的可接受的媒介物和溶劑中有水、林格液和等滲氯化鈉溶液。此外，可以便利地將無菌非揮發油(fixedoil)用作溶劑或懸浮介質。為了這一目的，可以使用任意溫和的固定油(blandfixedoil),包括合成的單酸甘油酯或二脂酰甘油酯類。此外，諸如油酸這類脂肪酸同樣可以用于制備可注射制劑。可以與載體物質合并而產生單劑型(singledosageform)的活性組分的量將根據所治療宿主和特定給藥方式的不同而改變。例如，指定用于靜脈內輸注的水溶液可以含有約3-500嗎的活性組分/毫升溶液，以便可以以約30mL/'J、時的速率輸注適當的體積。適合于非腸道給藥的制劑包括含水和非水無菌注射溶液，其可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和賦予制劑與接受者的血液等滲的溶質；和含水和非水無菌混懸液，其可以包括懸浮劑和增稠劑。盡管因在腸中水解或變性而不贊成使用蛋白質治療劑的口服給藥，但是可以將適合于口服給藥的ADC制劑制備成分散單位，諸如含有預定量ADC的膠嚢、扁嚢劑或片劑。可以將制劑包裝在單劑或多劑容器內，例如密封的安瓿和小瓶內，并且可以將其在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，在使用前僅需要即刻添加無菌液體載體，例如水以便注射。由上述類型的無菌粉末、顆粒和片劑制備臨時注射的溶液和混懸液。優選的單位劑型為那些含有如上所述每日劑量或單位每曰亞劑量或其合適的部分的活性組分的劑型。本發明的組合物還可配制成脂質體；即由各種類型脂質、磷脂和/或表面活性劑構成的，可用于對哺乳動物遞送藥物的小嚢泡。與生物膜的脂質排列相似，脂質體的成分通常排列成雙層形式。含有抗體的脂質體可通過本領域已知方法來制備，諸如Epstein等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:3688;Hwang等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4030;美國專利No.4,485,045;4,544,545;5，013，556;WO97/38731中所迷。可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和91與脂質體偶聯(Martin等(1982)J.Biol.Chem.257:286-288)。任選在脂質體中包含化療劑(Gabizon等(1989)J.NationalCancerInst.81(19):1484)。聯合療法可以將本發明的抗體-藥物偶聯物(ADC)與第二種具有抗癌特性的化合物在藥物組合配制劑中聯合或作為聯合療法以給藥方案聯合。所述藥物組合配制劑或給藥方案中的第二種化合物優選具有對組合中的ADC的補充活性，使得它們彼此不會產生不利影響。所述第二種化合物可以為化療劑、細胞毒劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑和/或心臟保護劑。此類分子以對指定目的有效的量適當地聯合存在。含有本發明ADC的藥物組合物還可以具有治療有效量的化療劑，諸如微管蛋白形成抑制劑、拓樸異構酶抑制劑、DNA插入劑、或DNA結合劑。可以將其它治療方案與依照本發明所鑒定的抗癌藥施用聯合。聯合療法可以作為同時或序貫方案施用。當序貫施用時，可以以兩次或更多次施用來施用所述組合。聯合施用包括使用分開的配制劑或單一藥物配制劑的共施用，和任意次序的序貫施用，其中優選有一段時間所有活性劑同時發揮其生物學活性。在一個實施方案中，使用ADC的治療牽涉聯合施用半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物和一種或多種化療劑、治療性生物制品、或生長抑制劑，包括共施用不同化療劑雞尾酒樣混合物。化療劑包括但不限于紫杉烷類(諸如帕利他賽(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE⑧))、含鉑化合物(諸如卡鉑)、EGFR抑制劑(諸如erlotinib和gefitinib)、酪氨酸激酶抑制劑(諸如imatinib)、和蒽環類抗生素(諸如多柔比星或doxil)。要與半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物組合4吏用的治療性生物制品藥劑包括bevacizumab(Avastin⑧)或pertuzumab(Omnitarg,GenentechInc)。熟練從業人員可以按照制造商的說明書或憑經驗確定地使用此類化療劑的制備和劑量給藥方案。此類化療劑的制備和劑量給藥方案還記載于"ChemotherapyService",(1992)M.C.Perry編，Williams&Wilkins,Baltimore,Md。可以將ADC與如下抗激素化合物聯用；例如抗雌激素化合物，諸如他莫昔芬(tamoxifen);抗孕酮藥，諸如奧那司酮(onapristone)(EP616812);或抗雄激素藥，諸如氟他胺(flutamide),使用的劑量為這類分子的已知劑量。如果所治療的癌癥為激素非依賴性的癌癥時，患者可能預先進行過抗激素療法，并且在癌癥變成激素非依賴性后，可以對患者給予ADC(和任選本文所述的其它活性劑)。有益的是還對患者共同給予心臟保護劑(以便預防或減輕與所述療法相關的心肌機能障礙)或一種或多種細胞因子。除上述治療方案外，還可以對患者進行癌細胞的手術除去細胞和/或放療的治療。任何上述共施用的藥劑的合適劑量就是那些當前使用的劑量，而且可以由于新鑒定的藥劑和其它化療劑或治療的聯合作用(協同作用)而降低。聯合療法可以提供"協同作用"并且證實是"協同性，，的，即當一起使當活性組分為如下情況時可以獲得協同效應(1)共同配制和施用或在合并的單位劑量配制劑中同時投遞；(2)作為分開的配制劑交替或平行投遞；或(3)通過一些其它方案。當在交替療法中投遞時，在序貫施用或投遞所述化合物時，例如通過不同注射器中的不同注射，可以獲得協同效應。一般而言，在交替療法中，序貫地，即依序地施用每種活性組分的有效劑量，而在聯合療法中，一起施用兩種或更多活性組分的有效劑量。抗體-藥物偶聯物的代謝物此類產物相對于現有技術是新穎的且非顯而易見的而言。此類產物可源自例如所施用化合物的氧化、還原、水解、酰胺化、酯化、酶^3刀割、諸如此類。因而，本發明包括由如下方法生成的新穎的且非顯而易見的化合物，所述方法包括使本發明的化合物接觸哺乳動物一段時間，該時間足以產生本發明化合物的代謝產物。代謝產物典型地是如下制備的，即制備放射性標記的(例如"C或SH)ADC，以可檢測劑量(例如大于大約0.5mg/kg)將其胃腸外施用于哺乳動物，諸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴或人，容許足夠時間讓代謝發生(典型的是大約30秒至30小時)，并自尿液、血液或其它生物學樣品分離它的轉化產物。這93些產物是易于分離的，因為它們是帶標記物的(其它的通過使用能夠結合代謝物中幸存的結合表位的抗體來分離)。代謝物結構以常規方式來測定，例如通過MS、LC/MS或NMR分析。一般而言，代謝物的分析是以與本領域4支術人員公知的常規藥物代謝研究相同的方式進行的。轉化產物在用于本發明ADC化合物的治療性劑量給藥的診斷測定法中是有用的，只要沒有在體內在其它情況中找到它們。制品在本發明的另一個實施方案中，提供了含有用于治療上述病癥的物質的制品或"試劑盒'，。所述的制品包含容器和在容器上或與其相連的標簽或包裝說明書。包裝插頁可以指通常包括在治療用產品商品化包裝中的說明書，它包含有關此類治療用產品使用的適應癥、用法、劑量、施用、禁忌和/或警告信息。合適的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包等，容器可以由各種材料，諸如玻璃或塑料形成。在一個實施方案中，制品包括容器和裝在該容器內的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體或其抗體-藥物偶聯物的配制劑。所述制品可進一步任選地包含貼在容器上的標簽或包括在容器內的包裝插頁，其指出所述組合物用于肺瘤的治療性處理或診斷性檢測的用途。裝有配制劑的容器有效存儲和投遞治療劑，而且可以容納有效治療疾病的抗體-藥物偶:f關物(ADC)組合物并且可以具有無菌存取口(例如容器可以為靜脈用溶液袋或具有可刺入皮下注射針頭的塞的小瓶)。標簽或包裝說明書表示配制劑用于治療選擇的疾病，諸如癌癥。或者或另外，所述制品可以進一步含有第二(或第三)容器，該容器包含藥學上可接受的緩沖劑，諸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸緩沖鹽水、林格液和葡萄糖溶液。它可以進一步包括從商業和使用者角度而言需要的其它物質，包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。提供以下實施例僅用于例示目的，而非意圖以任何方式限制本發明的范圍。通過述及將本說明書中引用的所有專利和參考文獻完整收入本文。實施例除非另有說明，實施例中提及的商品化試劑依照制造商的說明書使用。下文實施例和整篇說明書中以ATCC編號所鑒別的那些細胞的來源是美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。實施例l:抗MUC163A5抗體的制備人源化和嵌合3A5抗Muc163A5抗體(圖3和4)是依照WO2007/001851制備的，通過述及收錄其序列和抗體。輕鏈氨基酸是依照Kabat(Kabatetal"S叫uencesofproteinsofimmunologicalinterest,(1991)5thEd.,USDeptofHealthandHumanService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)編號的。重鏈氨基酸是依照Eu編號系統(Edelmanetal(1969)Proc.Natl.AcadofSciences63(1):78-85)編號的，除了注釋為Kabat系統的地方。使用單字母氨基酸縮寫。表達并純化人源化(thiohu)和嵌合(thioch)半胱氨酸改造的抗MUC163A5單克隆抗體(為A117C變體)，包括兩個實施方案。thiohu抗MUC16HCA117C3A5:MW=144834.84;pl=8.28;pi(氧化的C)二8.79;長度=1320;消光系數(280)=1.61。重鏈446aa;MW:48952.23,pl:8.55,pl(氧化的c):9.12,消光系數(280):1.70;潛在信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在計算前裁剪掉。長度=19;DNA起始位置987,DNA纟冬止位置2324,圖l,SEQIDNO:l。輕鏈214aa;MW:23483.20,pl:6.71,pl(氧化的c):6.72,消光系數(280):1.43;潛在信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在計算前裁剪掉。長度=19;DNA起始位置7103,DNA終止位置7744，圖l，SEQIDNO:2。thioch抗MUC16HCA117C:MW二145118.9;pl=7.99;pI(氧化的C)二8.44;長度=1320;消光系數(280)=1.59。重鏈446aa;MW:49236.50,pl:8.29，pl(氧化的c):8.85，消光系數(280):1.66;潛在信號序列(MGWSCIILFLVATATGAYA)在計算前裁剪掉。長度=19;DNA起始位置987，DNA會冬止位置2324,圖2,SEQIDNO:3。輕《連214aa;MW:23340.96,pl:6.71,pl(氧化的c):6.72，消光系數(280):1.44;潛在信號序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)在計算前裁剪掉。長度=19;DNA起始位置7103,DNA終止位置7744,圖2，SEQIDNO:4。實施例2:半胱氨酸改造的抗MUC16抗體的制備，供通過還原和再氧化進行的偶聯用由于細胞培養條件，在CHO細胞中表達的全長半胱氨酸改造的抗MUC16單克隆抗體(ThioMab)在改造的半胱氨酸上攜帶半胱氨酸加合物(胱氨酸)或谷胱甘酰化(glutathionylated)。為了解放改造的半胱氨酸的反應性硫醇基團，將ThioMab溶解在約pH8.0的500mM硼酸鈉和500mM氯化鈉中并用約50-100倍過量的lmMTCEP(鹽酸三(2-羧乙基)膦；Getzetal(1999)Anal.Biochem.Vol273:73-80;SoltecVentures,Beverly,MA)于37。C還原約l-2小時。或者，可使用DTT作為還原劑。通過非還原SDS-PAGE或通過變性反相HPLCPLRP柱層析監測鏈間二碌"建的形成。將還原的ThioMab(圖6a)稀釋并加載到10mM乙酸鈉pH5中的HiTrapS柱上，并用含0.3M氯化鈉的PBS洗脫。將洗脫的還原的ThioMab用pH7的2mM脫氫抗壞血酸(dhAA)處理3小時，或用2mM硫酸銅(CuS04)水溶液于室溫處理過夜。環境空氣氧化也可以是有效的。通過SephadexG25樹脂上的洗脫來更換緩沖液，并用含lmMDTPA的PBS洗脫。根據溶液在280nm的吸光度來測定還原的抗體濃度，通過與DTNB(Aldrich,Milwaukee,Wl)反應并測定412nm的吸光度來測定硫醇濃度，由此檢查硫醇/抗體值。標準3A5抗體的三種主要糖型的理論質量為147407，147568和147731Da。標準3A5抗體的解巻積質譜中的觀察質量為147410，14乃69和147734Da.,與預期的理論質量極好地吻合。thio3A5抗體的三種主要糖型的理論質量為147469,147631和147793Da。thio-3A5抗體在解巻積質譜中的觀察質量(異質的且溶解不佳的)為大約147774,147904和148061。異質性是由于在兩個新引入的半胱氨酸上存在加帽基團(通常是半胱氨酸或谷胱甘肽)的混合物。在具有延伸的質量范圍的TSQ量子三聯四極質語儀(ThermoElectron,SanJoseCalifornia)上實施了液相層析/質譜分析。將樣品在加熱至75。C的PRLP-S，1000A,微孔柱(50mmx2.1mm,PolymerLaboratories,Shropshire,UK)上層析。使用30-40。/oB的線性梯度(溶劑A:含0.05。/。TFA的水，溶劑B:含0.04%TFA的乙腈)，并使用電噴射源直接將洗脫液離子化。通過Xcalibur數據系統收集數據，并使用ProMass(Novatia，LLC,NewJersey)實施解巻積。在LC/MS分析前，抗體或藥物偶聯物(50嗎)用PNGaseF(2U/ml;PROzyme,SanLeandro,CA)于37。C處理2小時以除去N-連接的碳水化合物。96將疏水相互作用層析(HIC)樣品注射到ButylHICNPR柱(2.5pm,4.6mmx3.5cm)(TosohBioscience)上，并用0至70%B的線性梯度以0,8ml/min洗脫(A:含1.5M硫酸銨的50mM磷酸鉀pH7，B:50mM磷酸鉀pH7，20%異丙醇)。使用配備有多波長檢測儀和Chemstation軟件的Agilent1100系列HPLC系統來解析和定量具有不同藥物/抗體比率的抗體種類。實施例3:半胱氨酸改造的抗MUC16抗體與藥物4頭中間體的偶聯在實施例2的還原和再氧化規程后，將半胱氨酸改造的抗MUC16抗體溶解在PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖液中，并在冰上冷卻。將相對于每個抗體的改造的半胱氨酸約1.5個摩爾當量的帶有硫醇反應性官能團(諸如馬來酰亞胺基)的auristatin藥物接頭中間體(諸如MC-MMAE(馬來酰亞胺己酰基-單曱基auristatinE)、MC-MMAF、MC-val-cit-PAB-MMAE、或MC-va-cit-PAB-MMAF)溶解在DMSO中，在乙腈和水中稀釋，并添加至冷卻的PBS中的還原的、再氧化的抗體。約一小時后，添加過量的馬來酰亞胺以淬滅反應并給任何未反應的抗體石克醇基團加帽。通過離心超濾濃縮反應混合物，并將半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物通過穿過PBS中G25樹脂的洗脫來純化和脫鹽，在無菌條件下穿過0.2pm濾器過濾，并冷凍儲存。通過上述規程，制備了以下半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物thiohu3A5-MC-MMAF，通過偶聯A117Cthiohu3A5與MC-MMAF;thiohu3A5-MC-val-cit-PAB-MMAE,通過偶聯A117Cthiohu3A5與MC-val-cit-PAB-MMAE;thioch3A5-MC-MMAF,通過偶聯A117Cthioch3A5與MC-MMAF;和thioch3A5-MC-val-cit-PAB-MMAE,通過偶聯A117Cthioch3A5與MC-val-cit-PAB-MMAE。實施例4:體外細胞增殖測定法通過細胞增殖試驗測定抗體-藥物偶聯物的體外功效(附圖10和11)。CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay為商購的(PromegaCorp,,Madison,WI)基于鞘翅目(Co/eopfera)熒光素酶的重組表達的同質性試驗方法(homogeneousassaymethod)(US5583024;US5674713;US5700670)。該細胞增殖試驗基于對存在的ATP進行定量測定了培養物中存活細胞的數量，其97中存在的ATP為代謝活性細胞的指示劑(Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88;US6602677)。在96孔板中進行CellTiter-Gk)⑧Assay,使得它易于進行自動化高流通量篩選(HTS)(Cree等(1995)AnticancerDrugs6:398-404)。同質性試驗操作步驟包括將單一試劑(CellTiter-GloReagent)直接加入到在血清補充的培養基中培養的細胞中。同質性"添加-混合-測定"方式導致細胞裂解并且產生與存在的ATP量成比例的發光信號。底物曱蟲熒光素被重組焚火蟲熒光素酶氧化脫羧化，而同時ATP轉化成AMP并且產生光子。以相對發光單位(RLU)反映出存活細胞。通過發光計或CCD照相機成像裝置記錄數據。將發光輸出表示為在一段時間內測定的RLU。或者，可以在有閃爍劑存在下在閃爍計數器中對來自發光的光子進行計數。然后可以將光單位表示為CPS-每秒計數。通過使用下列方案的細胞增殖試驗測定ADC功效(改編自CellTiterGloLuminescentCellViabilityAssay,PromegaCorp.TechnicalBulletinTB288及Mendoza等(2002)CancerRes.62:5485-5488):1.使在培養基中含有約1000個(PC3)或3000個(OVCAR-3)細胞的50lal細胞培養物等份沉積在96孔不透明壁的平板的各孔中，所述細胞為(1)表達MUC16多肽的細胞系OVCAR-3;(2)改造成在其細胞表面上穩定表達MUC16多肽的PC3衍生的細胞系(PC3/MUC16);和(3)不表達MUC16多肽的PC3細胞系(PC3/neo)。2.將ADC(50ml)添加至一式三份的實驗孔至終濃度9000、3000、1000、333、111、37、12.4、4.1、或1.4ng/ml,"無ADC"對照孔只接受培養基，并溫育3天(PC3)或5天(OVCAR-3)。3.使平板平衡至室溫約30分鐘。4.添加CellTiter-Glo試劑(100ml)。5.將內含物在定軌振蕩器上混合2分鐘以便誘導細胞裂解。6.將平板于室溫溫育10分鐘以便穩定發光信號。7.記錄發光并作為RLU=相對發光單位在圖中報告。來自與不含ADC的培養基一起溫育的細胞的數據于0.46ng/ml繪圖。培養基PC3/neo和PC3/MUC16生長在DMEM+Ham氏F012/10。/。FBS/谷氨酰胺/250pg/mLG-418中，OVCAR-3生長在RPMI/2()o/。FBS/谷氨酰胺中。實施例5:藥動學-血清清除和穩定性通過單個靜脈內推注劑量注射入Sprague-Dawley大鼠后測量抗體或藥物偶聯物的血清濃度，分析了抗MUC16抗體-藥物偶聯物的體內部署。攜帶至少一個細胞毒性藥物的抗體-藥物偶聯物的濃度以ELISA測量，其使用MUC16胞外結構域(ECD)蛋白進行捕捉及使用抗MMAE和辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗小鼠Fc抗體進行檢測。血清中的總Ch3A5和ThioCh3A5濃度以ELISA測量，其使用MUC16ECD進行捕捉及使用抗人FcHRP進行^r測。此測定法測量任何抗MUC16抗體，有和無偶聯的MMAE均可。這些測定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀釋度1:10。這些測定法具有定量下限0.78ng/mL,最低稀釋度1:10。使用具有IV推注輸入、一階消除、和宏觀速率常數的兩隔室模型(Model8,WinNonlinProv.5.0.1,PharsightCorporation,MountainView,CA)分析了來自每只動物的血清濃度時間數據。CL(mL/天/kg)T〃2卩(天)ADC總抗體16.1±3.510.3±2,1藥物偶聯的抗體41.6士4.86.0±0.9TDC總"元體9.5±2.97.9±2.1藥物偶聯的抗體14.1±3.05.5±1.0實施例6:動物毒性通過在第l天單次注射標準ch3A5-VC-MMAE(24.19mg/kg=1934mg/m2),thioch3A5-VC-MMAE(49.99mg/kg=1934mg/m2)，和對照媒介物，在青年雌性大鼠(100-125g)中進行了12天急性毒性研究。測試項目的注射采取靜脈內推注的形式。每天測量體重。在第5天和第12天進行臨床化學、血清酶和血液學分析。毒性信號包括體重減輕的臨床觀察。降低獼猴中的嗜中性粒細胞計數要求較高劑量的thioADC。在兩項分開的研究中，在第1天和第22天給雌性中國獼猴服用標準人源化抗MUC16ADC(5.9mg/kgIgG=1200pg/m2MMAE);thioADC(12.8mg/kgIgG=1200pg/m2MMAE);thioADC(25.6mg/kgIgG=2400ng/m2MMAE);或thioADC(38.4mg/kgIgG=3600嗎/m2MMAE)。在第8天、第22天、第32天、和第43天為血液學和血清化學采集血液(第22天的值來自第二劑之前)。將平均循環嗜中性粒細胞計數相對于來自在同一研究的給定時間點用媒介物處理的大約一周，接著在三周內恢復至正常水平。實施例7:腫瘤生長抑制，體內功效小鼠模型使用雌性C.B-17SCID米色小鼠(CharlesRiverLaboratories)實施了功效研究。所有研究依照實驗動物護理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)(InstituteofLaboratoryAnimalResources,"GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals",(NIHPublication#85-23).Washington(DC):NationalAcademyPress;1996)進行。采用Chenetal.(2007)CancerRes67:4924-4932中記載的OVCAR-3乳房脂肪墊移植物功效4莫型，評估單次靜脈內給藥后的腫瘤體積。OVCAR-3乳房脂肪墊移植物模型是如下建立的，自攜帶腹膜內腫瘤的小鼠切出腫瘤，然后連續傳代入接受者小鼠的乳房脂肪墊中。當腫瘤達到約150-200mn^的體積時，將小鼠分成五組，每組十只，并如所述的那樣服藥。使用測徑器依照公式V(mm3)=0.5AX82測量腫瘤體積，其中A和B分別是長的和短的直徑。在胂瘤體積達到3000mn^之前或者在腫瘤顯示出即將形成潰病的征候時，對小鼠施以安樂死。自每個實驗組收集的數據表述為均值+SE。為了測試半胱氨酸改造的抗MUC16抗體藥物偶聯物的體內功效，將2x1(f個OVCAR-3細胞每只SCID小鼠(共110只小鼠)一次接種入乳房脂肪墊中，并容許在注射后生長14-21天。當腫瘤體積達到150-200mn^時(通常是接種后第14天至第21天)，將小鼠分成8個不同的組，每組9-10只小鼠，并測定每種小鼠中的腫瘤體積，如下組樣品劑量A媒介物(PBS)BADC緩沖液Cstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE1.5mg/kgDstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE3.0mg/kgEstdch3A5-MC-vc-PAB-MMAE6.0mg/kgFthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE1.5mg/kgGthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE3.0mg/kgHthioch3A5-MC-vc-PAB-MMAE6.0mg/kg實施例8:流式細胞術或體外研究將OVCAR-3細胞(每份樣品30，000個細胞)與人源化標準或thio抗MUC16MAb—起在1mL總體積中在冰上溫育75分鐘。抗體以PBS+1%FBS+2mMEDTA中25，50,100,200,和400ng/mL應用。此溫育后，清洗細胞，然后與藻紅蛋白標記的山羊抗人Fc二抗一起溫育(水上一'卜時)。然后清洗細胞，并通過流式細胞術分析。3x1(^個OVCAR-3細胞表達大約lx101()個供抗MUC16抗體3A5結合的位點。即使是最低的測試抗體濃度(25ng或大約lx10"個抗體)也提供相對于結合位點摩爾過量的抗體。因此，結合得到降低(通過流式細胞術來檢測)的濃度反映了抗體對MUC16的親和力。使用常規規程，通過表面等離振子共振和通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，測定了抗MUC16變體的結合親和力。權利要求1.一種半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO9-40的序列。2.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其是通過包括用半胱氨酸替換親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸殘基的過程制備的。3.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其中所述一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸殘基位于輕鏈中。4.權利要求3的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其包含選自下組的一種或多種序列EVQLCESGGGLRLSCCASGYS固SLRCEDTAVTLVTVCSASTKVTVSSCSTKGPVSAASCKGPSVWYVDGCEVHNAKGFVPCDIAVEPPVLDCGDSFFSEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12SEQIDNO:13SEQIDNO:14SEQIDNO:15SEQIDNO:16SEQIDNO:17。5.權利要求3的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體:多種序列DVQLCESGPGLSLTCCVTGYSLNSVTCEDTATTLVTVCSASTKVTVSSCSTKGPVSAASCKGPSVWYVDGCEVHNAKGFVPCDIAVEPPVLDCDGSFFSEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24SEQIDNO:25SEQIDNO:26其包含選自下組的一種或6.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其中所述一個或多個游離SLSASCGDRVTEIKRTCAAPSVTVAAPCVFIFPFIFPPCDEQLKDEQLKCGTASVVTEQDCKDSTYGLSSPCTKSFN的半胱氨酸氨基酸殘基位于重鏈中。7.權利要求6的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其包含選自下組的一種或多種序列SEQIDNO:27SEQIDNO:28SEQIDNO:29SEQIDNO:30SEQIDNO:31SEQIDNO:32SEQIDNO:338權利要求6的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其包含選自下組的一種或多種序列FLSVSCGGRVTSEQIDNO:34SEQIDNO:35SEQIDNO:36SEQIDNO:37SEQIDNO:38SEQIDNO:39SEQIDNO:409.權利要求1的半胱氨酸改造的人抗MUC16抗體，其包含重鏈序列，該重鏈序列包含EIKRTCAAPSVTVAAPCVFIFPFIFPPCDEQLKDEQLKCGTASVVTEQDCKDSTYGLSSPCTKSFNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO:l10.權利要求1的半胱氨酸改造的人抗MUC16抗體，其包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含VYACEVTHQGLSSPVTKSF做GECSEQIDNO:211.權利要求1的半胱氨酸改造的嵌合抗MUC16抗體，其包含重鏈序列，該重鏈序列包含VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQIDNO:312.權利要求1的半胱氨酸改造的嵌合抗MUC16抗體，其包含輕鏈序列，該輕鏈序列包含VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECSEQIDNO:413.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其中所述親本抗MUC16抗體選自單克隆抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、人抗體、和人源化抗體。14.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其是Fab片段。15.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其是在細菌中生成的。16.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其是在CHO細胞中生成的。17.—種測定懷疑含有MUC16蛋白的樣品中測定所述蛋白質的存在的方法，所述方法包括以下步驟將所述樣品暴露于具有一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體；并測定所述抗體對所述樣品中所述MUC16蛋白的結合，其中所述抗體對所述蛋白質的結合指示所述樣品中存在所述蛋白質。18.權利要求17的方法，其中所述細胞是卵巢癌細胞、乳腺癌細胞、肺癌細胞、或胰腺癌細胞。19.權利要求17的方法，其中所述抗體是共價附著至選自下組的標記物的熒光染料、放射性同位素、生物素、或金屬絡合配體。20.權利要求1的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，其中所述抗體是共價附著至auristatin藥物模塊的，由此抗體-藥物偶聯物得以形成。21.—種藥物配制劑，其包含結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。22.—種抗體-藥物偶聯物，其包含結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸、選自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin藥物模塊(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是經由一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p為l、2、3、或4。23.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中p為2。24.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中L具有式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中A為延伸物單元，其共價附著至所述半胱氨酸改造的抗體(Ab)的半胱氨酸石克醇；a為0或l;每個W獨立地為氨基酸單元；w為范圍為0-12的整數；Y為間隔物單元，其共價附著至所述藥物;溪塊；且y為O、l或2。25.權利要求24的抗體-藥物偶聯物化合物，其具有式:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>其中PAB為對-氨基千基氨甲酰基，且R口為選自下組的二價基(CH2)r，C3-Cs碳環基，O-(CH2)r，亞芳基，(CH2》-亞芳基，-亞芳基-(CH2)「，(CH2)r-(C3-C8碳環基)，(C3-C8碳環基)-(CH2)r，C3-C8雜環基，(CH2)「(C3-C8雜環基)，-(C3-C8雜環基)—(CH2)r-,—(CH2)rC(0)NRb(CH2)r-,—(CH2CH20)r—，-(CH2CH20)r—CH2-,-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-，-(CH2)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-,-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-,-(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2CH20)r-CH2-，和—(CH2CH20)rC(0)NRb(CH2)r—;其中Rb為H,C廣匸6烴基，苯基，或芐基;且r獨立地為范圍為l-10的整數。26.權利要求24的抗體-藥物偶聯物化合物，其中Ww為纈氨酸-瓜氨酸。27.權利要求24的抗體-藥物偶聯物化合物,其中R"為(CH2)5或(CH2)2。28.權利要求24的抗體-藥物偶聯物化合物，其具有式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>29.權利要求28的抗體-藥物偶聯物化合物，其中R"為(CH2)5或(CH2):30.權利要求24的抗體-藥物偶聯物化合物，其具有式Ab一S'OOAdo0人NH231.權利要求22的抗體藥物偶聯物，其中L為MC-val-cit-PAB或MC。32.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中L為由接頭試劑SMCC、BM(PEO)2或BM(PEO)3形成的接頭。33.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中D為MMAE,其具有結構:其中波形線指示所述接頭L的附著位點。34.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中D為MMAF，其具有結構:其中波形線指示所述接頭L的附著位點。35.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體選自單克隆抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、人抗體、和人源化抗體。36.權利要求22的抗體-藥物偶聯物化合物，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是Fab片段。37.—種抗體-藥物偶聯物化合物，其選自結構Ab—S■0OOVal-Ci卜NHAb-MC-vc-PAB-MMAFAb-MC-vc隱PAB-MMAEAb-MC-MMAF其中Val為纈氨酸；Cit為瓜氨酸；p為l、2、3、或4;且Ab為結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體。38.權利要求37的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:l。39.權利要求37的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:2。40.權利要求37的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:3。41.權利要求37的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:4。42.權利要求37的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:l和SEQIDNO:2。43.權利要求42的抗體藥物偶聯物，其中Ab包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。44.一種抗體-藥物偶聯物化合物的混合物，所述抗體-藥物偶聯物化合物包含結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸、選自SEQIDNO:9-40的序列、和auristatin藥物模塊(D)的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)，其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是經由一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D的；所述化合物具有式I:Ab-(L-D)pI其中p為l、2、3、或4,且平均藥物載荷為l-2。45.—種包含抗體-藥物偶聯物及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物配制劑，所述抗體-藥物偶聯物包含結合MUC16多肽且包含一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是共價附著至auristatin藥物模塊的。46.權利要求45的藥物配制劑，其進一步包含治療有效量的選自下組的化療齊寸來曲唑、奧沙利輛、多西他塞、5-FU、lapatinib、卡培他濱、亞葉酸、erlotinib、pertuzumab、貝4戈單抗、和吉西他濱。47.—種治療癌癥的方法，包括給患者施用包含抗體-藥物偶聯物及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物配制劑，所述抗體-藥物偶聯物包含結合MUC16多肽且具有一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是共價附著至auristatin藥物模塊的。48.權利要求47的方法，其中所述癌癥選自下組卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、和結腸癌。49.權利要求47的方法，其中給所述患者施用與所述抗體-藥物偶聯物化合物組合的化療劑，其中所述化療劑選自下組來曲唑、順鉑、卡鉑、紫杉醇、帕利他塞、奧沙利鉑、多西他塞、5-FU、亞葉酸、erlotinib、pertuzumab、貝伐單抗、lapatinib、和吉西他濱。50.—種制品，其包括包含抗體-藥物偶聯物及藥學可接受的稀釋劑、載體或賦形劑的藥物配制劑，所述抗體-藥物偶if關物包含結合MUC16多肽且具有一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體，且其中所述半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是共價附著至auristatin藥物才莫塊的；答器；和包裝插頁或標簽，其指明所述化合物可用于治療以MUC16多肽過表達為特征的癌癥。51.權利要求50的制品，其中所述癌癥是卵巢癌、前列腺癌、尿道癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、或結腸癌。52.—種制備抗體藥物偶聯物化合物的方法，所述抗體藥物偶聯物化合物包含結合MUC16多肽且具有一個或多個游離的半胱氨酸氨基酸和選自SEQIDNO:9-40的序列的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)和auristatin藥物模塊(D)，其中所述半胱氨酸改造的抗體是經由一個或多個改造的半胱氨酸氨基酸通過接頭模塊(L)附著至D的；所述化合物具有式r.Ab-(L畫D)pI其中p為l、2、3、或4;所述方法包括以下步驟(a)使所述半胱氨酸改造的抗體的改造的半胱氨酸基團與接頭試劑反應以形成抗體-接頭中間體Ab-L;并(b)使Ab-L與活化的藥物模塊D反應；由此所述抗體-藥物偶聯物化合物得以形成；或者包括以下步驟(c)使藥物模塊的親核基團與接頭試劑反應以形成藥物-接頭中間體D-L;并(d)使D-L與所述半胱氨酸改造的抗體的改造的半胱氨酸基團反應；由此所述抗體-藥物偶聯物化合物得以形成。53.權利要求52的方法，其進一步包括在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達所述半胱氨酸改造的抗體的步驟。54.權利要求53的方法，其進一步包括用還原劑處理所表達的半胱氨酸改造的抗體的步驟。55.權利要求54的方法，其中所述還原劑選自TCEP和DTT。56.權利要求55的方法，其進一步包括在用所述還原劑處理后用氧化劑處理所表達的半胱氨酸改造的抗體的步驟。57.權利要求56的方法，其中所述氧化劑選自硫酸銅、脫氫抗壞血酸、和空全文摘要半胱氨酸改造的抗MUC16抗體是通過用非交聯的反應性半胱氨酸氨基酸替換親本抗MUC16抗體的一個或多個氨基酸而改造的。提供了設計、制備、篩選、和選擇半胱氨酸改造的抗MUC16抗體的方法。經由接頭(L)給半胱氨酸改造的抗MUC16抗體(Ab)偶聯一個或多個藥物模塊(D)以形成具有式I的半胱氨酸改造的抗MUC16抗體-藥物偶聯物Ab-(L-D)p，其中p為1-4。公開了半胱氨酸改造的抗體藥物化合物和組合物的診斷和治療用途。文檔編號A61P35/00GK101687037SQ200880023024公開日2010年3月31日申請日期2008年5月7日優先權日2007年5月8日發明者威廉·馬利特,杰加思·R·朱納圖拉申請人:健泰科生物技術公司