專利名稱：：一種制備豬瘟疫苗的方法
技術領域：
：本發明屬于獸用生物制品
技術領域：
，具體涉及制備豬瘟疫苗的方法。
背景技術：
：豬瘟(ClassicalSwinefever，簡稱CSF)又稱為豬霍亂(Hogcholera)或歐洲型豬瘟(Europeanswinefever)，是一種豬只急性或超急性發熱的病毒傳染性疾病，臨床上的特征是散播迅速、發燒，解剖檢驗時可看到典型的出血病變。豬瘟可感染各種年齡的豬只，一年四季流行，發病率和死亡率均高，對豬只危害極大。本病是威脅養豬業最重要的傳染病之一。世界動物衛生組織(OIE)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，中國則定為一類烈性傳染病。許多國家和地區使用豬瘟活毒疫苗強制接種免疫，也是目前防治豬瘟的最佳方法。目前豬瘟(CSF)疫苗的生產方法有以下幾種(1)組織苗法即以豬瘟病毒(兔化弱毒株)接種家兔，然后收集家兔的脾臟和淋巴結生產豬瘟脾淋苗；(2)原代牛睪丸細胞苗法即采集初生小牛睪丸，經過EDTA-胰酶消化分散細胞，用轉瓶培養系統培養，生產細胞疫苗；(3)細胞系法用細胞系(例如ST)經過EDTA-胰酶消化分散細胞，用轉瓶培養系統培養，得到豬瘟兔化弱毒疫苗，收獲細胞病毒液，加適宜穩定劑，經冷凍真空干燥制成細胞系豬瘟活疫苗。其中組織苗法、原代牛睪丸細胞苗法普遍存在產量不高、效率低、外源病毒污染、產毒滴度不高、批間差異大等缺點；細胞系法，雖然解決了外源病毒污染問題，產毒滴度也有很大的提高，批間差異也減小了，但疫苗產量依舊不能得到很大的提高，且工藝繁瑣、效率低下，造成很大的人員浪費。
發明內容本發明要解決的技術問題是克服現有工藝存在的不足之處，提供一種潮汐式細胞微載體懸浮培養系統生產豬瘟疫苗的方法。該方法生產工藝簡單、易操作，產品病毒含量高，批間差異小，質量易控制，可顯著提高疫苗批產量和質量。為達到上述目的，本發明利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬瘟疫苗，包括下列步驟(1)培養制苗用細胞將制苗用細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐內，并將上述細胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的540倍。(2)制苗毒液的接種與繁殖將豬瘟病毒(如兔化弱毒株)制成病毒懸浮液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；每隔23日收獲病毒液，并且更換培養液，收獲次數為311次，將收獲的病毒液混合置28°C保存。(3)經檢驗合格后，將上述收獲的病毒液純化，加入適當凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬瘟活毒疫苗。制苗毒液的檢驗方法按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關規定進行檢驗。本發明方法制備制苗毒液完全符合要求，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。通過IFA法測定病毒的效價，細胞制苗毒液每1.Oml含病毒彡IO6-5TCID50；豬瘟活毒疫苗檢驗方法按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關規定進行檢驗。本發明方法是制得的豬瘟活毒疫苗完全符合要求，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。通過IFA法測定病毒的效價，疫苗病毒含量彡IO4-5TCID50/頭份。本發明方法中的制苗用細胞為可增殖豬瘟病毒的細胞系，如豬罩丸細胞系(ST)寸。本發明方法中所述的培養液最好是90%98%的MEM與2%10%的羊血清的混合液，PH值為7.07.4較好，加適量抗菌素。適宜本發明的微載體可以為具有網狀結構的纖維，如聚酯纖維等。本發明方法中細胞獲得氣體交換的方式可以通過培養液液面升降的方式實現。上述步驟(1)中，一般啟動貼附程序后4h換成細胞培養程序。所述細胞貼附程序最佳參數為up:2800mL/minholdlmin、Down:2800mL/minhold30s、設定最大換液量18000mL；細胞培養程序最佳參數為up:2000mL/minholdlmin、Down2000mL/minholdlmin、設定最大換液量18000mL。本發明方法中的微載體用量以為每500ml培養液添加5.5g微載體較好，細胞的初始接種量為23.6X107cellS/g微載體較好。本發明方法步驟2中所述接種病毒時細胞密度一般為24X108cellS/g微載體。上述步驟(2)中，一般啟動吸附程序后4h換成病毒培養程序，所述病毒吸附程序最佳參數為up:2000mL/minholdlmin、Down:2000mL/minhold30s、設定最大換液量18000mL；病毒培養程序最佳參數為up:1400mL/minholdlmin、Down1400mL/minholdlmin、設定最大換液量18000mL。本發明方法中，細胞與病毒培養溫度一般是36°C37°C，培養環境中含有2.5%5%二氧化碳。步驟(3)中所述的凍干保護劑可為為乳糖、脫脂牛奶或其它凍干保護劑。本發明方法中，生物反應器主要由載體罐、儲液罐、PH控制器、DO監測器、輸入和輸出系統組成。工作過程如下細胞貼附在載體罐中載體上生長，當儲液罐的培養液被泵入載體罐時，培養液液面上升向細胞供給養分并促進細胞新陳代謝產物的去除；當載體罐的培養液泵入儲液罐時，培養液面隨之下降，使細胞進行通風，促進呼吸，減小細胞切向壓力，無O2供應限制，無泡沫煩惱。這個重復的運動使載體上的細胞能夠得到足夠的營養和02，同時產生的代謝廢物像CO2能夠有效的被排出去，從而能夠大量的擴增細胞并增值病毒，此種技術稱之為潮汐式微載體懸浮培養技術。本發明所提供的一種以潮汐式細胞微載體懸浮培養系統生產豬瘟疫苗的方法，與傳統轉瓶傳代細胞培養技術相比，更具有以下優點1.采用本發明方法，不僅解決了脾淋苗、原代牛睪丸細胞苗普遍存在的生產效率低、外源病毒污染、產毒滴度不高的缺點，而且也解決了傳統轉瓶大規模生產時單批產量不高、批間差異大、產品質量不穩定、勞動強度大、生產成本高等問題。2.本發明方法中采用的載體為網狀的聚酯纖維，具有親水性和生物無害性，Ig載體約占15ml的空間，可提供2400cm2的貼壁面積，在同樣的空間內極大的增大了細胞的貼壁面積，增加了細胞生長的密度，細胞數可達到1.0X109以上，其效能為傳統轉瓶培養系統的數十倍，可以節省許多成本及人力。3.本發明方法制備的細胞接種量低，控制容易，且病毒感染效率高，用高滴度的抗原制造的豬瘟活疫苗可以大大提高疫苗的免疫能力，經免疫攻毒試驗結果顯示，對豬瘟強毒攻擊可100%保護，具有良好的安全性及免疫效果。4.本發明提供的方法可以全封閉生產，產品質量均一穩定，批間差異小。傳統轉瓶傳代細胞培養工藝批間質量差異大。圖1為本發明方法的工藝流程圖。具體實施例方式實施例中所使用的生物反應器為美國CESCO公司的TideCell-020型，所使用的載體為美國CESCO公司的BioNocII聚酯纖維，寬5mm，長10mm，Ig載體約占15ml的空間，提供2400cm2的貼壁面積，可提供1.OXIO9以上數量的細胞生長。實施例11病毒與細胞株用于制作豬瘟活毒疫苗的病毒是豬瘟兔化弱毒株(C株)，經過致病性測試，該弱毒株病毒不具有致病性。以對該病毒株具有良好敏感性的細胞系豬睪丸細胞系(ST)，作為制苗用細胞系，藉以感染并大量繁殖豬瘟病毒。2制備方法(1)將制苗用細胞系豬睪丸細胞系(ST)接種到加有MEM液體培養基(包括10%羊血清、0.01mol/LNaHC03>0.lmg/ml硫酸卡那霉素(kanamycinsulfate)、100，000IU青霉素G鈉鹽(PenicillinGSodium)、pH值為7.2)與BioNocII聚酯纖維的載體罐內；微載體用量為每500ml培養液添加5.5g微載體，細胞初始接種量為3.0X108cellS/g微載體。(2)于37°C、5%CO2培養環境下，細胞貼附4h，使上述制苗用細胞與微載體混合均勻，并使細胞貼附在微載體上。貼附程序參數為up:2800mL/minholdImin、Down:2800mL/minhold30s、設定最大換液量ISOOOmL;4h后切換為細胞培養程序，細胞培養程序參數為up:2000mL/minholdlmin、Down:2000mL/minholdlmin、設定最大換液量18000mL。(3)于37°C、5%CO2培養環境下，使細胞在上述微載體上生長3天，直到細胞數達到3..0X107cells/g微載體，更換新的MEM培養液并加入2%羊血清；將兔化弱毒株以MEM液體培養基(含2%羊血清)制成病毒懸浮液(接種濃度為0.2M.O.I.)，接種于上述細胞上，使其吸附到上述細胞上。病毒吸附程序參數為up:2000mL/minholdlmin.Down2000mL/minhold30s、設定最大換液量18000mL;4h后切換為病毒培養程序，病毒培養程序參數為up:1400mL/minholdlmin、Down1400mL/minholdlmin、設定最大換液量18000mLo(4)于37°C、5%CO2培養環境下繼續培養；每隔3天收獲病毒液，連續收獲11次并置于4°C保存。收獲的病毒液混合并進行以下檢驗(a)純凈性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19、20頁的相關規定進行檢驗，完全符合，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。(b)病毒含量測定將病毒用含2%羊血清細胞維持液作10倍梯度系列稀釋，從10-1到10-6。每個稀釋度接種8個孔，同時設立陰性不接毒對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養48-72h，80%丙酮固定，用免疫熒光抗體(IFA)方法測定每個稀釋度含有豬瘟病毒(CSFV)陽性細胞(綠色熒光)的孔數，根據Reed-Muench法計算病毒TCID3tl,每1.Oml含病毒≥IO6.5TCID50；(c)特異性用間接免疫熒光抗體(IFA)方法測定。將病毒接種于96孔細胞板ST細胞，每個樣品4孔，每孔200μL，同時設立陰性對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養4872h；棄去生長液，用0.01mol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌細胞3次，然后加入100μL預冷的80%丙酮溶液，4°C固定30min。然后用PBS洗滌3次；棄掉維持液，PBS洗滌3次后，每孔加入IOOyL用PBSl200稀釋的豬抗CSFV血清，37°C作用Ih；用PBS洗滌3次，每次IOmin后；加入用PBSl300稀釋的熒光標記的兔抗豬IgG的二抗(IgG-FITC)，每孔100uL，37°C作用Ih；用PBS洗滌3次，每次lOmin，在熒光顯微鏡下觀察。細胞對照孔應無特異性黃綠色熒光出現，而病毒接種細胞孔應有大量特異性黃綠色熒光出現。(5)經檢驗合格的每毫升病毒含量≥10-6.5TCID50的豬瘟病毒(兔化弱毒株)抗原原液經過離心純化后，以50%(體積比)乳糖作為穩定劑，充分搖勻后凍結真空干燥，并定量分裝，加蓋密封后儲存于4°C得到成品。同樣方法制成3批疫苗，編號分別為CSF-TO1、CSF-T02、CSF-T03。3結果病毒含量豬瘟病毒(兔化弱毒株)接種ST細胞后，收獲病毒液，共3批，分別測定病毒含量及疫苗性狀，試驗結果見表1。表1三批疫苗性狀試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>純凈性檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15、19頁的相關規定進行檢驗，完全符合，對豬安全無副作用，無細菌、霉菌及支原體。外源病毒檢驗無其它外源病毒污染，結果見表2。表2三批疫苗外源病毒檢驗結果試驗項目疫苗+豬瘟免疫血清對照_CSF-TOlCSF-T02CSF-T03陽性陰性^fflZZ無特異無特異無特異有特異無特異^性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光Tl無特異無特異無特異有特異無特異^.性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光it無特異無特異無特異有特異無特異_性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光CPE無無無//無特異無特異無特異有特異無特異性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光無特異無特異無特異有特異無特異性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光^DDU無特異無特異無特異有特異無特異腎PPV_性熒光性熒光性熒光性熒光性熒光(Vero---)傳代^r^e3Z無血凝無血凝無血凝//細胞紅^件件件1丨S細細胞性性性V^A吸“ο”無血凝無血凝無血凝附型紅細性性性試胞驗雞紅細無血凝無血凝無血凝___胞性性性BVDV牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒PRV偽狂犬病病毒PPV豬細小病毒實施例2本發明制得的豬瘟活毒疫苗與同類產品的比較試驗1.材料(1)疫苗實施例1制得的豬瘟活毒疫苗3批，批號CSF-T01、CSF-T02、CSF-T03。豬瘟活毒疫苗(以轉瓶培養系統制得)1批，批號=CSF-RBOl。(2)實驗用豬選用符合國家實驗動物標準的飼養場或定點豬場供應，8周齡斷奶易感仔豬，體重為1825kg，豬瘟抗體均為陰性(血清中和抗體)；注苗前觀察7日，每日上下午各觀測1次，挑選體溫、精神、食欲正常者使用。(3)攻毒病毒豬瘟病毒(CSFV)石門系強毒株。2.方法(1)性狀檢驗肉眼觀察疫苗物理性狀。兩組疫苗均為淡黃色海綿狀疏松團塊，無異物，易于瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，濃度均一，無異味。(2)無菌檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄15頁進行檢驗，兩組疫苗均為無細菌生長。(3)支原體檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄19頁進行檢驗，兩組疫苗均為無支原體生長。(4)特異性檢驗用間接免疫熒光抗體(IFA)方法測定。將病毒接種于96孔細胞板ST細胞，每個樣品4孔，每孔200μL，同時設立陰性對照，放入5%CO2溫箱中37°C培養4872h；棄去生長液，用O.Olmol/L的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌細胞3次，然后加入100μL預冷的80%丙酮溶液，4°C固定30min。然后用PBS洗滌3次；棄掉維持液，PBS洗滌3次后，每孔加入IOOyL用PBSl200稀釋的豬抗CSFV血清，37°C作用Ih；用PBS洗滌3次，每次IOmin后；加入用PBSl300稀釋的熒光標記的兔抗豬IgG的二抗(IgG-FITC)，每孔100yL，37°C作用Ih；用PBS洗滌3次，每次lOmin，在熒光顯微鏡下觀察。細胞對照孔應無特異性黃綠色熒光出現，而病毒接種細胞孔應有大量特異性黃綠色熒光出現。(5)外源病毒檢驗按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄20頁進行檢驗，兩組疫苗均為無外源病毒污染。(6)剩余水分測定按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄31頁進行檢驗，兩組疫苗均符合規定。(7)真空度測定按《中華人民共和國獸藥典》2005年版附錄31頁進行檢驗，兩組疫苗均符合規定。(8)安全性試驗a.100倍劑量試驗取8周齡CSF病毒抗體陰性(血清中和抗體<0.9)斷奶易感仔豬8頭，隨機分為4組，各組分別注射CSF-TO1、CSF-T02、CSF-T03批和CSF-RBOl疫苗，每頭均肌肉注射100倍劑量疫苗，連續觀察21日，同時測溫、觀察采食、呼吸等情況。b.1/100倍劑量試驗取8周齡CSF病毒抗體陰性(血清中和抗體<0.9)斷奶易感仔豬8頭，隨機分為4組，各組分別注射CSF-TO1、CSF-T02、CSF-T03批和CSF-RBOl疫苗，每頭均肌肉注射1/100倍劑量疫苗，連續觀察21日，同時測溫、觀察采食、呼吸等情況。(9)抗體檢測與攻毒保護試驗取8周齡CSF病毒抗體陰性(血清中和抗體<0.9)斷奶易感仔豬39頭，取其中36頭隨機分為4組，每組9頭，各組再細分為3群，每群3頭，第1、2、3組分別各肌肉注射CSF-TO1、CSF-T02、CSF-T03三批疫苗，第4組肌肉注射CSF-RBOl疫苗，每組第1群注射1倍劑量疫苗，第2群注射1/100倍劑量疫苗，第3群注射1/500倍劑量疫苗；剩下3頭仔豬不注射任何疫苗，以作為負對照；免疫14日后采血分離血清測定中和抗體效價，同時每頭豬以10，000最小致死量(MLD)的豬瘟石門系強毒株病毒進行攻毒試驗，連續觀察14日，測量并觀察仔豬臨床表現。3.結果(1)安全性試驗8周齡斷奶易感仔豬分別注射免疫100倍及1/100倍劑量的疫苗(CSF-T01、CSF-T02、CSF-T03)、CSF-RBOl疫苗后，仔豬無體溫升高，采食、精神狀況及生長發育情況均正常，試驗仔豬均存活。結果表明，三批實驗疫苗和CSF-RBOl疫苗對靶動物超劑量接種是安全的。結果見表3。(2)抗體檢測與攻毒保護試驗以中和試驗方法檢測疫苗免疫后的血清中和抗體，結果表明無論是CSF-TO1、CSF-T02、CSF-T03疫苗還是CSF-RBOl疫苗免疫后抗體均在2以上(除了1/500倍劑量的CSF-RBOl疫苗之外)，攻毒后均3/3保護，負對照3/3發病，結果見表4。(3)另外，比較以本發明“細胞微載體懸浮培養系統”與常用轉瓶培養系統，培養豬睪丸細胞系(ST)，以增殖豬瘟病毒，兩系統細胞培養的病毒相關比較如表5所示。表3疫苗安全性試驗結果疫苗免疫免疫免疫_劑量數量途徑___“無體溫升高，采食、精神狀101Ρ1況及生長發育情況均正常CSF-TOl1/100^2肌注無體溫升高，采食、精神狀CSFTOll/100fp2肌汪況及生長發育情況均正常無體溫升高，采食、精神狀_人對』_況及生長發育情況均正常^2主蕭顯瓶，棘、翻犬l001nL況及生長發育情況均正常CSF-T021/100戶2肌注無體溫升高，采食、精神狀CSFT02l/100fp2肌汪況及生長發育情況均正常M昭無體溫升高，采食、精神狀_Ah、、、兀況及生長發育情況均正常—無體溫升高，采食、精神狀況及生長發育情況均正常CSP-T031/100^2肌注=二二狀況及生長發育情況均正常無體溫升高，采食、精神狀_尤況及生長發育情況均正常^2鵬細臓，魏、11πL況及生長發育情況均正常PC^dda1,ο無體溫升高，采食、精神狀CSF"RB011/100^2況及生長發育情況均正常無體溫升高，采食、精神狀__尤況及生長發育情況均正常表4疫苗免疫效力試驗結果^^免疫免疫攻毒后-—力劑量數量表現免疫前攻毒前_14天3=<079283^5~CSF-TOl1/100倍3-〈0.92.13.4_1/500倍3_-<0.92.33.41倍31<0^92/735~CSF-T021/100倍3-<0.92.83.5_1/500倍3_-<0.92.33.4TS3=<0792632~CSF-T031/100倍3-〈0.92.53.4_1/500倍3_-<0.92.83.2TS31<0792Λ32~CSF-RBOl1/100倍3-<0.92.83.3_1/500倍3_+<0.91.83.4負對照-3*<0.9<0.9NA~-攻毒后未出現發燒等征狀+攻毒后出現發燒等征狀*攻毒后出現高燒征狀并死亡NA:全數死亡，無法測量表5不同培養系統增殖豬瘟病毒的相關比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>備注BioN0CII載體貼壁面積Ig=2400cm2,1個TideCell_020微載體懸浮培養系統需要加入BioNOCII載體220g。4.小結上述對比試驗結果可知，以本發明懸浮微載體細胞培養系統生產的豬瘟活毒疫苗與常用方法生產的疫苗對易感仔豬均具有良好的安全性及免疫效果，且以本發明懸浮微載體細胞培養系統生產豬瘟活毒疫苗的產量，遠大于常用轉瓶培養系統生產豬瘟疫苗的產量。雖然已經就特別具體實例及應用說明過本發明，不過諳于此技者，從本揭示可以產生附加的具體實例，及修改而不違離所主張的本發明旨意或超過本發明所主張的范圍。因此，要了解者本文的圖式及說明部份系經提出作為例子以幫助本發明的理解且不應該視為要限制其范圍。上列詳細說明系針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例并非用以限制本發明之專利范圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含于本案之專利范圍中。權利要求一種豬瘟疫苗的制備方法，利用生物反應器，以細胞微載體懸浮培養系統生產豬瘟疫苗，包括下列步驟(1)培養制苗用細胞將制苗用細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐內，并將上述細胞與微載體混合均勻，啟動貼附程序，使細胞貼附在微載體上；切換細胞培養程序，在適當培養環境下，提供上述細胞足夠的養分和適宜的氣體環境，使細胞在上述微載體上生長至接種濃度的5～40倍；(2)制苗毒液的接種與繁殖將豬瘟病毒制成病毒懸浮液，使其吸附到上述細胞上；在適當培養環境下培養病毒；每隔2～3日收獲病毒液，并且更換培養液，收獲次數為3～11次，將收獲的病毒液混合置4℃保存；(3)經檢驗合格后，將上述收獲的病毒液純化，加入適當凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬瘟活毒疫苗。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述細胞微載體懸浮培養系統為潮汐式。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中啟動貼附程序4h后切換培養程序；所述的細胞貼附程序參數為up26003000mL/minhold4590s、Down26003000mL/minhold3060s、設定最大換液量18000mL；細胞培養程序參數為up18002200mL/minhold4590s、Down18002200mL/minhold4590s、設定最大換液量18000mLo4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于步驟(2)中啟動吸附程序后4h換成病毒培養程序，所述病毒吸附程序參數為up:18002200mL/minhold4590s、Down:18002200mL/minhold3060s、設定最大換液量18000mL；病毒培養程序參數為up12001600mL/minhold4590s、Down1200~1600mL/minhold4590s、胃:l^dfi18000mLo5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述制苗用細胞為豬睪丸細胞系；培養液為90%98%MEMJn20Z010%羊血清，加適量抗菌素，pH值為7.07.4；所述微載體為聚酯纖維。6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于細胞培養溫度3637°C，培養環境中含有2.5%5%二氧化碳。7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于微載體用量為每500ml培養液添加5.5g微載體，細胞初始接種量為23.6X107cellS/g微載體。8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的接種豬瘟病毒時的細胞密度為24X108Cells/g微載體。9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)按病毒感染復數為0.011的比例接種病毒。10.根據權利要求19之一所述的方法，其特征在于所述的凍干保護劑為乳糖或脫脂牛奶。全文摘要本發明公開了一種以細胞微載體懸浮培養系統制備豬瘟(CSF)疫苗的方法，包括如下步驟(1)將制苗用細胞接種到含有培養液與微載體的載體罐中，并將上述細胞與微載體混合均勻，使細胞貼附在微載體上；(2)待細胞數增至5～40倍初始接種濃度時，以病毒感染復數(M.O.I.)為0.01～1的比例，將豬瘟病毒(兔化弱毒株)接種至細胞上，繁殖病毒；(3)將制得的病毒液混合，加入適當凍干保護劑，充分混勻后定量分裝，凍干，即得到豬瘟(CSF)疫苗。以本發明方法生產豬瘟疫苗具有培養的細胞密度高、可連續培養和病毒產量高、疫苗免疫效力高、安全性好等優點，對豬瘟強毒攻擊有完全的免疫保護作用。文檔編號A61K39/187GK101797380SQ20101010203公開日2010年8月11日申請日期2010年1月28日優先權日2010年1月28日發明者喬榮岑,習向鋒,孫進忠,張海洋,張許科,李三,王延輝,陶家權申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司